王 潔 侯敏娜 王 梅 梁 曉 楊楓玉

(1 陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,咸陽,712000; 2 陜西國際商貿學院,咸陽,712046; 3 寶雞市中醫(yī)醫(yī)院,寶雞,721001)

益母草,為唇形科植物益母草(LeonurusjaponicusHoutt)的新鮮或干燥地上部分,廣泛分布于全國各地,具有調經活血,消腫利尿之功,為婦科經產要藥[1-3]。現(xiàn)代研究表明,益母草提取物可治療隱性心肌缺血,降低血膽固醇、三酰甘油水平,降低冠心病的發(fā)病率,降低血液黏度和抗血液凝固作用,提高免疫力,抑制前列腺增生等[2-4]。含有生物堿、黃酮、多糖、萜類和揮發(fā)油等多種化學成分[3-10],而黃酮等成分均屬于酚類物質,具有獨特的“天然抗氧因子之美譽”[11-13]。故本實驗采用響應法優(yōu)化超聲提取益母草中多酚類工藝,具有以較少的實驗次數(shù)、在較短時間內能全面優(yōu)化實驗各參數(shù)等優(yōu)勢[9-14],并對其DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基、ABTS(2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)自由基體外抗氧化活性的研究,為益母草資源廣泛開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 益母草(購于陜西盛興中藥飲片廠,批號:20203203P),經我院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為Leonurusartemisia(Laur.)S.Y.Hu F),沒食子酸對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:100091-201609),DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(上海麥克林生物科技有限公司,批號:S18M11M109858),ABTS(2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)(上海麥克林生物科技有限公司,批號:C10947528),福林酚溶液(南京奧多福尼生物科技有限公司,批號:F8060),無水碳酸鈉(天津市河東區(qū)紅巖試劑廠,批號:20190302)等,所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器,型號:KH5200DE);高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器,型號:FW100型);電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興,型號:HH-2);紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器,型號:TU-1810);循環(huán)水式多用真空泵[河南省予華,型號:SHZ-D(Ⅲ)],電子分析天平(上海越平科學儀器,型號:AUY220)等。

1.2 方法

1.2.1 藥材預處理 將干燥后的益母草置于高速萬能粉碎機中粉碎,過60目篩,裝入密封性能好的玻璃瓶中,備用。

1.2.2 實驗方法 精密稱取預處理益母草粉末于錐形瓶中,加入一定濃度的乙醇適量,在超聲波功率為100 W,溫度40 ℃條件下,超聲處理數(shù)分鐘,過濾,即獲得益母草多酚提取液。

1.2.3 標準曲線制備

1.2.3.1 沒食子酸標準品的配制 準確稱取0.002 5 g沒食子酸標準品,置于25 mL容量瓶中,用純化水溶解并定容至25 mL,搖勻,即得濃度為0.1 mg/mL沒食子酸標準品溶液。

1.2.3.2 沒食子酸最大吸收波長的確定 精密移取0.1 mg/mL沒食子酸標準品溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,加入1 mL福林酚試劑和2 mL、15%碳酸鈉溶液,用純化水定容至10 mL,50 ℃恒溫水浴保溫30 min后,在波長范圍為200～800 nm內測定全波長,實驗結果為最大吸收波長在760 nm處。

1.2.3.3 多酚標準曲線的繪制 精密移取0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL,于10 mL容量瓶中,各加1 mL福林酚試劑和2 mL、15%碳酸鈉溶液,用純化水定容至刻度線,調節(jié)溫度為50 ℃的恒溫水浴鍋并恒溫保溫30 min,并按上述同樣實驗方法配置空白對照組,在760 nm處測定吸光度,以濃度C為橫坐標(x),吸光度A為縱坐標(y),繪制標準曲線。即y=12.517x+0.1287,R2=0.993 2。

圖1 標準曲線

1.2.4 多酚得率計算方法 由實驗所得的多酚標準曲方程式、公式(1)計算益母草多酚提取率Y(mg/g):

Y=C×V×D/M(1)

式中:C為多酚濃度(mg/mL);D為稀釋倍數(shù);V為提取液體積/mL;M為益母草的質量(g)。

1.2.5 單因素考察 準確稱取粉碎后的益母草5份、各5 g,置于250 mL錐形瓶中,在超聲波功率為100 W,溫度40 ℃條件下,考察乙醇濃度(20%、40%、60%、80%、100%)、料液比(30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL)和超聲時間(0 min、15 min、20 min、25 min、30 min)3個因素對益母草多酚得率的影響,以獲取最佳考察中心點。

1.2.6 響應面試驗設計 以益母草多酚得率為評價指標,設計響應面試驗,以獲得最佳提取方案?；趩我蛩貙嶒灥臄?shù)據(jù)分析上,結合Box-Behnken的設計理念,以乙醇濃度、料液比、超聲時間3個單因素作為自變量,以益母草多酚得率為響應值,設計三因素三水平的17組響應面實驗方案。見表1。

表1 因素水平表

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert 8.0.6軟件分析、整理數(shù)據(jù)。

1.2.8 抗氧化性試驗

1.2.8.1 益母草多酚對DPPH清除能力 分別配置濃度為4、6、8、10、12、14 mg/mL的益母草多酚溶液和維生素C對照溶液,移取DPPH母液2 mL和上述溶液2 mL,搖勻,暗處反應1 h,在517 nm處測定吸光度,計算DPPH清除率[11-13]。

DPPH清除率=1-(A1-A2)/A0×100%

式中:A0為2 mL DHHP溶液+2 mL最佳乙醇濃度的吸光度;A1為2 mL DPPH溶液+2 mL待測液的吸光度;A2為2 mL無水乙醇+2 mL待測液的吸光度。

1.2.8.2 益母草多酚對ABTS清除能力的測定 按照文獻[13,15],按照1.2.8.1項下溶液制備方法,在734 nm波長處測定吸光度。按上式計算清除率。

2 結果

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對多酚得率的影響 由圖2可知,當乙醇濃度為20%～40%時,隨著乙醇濃度增大,益母草總多酚得率也逐漸增加,并達到巔峰值;但是當乙醇濃度大于40%以后,隨著乙醇濃度的持續(xù)增加,多酚得率開始出現(xiàn)了降低的趨勢。益母草多酚的得率在40%時到達最大值。

圖2 乙醇濃度對多酚得率的影響

2.1.2 料液比對益母草多酚得率的影響 由圖3可知,料液比在1∶6～1∶8(g/mL)時,隨著料液比的增加益母草總多酚的得率持續(xù)上升,但在料液比為1∶8～1∶10(g/mL)時,益母草多酚的含量開始減少,直到料液比在1∶10～1∶14(g/mL)時益母草多酚得率逐漸趨于平穩(wěn),益母草多酚得率在料液比為1∶8(g/mL)時達到最高值。

圖3 料液比對多酚得率的影響

2.1.3 超聲時間對益母草多酚得率的影響 由圖4可知,超聲時間在10～15 min范圍內時,隨著超聲時間的增加,益母草多酚的得率呈現(xiàn)上升趨勢,并在超聲時間15 min時達到巔峰值;超聲時間在15～30 min范圍內時,增加超聲時間并沒有持續(xù)增加益母草多酚得率,卻使得益母草多酚得率呈現(xiàn)下降趨向,益母草多酚得率在超聲時間15 min時達到最大值。

圖4 超聲時間對多酚得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化

2.2.1 響應面設計與結果 通過Design-Expert8.0.6軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析,可以得到益母草多酚得率(Y)對乙醇濃度(A),料液比(B),超聲時間(C)的二次多元回歸方程是:

Y=+3.81+0.25A+0.050B+0.029C-0.048AB-0.25AC+0.23BC-1.04A2-0.68B2-0.37C2

見表2。

表2 試驗設計及試驗結果

2.2.2 響應面圖譜分析結果 由圖5三維圖可以看出,乙醇濃度的坡面比料液比的坡面陡峭,乙醇濃度的二次項對益母草多酚得率有明顯的影響,而料液比相對來說影響較小。由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)范圍為:乙醇濃度36%～44%,料液比為1∶7～1∶9(g/mL)。在此范圍內的益母草多酚得率最大,反之則會降低。

由圖6三維圖可以看出,超聲時間的坡面相比乙醇濃度的坡面平緩,超聲時間的二次項對益母草多酚得率的影響小于乙醇濃度。由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)范圍為:乙醇濃度36%～44%,超聲時間14～16 min。

由圖7三維圖可以看出,超聲時候的坡面相比料液比的坡面較為平緩,料液比的二次項對益母草多酚得率的影響大于超聲時間的影響。由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)范圍為:料液比1∶7～1∶9,超聲時間14～16 min。

經響應面軟件求導得出的最佳實驗方案是:乙醇濃度為42.31%,料液比為1∶8.07(g/mL),超聲時間為15.05 min,理論得率為3.82%。

2.2.3 實驗方案驗證 經綜合考慮,將實驗系數(shù)修正為乙醇濃度為42%,料液比為1∶8(g/mL),超聲時間為15 min。精密稱取益母草粉末3份各5 g,于250 mL錐形瓶中,加入42%乙醇溶液40 mL,在溫度為40 ℃,功率為100 W,超聲處理15 min,過濾,即得益母草總多酚提取溶液。測定各組吸光度值(A)。見表4。響應面軟件得出的最佳工藝得率為3.82%,經實驗驗證后的得率為3.78%,二者數(shù)據(jù)相差只有0.04%,說明此方法具有可行性,則超聲波輔助提取益母草多酚的最佳工藝為:乙醇濃度為42%,料液比為1∶8(g/mL),超聲時間為15 min。

表3 方差分析

圖5 乙醇濃度和料液比的三維圖和等高線圖

圖6 乙醇濃度和超聲時間的三維圖和等高線圖

圖7 料液比和超聲時間的三維圖和等高線圖

表4 最佳驗證數(shù)據(jù)

2.3 抗氧化實驗結果 益母草多酚和維生素C對DPPH、ABTS的清除率均隨二者在測試濃度(4～14 mg/mL)范圍內,呈正相關,且維生素C的清除率始終大于益母草多酚的清除率。圖8可知,維生素C和益母草多酚的濃度為14 mg/mL時,二者對DPPH的平均清除率分別是89.34%和75.96%,差異不明顯,說明益母草多酚對DPPH自由基有較強的清除作用;由圖9可知,維生素C和益母草多酚的濃度為14 mg/mL時,二者對ABTS的平均清除率分別是79.52%和61.81%,差異在高濃度時較為顯著,益母草多酚對ABTS自由基有一定的清除作用。

圖8 益母草多酚與維生素C對DPPH清除能力

圖9 益母草多酚與維生素C對ABTS清除能力

3 討論

植物多酚具有較強的抗氧化性,廣泛應用于食品、藥品等眾多領域。本在單因素試驗考察基礎上,利用響應面法優(yōu)化益母草中多酚提取工藝。實驗結果表明,乙醇濃度影響強于料液比和超聲時間,且他們的二次項對益母草多酚提取率的影響顯著。最佳提取工藝為:乙醇濃度為42%,料液比為1∶8(g/mL),超聲時間為15 min,益母草多酚實際得率為3.78%,與理論值相差0.04%,說明該提取工藝可行,可用于益母草中多酚提取。在抗氧化試驗中,可知益母草多酚濃度在4～16 mg/mL范圍內,對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均隨濃度增大呈上升趨勢,且均小于維生素C的,說明益母草多酚具有一定的抗氧化性。這與多酚俗稱純天然的抗氧化劑,在植物中廣泛存在,種類繁多、結構龐雜,其抗氧化機制可能是通過螯合金屬離子、清除自由基及羰基化合物等途徑抑制氧化等有關。

綜上所述,本試驗初步探索了益母草多酚的提取工藝及其抗氧化性,但對于益母草多酚的作用機制和功效仍需進一步研究與探索,對其應用潛力進行充分挖掘,為益母草資源廣泛開發(fā)、利用提供理論支撐和技術保障。

利益沖突聲明:無。