摘要：為了提高國家標準GB/T20361—2006中測定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的高效液相色譜熒光法的回收率，分析影響方法回收率和重復性的關(guān)鍵因素，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和固相萃取優(yōu)化實驗。結(jié)果表明：在最佳旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)模式下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)總時間為40min，濃縮回收率大于95%，采用混合陽離子固相萃取柱進行凈化，凈化回收率大于97%；優(yōu)化高效液相色譜熒光法的總體回收率為85.5%～92.5%，相對標準偏差為2.04%～4.88%，測定限為0.33μg/kg；對濃縮和凈化過程進行優(yōu)化后使得前處理步驟簡化，方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)化學；藥物殘留；高效液相色譜熒光法；孔雀石綠；回收率

中圖分類號：S912

文獻標志碼：A

基金項目：國家自然科學基金項目（21777089）；山東省自然科學基金項目（ZR2018PC028）

第一作者簡介：李娜（1989—），女，山東菏澤人。助理研究員，碩士，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全。Email：lina18764438826@163.com。

通信作者簡介：孫棟（1972—），女，山東棗莊人。研究員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全。Email：gaosundong@163.com。

網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址：https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1378.N.20230309.0901.002.html

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，孔雀石綠主要用于防治魚類的水霉病以及寄生蟲病［1-4］，是目前廣泛使用的治療此類疾病的高效藥物［5］；但是，由于孔雀石綠對水產(chǎn)動物的繁殖發(fā)育等具有很強的毒性，進而通過食物鏈對人類造成危害［6-9］，因此我國在2002年把孔雀石綠列入食品動物禁用藥［10］。自2012年開展農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測以來，孔雀石綠一直被列為水產(chǎn)品質(zhì)量安全重點監(jiān)管參數(shù)。目前，測定孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠的方法主要有分光光度法［11-12］、拉曼光譜法［13-14］、膠體金免疫分析法［15-16］、磁性免疫層析法［17］、高效液相色譜法（HPLC）［18-19］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）［20-22］、氣相色譜-質(zhì)譜法［23］、熒光光譜法和酶聯(lián)免疫法［24-27］等。其中，HPLC和HPLC-MS/MS應(yīng)用最為廣泛［28］。國家標準GB/T19857—2005中用到HPLC-MS/MS測定孔雀石綠，其中需要4種標準物質(zhì)，耗費財力物力較大，因此該方法被用于孔雀石綠殘留量的確證實驗。相對于GB/T19857—2005，國家標準GB/T20361—2006中的高效液相色譜熒光法（HPLCF）僅用到1種標準物質(zhì)，測定成本顯著降低，測定限仍可達到0.5μg/kg，因此HPLCF被廣泛用于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的初篩測定中。

基于測定成本考慮，對HPLCF的優(yōu)化成為本文中探究的方向。該方法存在的不足之處［29］在于：1）前處理復雜，耗時長；2）通過對比實驗得出HPLCF的總體回收率為72.5%～78.8%，相對標準偏差大于5%，回收率和精密度都不高；3）實驗過程中不能精準控制普通旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和手動凈化過柱的速度和時間。針對以上不足，本文中利用平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和全自動固相萃取儀，優(yōu)化濃縮和凈化條件，縮短測定時間，減小實驗過程中的損失、偶然誤差，以提高方法的回收率、精密度和靈敏度。

1實驗

1.1儀器與材料

MultivaporP-6型平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；GX-274型全自動固相萃取儀，華運有限公司吉爾森公司中國總代理；Waterse2695型高效液相色譜儀器，沃特斯中國有限公司；混合陽離子（DSC-MCAX）固相萃取柱，美國Sigma公司；丙磺酸（PRS）固相萃取柱，美國Agilent公司；隱色孔雀石綠標準品，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心。

1.2實驗方法

1）平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)條件優(yōu)化實驗。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入15mL乙腈和15mL二氯甲烷，定量加入隱色孔雀石綠標準溶液，使添加隱色孔雀石綠的質(zhì)量濃度為5μg/L。設(shè)定平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的水浴溫度、轉(zhuǎn)速、真空度，以回收率為主要依據(jù)選擇最優(yōu)條件。劉成文等［30］研究了溫度為35～50℃時對樣品回收率的影響，實驗結(jié)果表明，樣品回收率隨著溫度的升高而降低，但在溫度為35～40℃時樣品回收率基本無變化。本文中所用的平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)方式為平面旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為0～370r/min，實驗中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為220r/min，以保證液面控制在蒸發(fā)瓶的1/2～2/3處。綜上，本文中選擇水浴溫度40℃和轉(zhuǎn)速220r/min為定量，改變蒸發(fā)瓶內(nèi)壓力為900～120mbar（1bar=100kPa）設(shè)置5種模式，見表1。

2）全自動固相萃取優(yōu)化實驗。在1.5cm×15cm（直徑×長度，以下同）的玻璃管中，添加6mL乙腈，定量加入隱色孔雀石綠標準溶液，使隱色孔雀石綠的質(zhì)量濃度為5μg/L。全自動固相萃取流程圖見圖1所示，按全自動固相萃取模式（見表2）進行凈化。

3）樣品加標實驗。準確稱取草魚空白樣品5.00g，分別添加質(zhì)量濃度為100μg/L的標準工作液100、200μL，制得樣品中待測組分殘留量質(zhì)量比分別為2.0、4.0μg/kg的添加水平，按本文方法（按GB/T20361—2006中HPLCF進行提取、萃取，按旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)模式4進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，適量乙腈溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至1.5cm×15cm玻璃管中，液體總體積不大于6mL，按全自動固相萃取流程2（見表2）進行凈化，洗脫液氮吹后定容2mL上機測定）。與GB/T20361—2006中HPLCF進行實驗對比。

2結(jié)果與分析

2.1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)模式優(yōu)化結(jié)果

按表1設(shè)置不同模式進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，測定結(jié)果見表3。模式1為瓶內(nèi)壓力由原始壓力勻速降到120mbar；模式2設(shè)置2個壓力節(jié)點（250、200mbar）控制降壓速率，到壓力節(jié)點的時間分別為2、5min。雖然模式1、2的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)總時間均為30min，但是模式2的濃縮回收率比模式1的高8%以上。模式3瓶內(nèi)壓力到250mbar壓力節(jié)點的時間由2min延長到5min，濃縮回收率比模式2的增加了2.6%。經(jīng)分析，以上濃縮回收率的差異可能是由液體的餾出速率不同所致，具體分析如下：提取液中主要有乙腈和二氯甲烷2種溶劑，二氯甲烷的極性小于乙腈的，2種溶劑的沸點不同，在標準壓力下，乙腈的沸點為81℃，二氯甲烷為39℃，相同壓力下二氯甲烷的沸點遠低于乙腈的，因此在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的過程中，二氯甲烷先被蒸餾出來，如果蒸發(fā)瓶內(nèi)壓力降低過快，二氯甲烷的餾出速率過快，就容易造成隱色孔雀石綠隨二氯甲烷一起餾出，從而影響濃縮回收率。

進一步實驗發(fā)現(xiàn)，當旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)壓力降至約280mbar時，開始有二氯甲烷餾出，壓力降至200mbar左右時有乙腈餾出，因此設(shè)置模式4，其中260～200mbar為二氯甲烷的餾出壓力，200～120mbar為乙腈的餾出壓力，使得二氯甲烷的餾出總時間到達18min，濃縮回收率大于95%，表明適當減緩二氯甲烷的餾出速率可以提高濃縮回收率。設(shè)置模式5，繼續(xù)增加二氯甲烷的餾出總時間，實驗結(jié)果表明模式4、5的濃縮回收率無明顯差異，但模式5的總時間比模式4的延長了7min，綜合考慮濃縮回收率和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間，模式4為最佳旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)模式。

如用普通旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀代替平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，液體的餾出速率是關(guān)鍵控制參數(shù)，尤其是二氯甲烷的餾出速率，剛開始的液體餾出速率控制在每秒1滴，待瓶內(nèi)液體剩余1/2時，可以將真空度設(shè)為0.09MPa，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)總時間控制在35min左右，濃縮回收率基本保持在80%左右。與普通旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀相比，平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀全程用時40min，用時相差不多，但是濃縮回收率和精密度均顯著優(yōu)于普通旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2.2全自動固相萃取優(yōu)化實驗結(jié)果

實驗用固相萃取儀為四通道全自動固相萃取裝置，系統(tǒng)控制包含活化、上樣、轉(zhuǎn)移、混合、吹氣、淋洗、洗脫等模塊，通過設(shè)置各模塊的溶劑體積、吸液流速、過柱速率、平衡時間等參數(shù)，實現(xiàn)固相萃取的全自動化；與手動萃取相比，一方面減小手動上樣、洗脫等過程的偶然誤差，從而提高了該過程的精密度；另一方面，可以利用下班后的時間進行凈化，從而節(jié)省了人力，節(jié)約了時間。

GB/T20361—2006中HPLCF用到的是中性氧化鋁柱和PRS固相萃取柱，雖然PRS固相萃取柱對弱堿性化合物也具有良好的保留能力，但是2個萃取柱操作較為繁瑣，樣品損失率較大。DSC-MCAX固相萃取柱填料含有辛基（C8）和苯磺酸（SCX）2種固定相，雙保留機理擴大了對一系列中性、堿性、酸性和兩性離子化合物的保留。此外，氫離子（H+）作為可交換離子，針對從生物體液中分離堿性化合物而出發(fā)，具有高選擇性和極佳的樣品凈化能力。DSC-MCAX固相萃取柱和PRS固相萃取柱凈化的測定結(jié)果見表4，萃取凈化譜圖見圖2所示。

DSC-MCAX固相萃取柱代替PRS固相萃取柱按照表2進行凈化，流程1運行時間為45min，流程2運行時間為52min，流程2的凈化回收率為97.6%，顯著優(yōu)于流程1的結(jié)果。流程2與流程1主要差別在于洗脫液的體積，結(jié)果表明，洗脫液的體積為6mL時能夠洗脫完全。與PRS固相萃取柱凈化效果比較，DSC-MCAX固相萃取柱的結(jié)果優(yōu)于PRS固相萃取柱的，且全自動固相萃取裝置在相對密閉環(huán)境下進行洗脫，洗脫液流出速率較均勻，從而減小偶然誤差。

2.3樣品加標實驗測定結(jié)果

GB/T20361—2006中HPLCF與本文方法進行實驗對比的測定結(jié)果見表5。本文方法的總體回收率為85.5%～92.5%，相對標準偏差小于5%。綜上，通過對濃縮和凈化過程進行優(yōu)化，方法的總體回收率和精密度均顯著提高。

2.4標準工作曲線和測定限

用隱色孔雀石綠中間液配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0μg/L的系列標準溶液。以峰面積為縱坐標，以標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線如圖3所示，得到標準曲線方程為y=1.36×105x-1.32×104，隱色孔雀石綠的質(zhì)量濃度為0.5～50μg/L時具有良好的線性。制得一系列質(zhì)量比為0.20～0.50μg/kg等一系列添加水平的樣品，按本文方法處理及測定，以3倍信噪比（S/N）計算測定限，測定限為0.33μg/kg。

3結(jié)論

在對水產(chǎn)樣品進行前處理的過程中，不同品種的水產(chǎn)樣品體內(nèi)的脂肪、水分等因素會影響樣品的提取、濃縮和凈化等，從而影響測定的結(jié)果。本文中利用平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和全自動固相萃取儀對水產(chǎn)樣品前處理過程的濃縮和凈化條件進行優(yōu)化，從而得到如下結(jié)論：

1）控制平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空度增加速率，能夠有效控制液體餾出速率，從而使得濃縮回收率約提高15%。

2）相對于PRS固相萃取柱，本文中采用的DSC-MCAX固相萃取柱，具有較高選擇性和極佳的樣品凈化能力，凈化回收率提高9%左右。此外，使用全自動固相萃取儀進行凈化，凈化過程處于較密閉環(huán)境，過柱速率較均勻，實驗的精密度顯著提高。

3）本文方法節(jié)省了測定中的人力和時間，提高測定效率。相對于GB/T20361—2006中HPLCF，本文方法總體回收率能夠穩(wěn)定在85%以上，重復性顯著改善，相對標準偏差小于5%，能夠高效、準確地測定水產(chǎn)品中的孔雀石綠殘留量。

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（責任編輯：于海琴）