摘要：以雪茄CX-014煙葉為原料，研究了營養(yǎng)劑和接種地衣芽孢桿菌對雪茄香氣生成效率和煙葉品質的影響。結果表明，正交優(yōu)化得到營養(yǎng)劑配方為3.0%葡萄糖、0.6%谷氨酸、0.6%磷酸氫二銨。添加營養(yǎng)劑（試驗組）發(fā)酵7 d的香氣物質總含量達到635.2 μg/g，較自然發(fā)酵提高了16.4%；類胡蘿卜素轉化產物、苯丙氨酸轉化產物、棕色化反應產物分別較自然發(fā)酵提高了38.2%、159.6%和75.9%。基于試驗組接種地衣芽孢桿菌（2×108 CFU/g，優(yōu)化組）發(fā)酵7 d，與試驗組相比，其香氣物質總含量為791.6 μg/g，提高了24.6%；類胡蘿卜素轉化產物含量為63.3 μg/g，提高了45.9%；棕色化反應產物含量為25.2 μg/g，提高了27.9%。

關鍵詞：雪茄煙葉；地衣芽孢桿菌；正交優(yōu)化；營養(yǎng)劑；香氣成分

中圖分類號：TS453" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）07-0107-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.07.019 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract：CX-014 cigar leaves as raw materials were used to study the effects of nutrients and Bacillus licheniformis on the aroma components production efficiency and the quality of cigar leaves. The results showed that the nutrient formula obtained by orthogonal optimization experiments was 3.0% glucose， 0.6% glutamate and 0.6% diammonium phosphate. The total content of aroma substances fermented by 7 d with added nutrient （test group） reached 635.2 μg/g， which was 16.4% higher than that of the natural fermentation. The carotenoid transformation products， phenylalanine transformation products and brown reaction products increased by 38.2%， 159.6% and 75.9% compared with natural fermentation， respectively. Then， the test group inoculated with Bacillus licheniformis （2×108 CFU/g， optimized group） had been fermented for 7 days. Compared with the test group， the total content of aroma substances was 791.6 μg/g， which was increased by 24.6%； the content of carotenoid" transformation products （63.3 μg/g） and the brown reaction products" " （25.2 μg/g） was increased by 45.9% and 27.9%， respectively.

Key words：cigar leaves； Bacillus licheniformis； orthogonal optimization； nutrient； aroma components

在適宜溫度和濕度條件下，雪茄煙葉發(fā)酵過程中大分子物質分解形成小分子香氣物質［1］，如類胡蘿卜素降解產物法尼基丙酮、大馬士酮、巨豆三烯酮等；葉綠素降解產物新植二烯；苯丙氨酸轉化產物苯甲醇、苯乙醇、苯乙醛［2］；棕色化反應產物糠醛、糠醇等物質［3］，從而產生雪茄煙特有的品質和風味［4］。

微生物的生長代謝貫穿于雪茄煙葉發(fā)酵過程，添加特定微生物可提高煙葉品質［5］，如李寧等［6］篩選添加蠟樣芽孢桿菌降低了煙葉含氮化合物含量，減少了刺激性；胡希［7］添加短小芽孢桿菌降低了雪茄煙葉中的青雜氣，香氣更加醇厚飽滿；鄭小嘎等［8］利用真菌制作成菌劑處理煙絲提高了香氣濃度和香氣質量。楊培香等［9］將枯草芽孢桿菌添加到煙絲中，提高了煙葉的糖氮比，抽吸口感更加細膩。

晾曬期雪茄煙葉內營養(yǎng)物質（如碳水化合物、蛋白質等）開始轉化［10］，但晾曬后煙葉存在酸堿不平衡等問題，使雪茄吃味辛辣、口感苦澀［11］。另外，其糖氮比低也不利于微生物的生長代謝［12］。而添加適宜的營養(yǎng)劑可以改善這一矛盾，如加入獼猴桃添加劑，可以提高雪茄吃味品質、豐富香氣［13］；添加牛奶浸提液提高了類胡蘿卜素轉化效率［14］；噴灑水溶冬青膠加強了雪茄煙葉木香特征［15］；添加菊花浸提液提高了中性香氣物質含量，余味醇凈、甜感改善［16］。由于雪茄煙葉發(fā)酵過程成分轉化存在復雜性和不確定性，而添加不同來源的營養(yǎng)物（呈香有機物質提取液等）成分復雜，何種成分最優(yōu)未知，因而難以保障煙葉發(fā)酵品質的穩(wěn)定性。

作為雪茄煙葉表面優(yōu)勢菌群，地衣芽孢桿菌能夠產生多種活性酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。本研究以恩施CX-014雪茄煙葉為原料，通過正交優(yōu)化得到成分簡單、明確的營養(yǎng)劑配方，并接種地衣芽孢桿菌進行發(fā)酵，顯著提高了蛋白質降解產物參與的棕色化反應效率，促進了雪茄煙葉致香成分或小分子香氣物質的轉化，為中式雪茄煙葉特色發(fā)酵提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）由實驗室保藏（從恩施煙葉表面篩選菌株）；CX-014雪茄煙葉為湖北省煙草科學研究院提供；葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二銨、氯化鈉、二氯甲烷，國藥集團上海有限公司。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

儀器：HNHWS-11-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器股份有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；7890GC-5973MS型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 正交試驗設計 以葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二銨添加量為優(yōu)化因素，以雪茄煙葉發(fā)酵后揮發(fā)性香氣物質及棕色化反應產物含量為指標，采用三因素四水平正交設計（表1），確定最佳發(fā)酵營養(yǎng)劑組合。

1.2.2 雪茄煙葉發(fā)酵方法 參考覃明娟等［17］的方法，將晾制完畢的雪茄煙葉回潮至適當水分后切絲，按照正交試驗設計的組別，將不同濃度組合的營養(yǎng)物質加入無菌水充分溶解制成營養(yǎng)液，并均勻噴灑在煙絲上，等到水分平衡后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，37 ℃、80% RH發(fā)酵14 d。

1.2.3 雪茄煙葉的地衣芽孢桿菌發(fā)酵 地衣芽孢桿菌液體擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數生長后期，將培養(yǎng)物經過離心、清洗等步驟獲得菌體。將菌體與正交最優(yōu)配方組合混合，加入適量無菌水充分溶解制成接種液，將接種液均勻噴灑在煙絲上，等到水分平衡后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，37 ℃、80% RH進行發(fā)酵，5、7、9、11、14 d取樣，接種量2×108 CFU/g。同時考察基礎組接種等量地衣芽孢桿菌對煙葉醇化的影響。

1.2.4 樣品處理 將發(fā)酵結束后的煙絲烘干，用粉碎機粉碎后過40目篩，過篩后的樣品4 ℃密封保存。

1.2.5 煙葉中揮發(fā)性香氣成分提取與測定 稱取10 g磨碎后的煙末置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入飽和食鹽水200 mL，同時將60 mL二氯甲烷置于100 mL圓底燒瓶中，分別連接在SDE裝置左右兩側。有機相（二氯甲烷）使用55 ℃水浴加熱，水相使用160 ℃油浴加熱。待同時蒸餾萃取裝置達到液液分層后，繼續(xù)反應5 h，收集萃取液。使用旋轉蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至2 mL，加入1.202 8 mg/mL乙酸苯乙酯（50 μL）作為內標。加入無水硫酸鈉干燥后，使用0.22 μm微孔有機濾膜過濾后放入Agilent進樣瓶備用。

內標溶液的配制。準確稱取乙酸苯乙酯內標0.300 7 g于250 mL容量瓶中，使用二氯甲烷定容，4 ℃冷藏備用。

GC條件。色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，然后10 ℃/min升至280 ℃；載氣（He）流速：1 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1。

質譜條件。電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；質量掃描范圍：35～550 m/z。

1.3 數據處理

試驗數據為3組平行試驗均值，采用SPSS 26和Excel軟件進行數據分析，并用Origin 2019b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果及分析

為提升煙葉香氣整體含量，研究基于雪茄煙葉營養(yǎng)成分特征發(fā)酵對特定香氣產物的影響，按照L16（43）的設計完成正交試驗，記錄每個組合發(fā)酵14 d萃取后的棕色化反應產物含量及總致香物質含量，結果見表2?？傁銡馕镔|總含量方差分析不顯著，棕色化反應產物方差分析結果見表3。

由表2可知，試驗濃度范圍內，影響棕色化反應產物與香氣物質總含量的3個因素主次順序均為磷酸氫二銨添加量、葡萄糖添加量、谷氨酸添加量，綜合考慮棕色化反應產物與香氣物質總含量以及添加營養(yǎng)物質的成本因素，選取營養(yǎng)劑最優(yōu)組合為A4B1C4（葡萄糖3.0%、谷氨酸0.6%，磷酸氫二銨0.6%），這也驗證了煙葉營養(yǎng)成分種類及含量對雪茄發(fā)酵香氣生成有著重要影響這一論述［18］。由表3可知，磷酸氫二銨添加量與葡萄糖添加量對棕色化反應產物具有極顯著影響，而谷氨酸添加量對棕色化反應產物具有顯著影響。

正交試驗同時平行進行了自然發(fā)酵對照試驗，煙葉自然發(fā)酵與最優(yōu)組合（正交表13號）發(fā)酵14 d后主要4類香氣成分及含量如表4所示。

最優(yōu)組合（正交表13號）發(fā)酵14 d香氣物質總含量為451.1 μg/g，較自然發(fā)酵提高了56.1%。其中新植二烯含量最高，達到了270.1 μg/g，占香氣物質總含量的59.9 %。棕色化反應產物和類胡蘿卜素轉化產物含量分別為6.8 μg/g和32.8 μg/g，分別較自然發(fā)酵提高了21.7倍和36.1%。同時，苯丙氨酸轉化產物與西柏烷類降解產物含量也均比自然發(fā)酵提高了2.1倍和72.8%。

因而確定A4B1C4為優(yōu)化營養(yǎng)劑配方進行下一步的雪茄煙葉發(fā)酵試驗。

2.2 添加營養(yǎng)劑（試驗組）及地衣芽孢桿菌（優(yōu)化組）對煙葉發(fā)酵產香的影響

基礎組（不添加營養(yǎng)劑和微生物進行發(fā)酵）、試驗組（添加營養(yǎng)劑進行發(fā)酵）和優(yōu)化組（添加營養(yǎng)劑和地衣芽孢桿菌進行發(fā)酵）發(fā)酵14 d過程中，煙葉發(fā)酵后共測得30種香氣物質，其中苯丙氨酸轉化產物3種，棕色化反應產物8種，類胡蘿卜素轉化產物7種，西柏烷類降解產物1種，其他中性致香物質11種。香氣成分含量從高到低依次是新植二烯（含量最高，占比45%～60%）、植物醇、茄酮和巨豆三烯酮。

2.2.1 不同處理煙葉發(fā)酵后香氣總含量差異 由圖1可知，發(fā)酵周期內各處理組香氣總含量均呈先上升后下降的趨勢?；A組發(fā)酵5 d香氣物質總含量為490.8 μg/g，于發(fā)酵7 d達到峰值（544.9 μg/g，增長11.0%），隨后下降至發(fā)酵14 d的293.3 μg/g，較峰值降低了46.2%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d香氣總含量分別為510.8 μg/g與538.1 μg/g，高于基礎組4%和10%。兩組香氣總含量也于發(fā)酵7 d達到峰值，分別為632.5 μg/g和780.9 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了23.8%與45.1%，也比基礎組峰值提高了16.1%與43.3%。

發(fā)酵周期內，各處理組香氣物質總含量積累與降解變化規(guī)律一致，發(fā)酵7 d（峰值）與發(fā)酵14 d（最低值）均可以真實反映試驗結果的差異，也可以評價發(fā)酵周期內3組試驗對煙葉香氣生成效率的影響。

2.2.2 不同處理煙葉發(fā)酵后對苯丙氨酸轉化產物的影響 苯丙氨酸轉化產物（如苯乙醇和苯甲醇）具有花香和甜香［19］，對煙葉的呈香有著重要影響。由圖2可知，各處理組苯丙氨酸轉化產物含量均呈先上升后下降的趨勢?；A組發(fā)酵5 d苯丙氨酸轉化產物含量為4.6 μg/g，發(fā)酵9 d達到峰值（9.7 μg/g），增長110.9%，隨后其含量下降至發(fā)酵14 d的3.1 μg/g，較峰值降低了68.0%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d苯丙氨酸轉化產物含量分別為8.4 μg/g與9.9 μg/g，高于基礎組82.6%和115.2%。不同于基礎組，試驗組與優(yōu)化組含量于發(fā)酵7 d達到峰值，分別為13.5 μg/g和14.7 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了60.7%與48.5%，也比基礎組峰值提高了39.2%與51.5%。

2.2.3 不同處理煙葉發(fā)酵后對類胡蘿卜素轉化產物的影響 類胡蘿卜素降解產物可提高煙葉中性香氣物質的含量［20］，增加煙葉中花香、木香等特征［21］。由圖3可知，各處理組的類胡蘿卜素轉化產物含量均呈先上升后下降的趨勢。基礎組發(fā)酵5 d類胡蘿卜素轉化產物含量為19.5 μg/g，發(fā)酵9 d達到峰值（35.1 μg/g），增長80.0%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d類胡蘿卜素轉化產物含量分別為31.7 μg/g與32.2 μg/g，高于基礎組62.6%和65.1%。不同于基礎組，試驗組與優(yōu)化組含量于發(fā)酵7 d達到峰值，分別為43.4 μg/g和63.3 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了36.9%與96.6%，其含量為基礎組峰值的1.2倍與1.8倍。

2.2.4 不同處理煙葉對西柏烷類降解產物的影響 西柏烷類降解產物茄酮本身具有甜香，可以使煙氣更加溫和，提升甜感［16］。由圖4可知，各處理組的西柏烷類降解產物含量均呈先上升后下降的趨勢。基礎組發(fā)酵5 d西柏烷類降解產物含量為18.1 μg/g，發(fā)酵9 d達到峰值（24.6 μg/g），增長35.9 %。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d西柏烷類降解產物含量分別為21.3 μg/g與24.4 μg/g，高于基礎組17.7%和34.8%。不同于基礎組，試驗組與優(yōu)化組含量于發(fā)酵7 d達到峰值，分別為28.2 μg/g和37.9 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了32.4%與55.3%，含量為基礎組峰值的1.1倍與1.5倍。

2.2.5 不同處理煙葉發(fā)酵后對棕色化反應產物的影響 棕色化反應是煙草中生成香氣物質的重要反應，主要是由氨基化合物與水溶性糖等化合物之間發(fā)生的非酶棕色化反應，可以賦予煙草堅果、焦糖等香氣［4］。由圖5可知，各處理組的棕色化反應產物含量均呈先上升后下降的趨勢?；A組發(fā)酵5 d棕色化反應產物含量為4.3 μg/g，發(fā)酵7 d達到峰值（11.2 μg/g），增長160.5%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d棕色化反應產物含量分別為7.3 μg/g與8.8 μg/g，高于基礎組69.8%和104.7%。兩組含量也于發(fā)酵7 d達到峰值，分別為19.7 μg/g和25.2 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了169.9%與186.4%，含量為基礎組峰值的1.8倍與2.3倍。

2.3 最佳發(fā)酵周期下各處理組香氣物質含量

由上述內容可知，試驗組與優(yōu)化組香氣總含量均高于基礎組，且各類香氣物質均在7 d達到峰值，確定試驗條件下最佳醇化周期為7 d。為確定營養(yǎng)劑及地衣芽孢桿菌對雪茄煙葉香氣的影響，在37 ℃、80% RH發(fā)酵7 d并比較了試驗組（基礎組+營養(yǎng)劑）和基礎組+地衣芽孢桿菌發(fā)酵后的香氣含量差異，如表5所示。

由表5可知，基礎組接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵后香氣物質總含量為628.8 μg/g，較基礎組提高了15.2%。與其他處理組一致，其中含量最高物質為新植二烯，含量340.7 μg/g，較基礎組提高了20.9%。同時，基礎組接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵后棕色化反應產物與苯丙氨酸轉化產物含量為14.2 μg/g與15.6 μg/g，是基礎組含量的1.3倍與3.0倍。類胡蘿卜素轉化產物含量與西柏烷類降解產物含量分別為57.6 μg/g與37.9 μg/g，較基礎組分別提高了83.4%與86.7%。

此外，基礎組接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵后香氣總含量略低于試驗組（635.2 μg/g）。其苯丙氨酸轉化產物、類胡蘿卜素轉化產物與西柏烷類降解產物與新植二烯含量較試驗組分別提高了15.6%、32.7%、34.4%、6.3%。但棕色化反應產物與植物醇含量較試驗組分別降低了27.9%與23.0%。

基礎組接種地衣芽孢桿菌與試驗組各類香氣物質含量均高于基礎組，即添加營養(yǎng)成分與接種微生物均可以提高發(fā)酵后煙葉香氣物質的含量。同時，優(yōu)化組中棕色化反應產物、類胡蘿卜素轉化產物、新植二烯、植物醇及香氣物質總含量明顯優(yōu)于上述兩組，說明營養(yǎng)劑與添加地衣芽孢桿菌的效能有疊加作用，能夠更好地豐富煙葉的香氣量，提高煙葉品質。

3 結論

國產雪茄原料存在理化成分不協調（糖氮比低），缺乏濃郁的特征香氣等問題，利用外源物料提升煙葉的品質可以在一定程度上彌補以上不足。但外源營養(yǎng)物成分復雜，影響其提高發(fā)酵品質作用的穩(wěn)定性。本研究以雪茄CX-014煙葉為原料，研究了營養(yǎng)劑和接種地衣芽孢桿菌對雪茄香氣成分生成效率和煙葉品質的影響。通過正交設計優(yōu)化得到成分簡單的營養(yǎng)劑配方，添加營養(yǎng)劑后（試驗組）發(fā)酵，香氣物質總含量達到635.2 μg/g，較基礎組提高了16.4%?；谠囼灲M接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵，顯著提高了香氣物質總含量（791.6 μg/g），較試驗組提高24.6%，香氣成分間更加協調，煙葉品質得到改善，為中式雪茄發(fā)酵技術提供了重要參考。

參考文獻：

［1］ 于少藤， 毛淑蕊， 胡安妥， 等. 改善煙葉品質微生物的篩選及其作用效果研究［J］. 南京農業(yè)大學學報， 2021， 44（4）： 766-777.

［2］ 于 航， 劉硯婷， 尚夢琦， 等. 基于致香成分分析的雪茄煙產地間差異［J］. 煙草科技， 2021， 54（9）： 58-71.

［3］ 楊樹勛. 煙草酶促棕色化反應機理及其調控研究進展［J］. 作物研究， 2019， 33（3）： 246-250.

［4］ 郭文龍， 丁松爽， 劉路路， 等. 翻堆對初次發(fā)酵過程中雪茄茄芯煙葉質量變化的影響［J］. 南方農業(yè)學報，2021，52（2）： 365-373.

［5］ 周家喜， 喻理飛， 張 健， 等. 煙葉陳化過程細菌群落演替特征［J］. 生態(tài)學報， 2018， 38（21）： 7739-7748.

［6］ 李 寧， 汪長國， 曾代龍， 等. 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）篩選鑒定及在雪茄煙葉發(fā)酵中的應用研究［J］. 中國煙草學報， 2012， 18（2）： 65-69.

［7］ 胡 希. 微生物降解雪茄煙堿含量的研究［J］. 陜西農業(yè)科學， 2014， 60（8）： 24-25，33.

［8］ 鄭小嘎， 劉 萍， 張修國. 煙葉人工發(fā)酵過程中增香途徑的研究進展［J］. 山東農業(yè)大學學報（自然科學版），2003，34（1）：144-147.

［9］ 楊培香， 李青青， 焦 俊， 等. 枯草芽孢桿菌Van3菌株提高煙絲品質的研究［J］. 云南農業(yè)大學學報（自然科學），2015，30（1）： 50-57.

［10］ 盧紹浩，張嘉雯， 趙 喆， 等. 不同部位雪茄煙葉晾制過程中多酚、色素及相關酶活性的變化［J］. 中國煙草科學，2019，40（3）： 84-90，98.

［11］ 王紅霞， 邱建華， 周 浩， 等. 一種利用微生物菌群發(fā)酵處理雪茄煙葉的方法［P］. 中國專利：CN110122920A，2019-08-16.

［12］ LIU F， WU Z Y， ZHANG X P， et al. Microbial community and metabolic function analysis of cigar tobacco leaves during fermentation［J］. Microbiologyopen， 2021， 10（2）： e1171.

［13］ 胡 希，雷金山，楊 軍，等. 雪茄煙葉添加劑及其生產方法［P］. 中國專利：CN103070475B，2015-05-20.

［14］ 李 凌， 章存勇. 不同物料處理對雪茄煙葉發(fā)酵后香氣成分和抽吸質量的影響［J］. 南方農業(yè)， 2016， 10（3）： 254-256.

［15］ 曾代龍， 雷金山， 曾顯貴. 雪茄煙葉的醇化方法［P］.中國專利：CN101125028A，2008-02-20.

［16］ 徐世杰. 雪茄茄衣人工發(fā)酵過程中的質量變化規(guī)律及添加物料對其品質的影響［D］.鄭州：河南農業(yè)大學， 2016.

［17］ 覃明娟， 陳森林， 趙強忠， 等. 植物乳桿菌在改善各產區(qū)煙葉品質中的應用［J］. 食品與機械， 2020， 36（5）： 199-204，226.

［18］ 牛 浩， 周中宇， 白金瑩， 等. 雪茄煙發(fā)酵的研究進展［J］. 湖南文理學院學報（自然科學版）， 2020， 32（4）： 60-63，68.

［19］ 楊永霞， 張嘉煒， 賈宏昉， 等. 成熟期溫度對煙葉質體色素積累及香氣成分的影響［J］. 煙草科技， 2016， 49（5）： 16-22.

［20］ 胡志忠， 姜 宇， 龍章德， 等. 利用產香酵母發(fā)酵技術改善煙葉品質［J］. 食品與機械， 2018， 34（11）： 200-204.

［21］ 高 森， 高洋洋， 付小洲， 等. 什邡、涼山產區(qū)生產GH1、GH2雪茄煙化學成分對比分析［J］. 農產品加工， 2021（7）： 51-54.