【摘要】目的 檢驗(yàn)乳腺癌切片CD8⁺T細(xì)胞的表達(dá)水平，探討腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）與乳腺癌患者病理特征之間的關(guān)聯(lián)。方法 選取2020年10月至2022年10月隴南市第一人民醫(yī)院收治的84例乳腺癌確診患者為研究對(duì)象，所有患者均順利完成手術(shù)治療，且術(shù)后石蠟標(biāo)本保存完好。采用免疫組化法檢測乳腺癌切片中CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)情況，對(duì)切片進(jìn)行伊紅染色（HE）法并檢測TIL水平，分析CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)水平、TIL檢測結(jié)果與患者病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 TIL高水平、低水平患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、人表皮生長因子受體2（HER-2）受體陽性等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Pgt;0.05），CD8⁺T陽性與CD8⁺T陰性患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。經(jīng)Logistic回歸分析，CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)水平與乳腺癌患者的腫瘤分化程度、TNM分期之間存在關(guān)聯(lián)（均Plt;0.05）。結(jié)論 TIL檢測結(jié)果與乳腺癌病理特征間無明顯相關(guān)性，但乳腺癌切片中CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)情況與TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān)，臨床應(yīng)予以關(guān)注。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；CD8+T細(xì)胞；腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞；病理特征

中圖分類號(hào)：R737.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2096-2665.2023.14.0.03

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.14.032

乳腺癌是威脅我國女性健康的主要惡性腫瘤之一，疾病負(fù)擔(dān)依然日益加重[1]。根據(jù)《中國腫瘤登記年報(bào)》數(shù)據(jù)，城市發(fā)病率變化趨勢平穩(wěn)，農(nóng)村發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[2]。針對(duì)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，既往研究多關(guān)注腫瘤細(xì)胞，主要側(cè)重圍繞基因及其表達(dá)蛋白的改變等問題進(jìn)行分析。而在對(duì)乳腺癌患者腫瘤微環(huán)境進(jìn)行評(píng)估時(shí)發(fā)現(xiàn)，局部免疫微環(huán)境改變可能與腫瘤發(fā)病、進(jìn)展之間存在關(guān)聯(lián)[3]。任莉莉等[4]指出，乳腺癌患者體內(nèi)腫瘤免疫微環(huán)境存在不同程度異質(zhì)性，應(yīng)用腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）進(jìn)行過繼細(xì)胞治療是可能受異質(zhì)性與免疫抑制等因素的影響。本研究對(duì)乳腺癌切片CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并就TIL與乳腺癌病理特征之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年10月至2022年10月隴南市第一人民醫(yī)院收治的84例乳腺癌患者為研究對(duì)象。本研究經(jīng)隴南市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)理論委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合乳腺癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)病理診斷證實(shí)；②順利完成手術(shù)治療（根治術(shù)/改良根治術(shù)）；③術(shù)后石蠟標(biāo)本保存完好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①確診時(shí)有轉(zhuǎn)移性腫瘤；②確診時(shí)患有其他腫瘤；③臨床資料不完整。

1.2 檢驗(yàn)方法

1.2.1 伊紅染色法檢測與TIL判讀 伊紅染色（HE）法檢測步驟：①防脫片處理，取出乳腺癌標(biāo)本（經(jīng)固定、石蠟包埋），利用切片機(jī)（德國Leica，型號(hào)：LEICA RM2135）進(jìn)行切片，厚度約4～6 μm；②進(jìn)行粘片處理，確保切片展開，吸出多余水分，計(jì)數(shù)編號(hào)后備用；③常規(guī)脫蠟，置于蘇木素中染色1 min，磷酸緩沖液（PBS）定色，蒸餾水過洗后置入伊紅染液中約0.5 min，蒸餾水沖洗；④置入1%鹽酸乙醇液中褪色，再放入蒸餾水中漂洗，至恢復(fù)藍(lán)色；⑤置于50%、70%、80%梯度酒精中脫水，0.5%伊紅染液染色；⑥95%酒精洗去多余紅色，置于無水乙醇中3～5 min，濾紙吸去多余酒精，置于純二甲苯中3～5 min，中性樹膠封存。TIL判讀參考《腫瘤學(xué)年鑒雜志》標(biāo)準(zhǔn)[6]，根據(jù)顯微鏡視野中TIL占比將結(jié)果分為高水平（≥40%）與低水平（lt;40%）。

1.2.2 CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平檢測 采用免疫組化法檢測，所用抗體、試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，檢測步驟：①防脫片、切片、粘片等操作同上；②將載玻片置于65 ℃環(huán)境下烘烤約2 h，常規(guī)脫蠟；③選用EDTA（pH值=9.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，高壓修復(fù)2.5 min后，自然冷卻，直至恢復(fù)至室溫后滴加適量0.3% H2O2溶液，放置10 min；④每張玻片滴加1滴3% H2O2溶液，37 ℃孵育，15 min后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，3 min/次，標(biāo)記組織位置并滴入1滴10%羊血清，37 ℃孵育1 h；⑤以抗原稀釋液1：500稀釋后滴加抗體，每個(gè)玻片抗體量約60 μL，置入4 ℃冰箱放置一夜，取出后37 ℃復(fù)溫1 h；⑥D(zhuǎn)AB顯色（B-DAB與A-DAB底物緩沖液的混合比例為1∶20），蘇木素復(fù)染30～60 s，經(jīng)分色、返藍(lán)后，用流水沖洗干凈；⑦經(jīng)脫水、透明后封片，除去玻片表面多余的液體，并加入適量水溶性封片劑，45～55 ℃環(huán)境下烘干，直至凝固。免疫組化結(jié)果判定采用半定量積分法：①隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，統(tǒng)計(jì)1 000個(gè)TIL中CD8+細(xì)胞數(shù)，并按占比lt;5%、5%～25%、gt;25%～50%、gt;50%～75%、gt;75%分別計(jì)0～4分；②染色強(qiáng)度按淡黃色、黃色、棕黃色分別計(jì)1～3分；③細(xì)胞數(shù)計(jì)分×染色強(qiáng)度計(jì)分≤1為陰性，否則為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用（x±s）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[例（%）]表示，用χ2檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 84例患者一般病理資料 本組患者一般病理資料見表1。

2.2 不同TIL結(jié)果患者臨床病理特征比較 對(duì)TIL高水平、低水平患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2受體情況進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Pgt;0.05），見表2。

2.3 CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)水平與臨床病理關(guān)系 單因素分析發(fā)現(xiàn)，CD8⁺T陽性與CD8⁺T陰性患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表3。將3項(xiàng)指標(biāo)作為自變量，按表4進(jìn)行賦值，納入Logistic回歸模型中分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)水平與乳腺癌患者的腫瘤分化程度、TNM分期之間存在關(guān)聯(lián)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表5。

3 討論

腫瘤細(xì)胞周圍的免疫微環(huán)境改變，是目前乳腺癌學(xué)術(shù)研究與臨床治療決策的重點(diǎn)。根據(jù)既往報(bào)道[7-8]，乳腺癌患者普遍存在TIL檢測結(jié)果異常，TIL計(jì)數(shù)的變化可能與多種乳腺癌類型患者的預(yù)后有關(guān)。從此類研究掌握的證據(jù)看，TIL計(jì)數(shù)水平在反映惡性腫瘤周圍免疫反應(yīng)、控制惡性腫瘤發(fā)展等方面有重要作用。TIL包含多個(gè)淋巴細(xì)胞亞群，以T淋巴細(xì)胞為主要表型。CD8⁺T細(xì)胞是介導(dǎo)腫瘤編輯過程的重要角色，在接觸抗原后，可與腫瘤上對(duì)應(yīng)受體發(fā)生相互作用，或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)腫瘤的清除。本研究對(duì)TIL總體浸潤情況及CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)水平與乳腺癌患者病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析，考慮不同分子分型T細(xì)胞表達(dá)水平的差異性可能影響結(jié)果的判斷，故主要選擇浸潤性乳腺癌患者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIL檢測結(jié)果與病理特征的相關(guān)性不強(qiáng)，而CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)與TNM分期、腫瘤分化程度間呈現(xiàn)出較好相關(guān)性。

本研究中，按TIL檢測結(jié)果將患者分為高水平組與低水平組，比較兩組病理特征發(fā)現(xiàn)，TNM分期、腫瘤大小及分化程度等特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），提示TIL總體浸潤程度不能很好地反映腫瘤組織的特征。分析其原因，可能與TIL中各種淋巴細(xì)胞的作用不同有關(guān)。作為一類有特殊功能的細(xì)胞，TIL內(nèi)有較廣泛的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等分布，各細(xì)胞之間可能存在正負(fù)效應(yīng)，從整體進(jìn)行浸潤程度評(píng)估，難以獲得各種細(xì)胞表達(dá)的變化，故其反映病理特征及預(yù)后的準(zhǔn)確度可能較差。而本研究僅基于已有的石蠟標(biāo)本以及單次檢測結(jié)果進(jìn)行分析，且納入研究的樣本較少，總體TIL浸潤程度是否與病理特征存在關(guān)聯(lián)，后續(xù)仍需通過大樣本試驗(yàn)做進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，從預(yù)后評(píng)估角度考慮，將TIL濃度評(píng)估視作連續(xù)變量，納入乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估體系，可能對(duì)今后乳腺癌的防治有良好的指導(dǎo)價(jià)值。

本研究選取CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與陰性組相比，陽性組患者的腫瘤分化程度更傾向于高分化、中分化，TNM分期主要為Ⅰ～Ⅱ期，腫瘤≥2cm者占比較低。經(jīng)Logistic分析，CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)可能與腫瘤分化程度、TNM分期之間存在關(guān)系。分析其原因，可能與CD8⁺T淋巴細(xì)胞的毒性作用、宿主抑制腫瘤反應(yīng)水平等有關(guān)。CD8⁺T淋巴細(xì)胞具有直接殺傷惡性腫瘤的能力，在免疫反應(yīng)中，可特異性識(shí)別抗原肽組織，接到宿主殺死、清除惡性腫瘤，CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)檢測呈陽性，可能提示局部免疫微環(huán)境的變化較小，T淋巴細(xì)胞能夠有效介導(dǎo)宿主清除腫瘤組織，避免病情的進(jìn)一步惡化。除CD8⁺T細(xì)胞，TIL與乳腺癌患者病理特征的關(guān)聯(lián)，還應(yīng)考慮其他細(xì)胞類型以及各類細(xì)胞之間的調(diào)控機(jī)制等，如CD4⁺T細(xì)胞具有的輔助作用，從免疫微環(huán)境改變角度考慮，圍繞不同免疫調(diào)節(jié)水平、免疫功能差異等在惡性腫瘤發(fā)展中的影響進(jìn)行分析，明確T細(xì)胞表達(dá)、TIL浸潤程度與病理特征之間的關(guān)系，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

綜上所述，總體TIL浸潤程度與乳腺癌患者的病理特征之間缺乏顯著相關(guān)性，考慮TIL內(nèi)不同細(xì)胞的正負(fù)效應(yīng)可能對(duì)TIL檢測結(jié)果的指導(dǎo)價(jià)值產(chǎn)生影響，而CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)情況與TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān)，可通過CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)檢測，評(píng)估乳腺癌患者的病情嚴(yán)重程度或預(yù)測腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]陳萬青， 鄭榮壽. 中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J]. 中國腫瘤臨床， 2015， 42（13）： 668-674.

[2]何明艷， 朱碧琪， 鐘媛， 等. 2005-2013年中國女性乳腺癌發(fā)病及死亡趨勢分析[J]. 中華疾病控制雜志， 2019， 23（1）： 10-14.

[3]袁靜萍， 袁修學(xué)， 閻紅琳. 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞在乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的角色[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志， 2018， 34（12）： 1356-1359.

[4]任莉莉， 蔣錦杏， 齊暉， 等. 乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境與T細(xì)胞浸潤異質(zhì)性分析[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 49（6）： 716-719.

[5]中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌專業(yè)委員會(huì). 中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）[J]. 中國癌癥雜志， 2015， 25（9）： 692-754.

[6]SALGADO R， DENKERT C， DEMARIA S， et al. The evaluation of tumor-infiltrating lymphocytes （TILs） in breast cancer： Recommendations by an International TILs Working Group 2014[J]. Annals of oncology： Official journal of the European Society for Medical Oncology， 2015， 26（2）： 259-271.

[7]祝夢嬌， 羅昆侖， 芮小平， 等. 三陰性乳腺癌組織中LAG-3、PD-1、PD-L1的表達(dá)和TIL計(jì)數(shù)的臨床意義[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)， 2022， 30（11）： 1961-1966.

[8]姜楠. 乳腺癌過繼性細(xì)胞免疫治療的研究進(jìn)展[J]. 中國腫瘤生物治療雜志， 2022， 29（6）： 571-579.