摘要 目的：觀察遠(yuǎn)志皂苷元（TEN）對阿爾茨海默病體外模型β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ_1-42）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和自噬的影響。方法：體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，并隨機分為對照組（正常生長PC12細(xì)胞）、模型組（Aβ_1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷）以及TEN低、中、高劑量組（Aβ_1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷＋TEN低、中、高劑量）。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白和自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）和Beclin-1以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)果：與對照組比較，模型組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01），p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，TEN各劑量組神經(jīng)元存活率升高，p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：TEN有助于減輕Aβ_1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性，其機制可能與抑制凋亡和自噬水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 阿爾茨海默?。贿h(yuǎn)志皂苷元；β-淀粉樣蛋白1-42；細(xì)胞凋亡；自噬；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.014

Effects of Tenuigenin on Apoptosis and Autophagy in an Aβ_1-42-induced PC12 Cell

CHEN Yujing， HUANG Xiaobo， WANG Qian， SUN Yanan， LIU Yan， WU Xiling

Xuanwu Hospital， Capital Medical University， Beijing 100053， China

Corresponding Author "HUANG Xiaobo， E-mail： huangxiaobo@xwh.ccmu.edu.cn

Abstract Objective：To observe the effect of tenuigenin（TEN） on apoptosis and autophagy in an Aβ_1-42-induced PC12 cell model of Alzheimer′s disease.Methods：PC12 cells were cultured in vitro，and randomly divided into control group（normal growth of PC12 cells），model group（Aβ_1-42 induced PC12 cell damage），and low-dose，medium-dose，and high-dose TEN groups（Aβ_1-42 induced PC12 cell damage＋low-dose，medium-dose，and high-dose TEN） respecively.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay was used to detect the cell survival rate.Apoptosis was detected by flow cytometry.Western Blot was used to detect the expression of phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase（p-PI3K），phosphorylated protein kinase（p-Akt），microtubule-associated protein 1 light chain 3（LC3-Ⅱ），Beclin-1，and apoptosis-related proteins Caspase-3，Bcl-2，and Bax.Results：Compared with control group，the survival rate of the model cells was significantly decreased（P＜0.01），the protein expressions of p-PI3K，p-Akt，and Bcl-2 were significantly down-regulated，while the protein expressions of Caspase-3，Bax，LC-3Ⅱ，and Beclin-1 were significantly up-regulated（P＜0.01） in model group.Compared with model group，the survival rate of neurons was increased，the protein expressions of p-PI3K，p-Akt，and Bcl-2 were increased，and the protein expressions of Caspase-3，Bax，LC3-Ⅱ，and Beclin-1 were decreased（P＜0.05 or P＜0.01） in all doses of TEN groups.Conclusion：TEN can rduce the cytotoxicity of PC12 induced by Aβ_1-42，and its mechanism may be related to the inhibition of apoptosis and autophagy levels.

Keywords Alzheimer′s disease; tenuigenin; β-amyloid1-42; apoptosis; autophagy; experiment research

基金項目 北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項目（No.JJ2018-22）；北京市屬醫(yī)院科研培育計劃項目（No.PZ2023009）

作者單位 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京市中西醫(yī)結(jié)合老年疾病研究所（北京 100053）

通訊作者 黃小波，E-mail：huangxiaobo@xwh.ccmu.edu.cn

引用信息 陳玉靜，黃小波，王倩，等.遠(yuǎn)志皂苷元對Aβ_1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和自噬的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2418-2422.

目前，全世界約有4 000萬例阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）病人，預(yù)計到2025年，這個數(shù)字將翻三番^[1-2]。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑塊形成是AD的典型病理學(xué)改變之一，Aβ沉積可引起細(xì)胞凋亡，在AD發(fā)病機制中起著重要作用^[3]。AD病人腦內(nèi)自噬系統(tǒng)異常，引起Aβ水平的上升及錯誤折疊。自噬和凋亡是細(xì)胞的兩種不同的程序性死亡，二者之間相互關(guān)聯(lián)又相互影響。在Aβ裂解產(chǎn)生的片段中，Aβ_1-42的神經(jīng)毒性較強，通常用作AD離體實驗的造模物質(zhì)。在形態(tài)和功能上，PC12細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞具有相似的特性，能直接反映中樞神經(jīng)的病理生理狀態(tài)，是國際上公認(rèn)的研究AD體外神經(jīng)毒性的理想模型^[4]。本研究在Aβ學(xué)說基礎(chǔ)上，以Aβ_1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷為模型載體，觀察遠(yuǎn)志皂苷元（tenuigenin，TEN）通過磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路對Aβ_1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的作用，并探討其治療AD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

TEN（純度＞99%）購自中國藥品生物制品檢定所，實驗時用蒸餾水配制成1.0、2.0、4.0 μg/mL的濃度；Aβ_1-42購于Sigma公司，實驗時用無血清DMEM培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度，并經(jīng)0.22 μmol/L微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、胎牛血清、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司，磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）、Caspase-3、Bcl-2、Bax、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin-1等抗體購自碧云天生物科技有限公司，其余國產(chǎn)分析純均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12 細(xì)胞株（高分化）購自北京中國科學(xué)院細(xì)胞庫。將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（含有青霉素鈉100 U/mL、鏈霉素100 U/mL），置于37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育，2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至70%～80%接觸時傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 MTT法篩選Aβ_1-42致PC12細(xì)胞損傷的濃度

PC12細(xì)胞以2×10⁵個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，經(jīng)神經(jīng)生長因子（NGF）作用5 d分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞后，棄原培養(yǎng)基，分別加入100 μL終濃度含0、5、10、20 μmol/L Aβ_1-42的新培養(yǎng)液，每組5個復(fù)孔，作用時間分別為24、48、72 h，藥物作用結(jié)束后，加入MTT（1 mg/mL）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，再加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL振搖15 min，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在570 nm波長下的吸光度值。每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 MTT法觀察TEN對Aβ_1-42致PC12細(xì)胞損傷的影響

根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選用10 μmol/L Aβ_1-42對已分化的PC12細(xì)胞作用48 h，作為AD細(xì)胞模型來進行后續(xù)的實驗。為探討TEN對Aβ_1-42致PC12細(xì)胞損傷的影響，將生長對數(shù)期的PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔20 000個，經(jīng)NGF誘導(dǎo)分化5 d后，各組中分別加入0、1、2、4 mg/L的TEN孵育12 h，再加入10 μmol/L的Aβ_1-42繼續(xù)培養(yǎng)48 h，接著加入20 μL MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，加入150 μL二甲基亞砜，反復(fù)振蕩15 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀570 nm波長測定OD值，每孔測定3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞分組及給藥方法

實驗分為對照組、模型組、TEN低劑量組、TEN中劑量組、TEN高劑量組。對照組：用20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)60 h；模型組：細(xì)胞培養(yǎng)12 h后加入終濃度為10 μmol/L Aβ_1-42誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；TEN低劑量組：加入TEN（1 mg/L）預(yù)孵育PC12細(xì)胞12 h，然后加入終濃度為10 μmol/L的Aβ_1-42繼續(xù)培養(yǎng)48 h；TEN中劑量組：加入TEN（2 mg/L）預(yù)孵育PC12細(xì)胞12 h，然后加入終濃度為10 μmol/L的Aβ_1-42繼續(xù)培養(yǎng)48 h；TEN高劑量組：加入TEN（4 mg/L）預(yù)孵育PC12細(xì)胞12 h，然后加入終濃度為10 μmol/L的Aβ_1-42繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測Aβ_1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡

按V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）試劑盒說明書操作。細(xì)胞經(jīng)消化后離心去除培養(yǎng)液，調(diào)整磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為濃度5×10⁴/mL～1×10⁵ /mL，離心后去上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min，離心后去上清，再加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），冰浴避光放置，隨即進行流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果判定：Annexin V－/PI－為正常細(xì)胞，Annexin V＋/PI－為凋亡細(xì)胞，Annexin V＋/PI＋為壞死細(xì)胞。試驗重復(fù)3次，根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果計算神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分比。

1.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)

收集處理的細(xì)胞，進行蛋白定量，將各組蛋白調(diào)整成等濃度。等量50 μg蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下用封閉液封閉2 h后加入一抗：p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Beclin-1和LC3-Ⅱ，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，增強化學(xué)發(fā)光（ECL）法BIO-RAD凝膠成像儀拍攝圖像，以β-actin為內(nèi)參照，實驗重復(fù)3次，Image J 軟件測定OD值，用OD值表示目的蛋白的相對含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ_1-42對PC12細(xì)胞活力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，與0 μmol/L比較，5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L濃度的Aβ_1-42對已經(jīng)分化的PC12細(xì)胞進行處理24 h、48 h及72 h后，各時間的細(xì)胞存活率隨著Aβ_1-42濃度增加而下降，其中，10 μmol/L的Aβ_1-42處理48 h后細(xì)胞存活率為（52.5±3.2）%，接近于50%，因此，在后續(xù)實驗中選擇10 μmol/L的Aβ_1-42作用48 h。詳見表1。

2.2 TEN對Aβ_1-42致PC12細(xì)胞存活率的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.01），TEN各劑量組細(xì)胞存活率明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖1及表2。

2.3 TEN對Aβ_1-42致PC12細(xì)胞凋亡和自噬的影響

與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），TEN低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖2及表3。

2.4 Western Blot檢測結(jié)果

與對照組比較，模型組p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，TEN各劑量組p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），而Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖3及表4。

3 討 論

本研究應(yīng)用Aβ_1-42損傷PC12細(xì)胞制作模型，Aβ具有較強的神經(jīng)毒性，一方面，Aβ破壞細(xì)胞骨架；另一方面，通過激活膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)炎癥反應(yīng)造成突觸和神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生^[5-6]，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD病人出現(xiàn)記憶喪失及認(rèn)知功能障礙等臨床表現(xiàn)的病理學(xué)基礎(chǔ)。研究顯示，與凋亡發(fā)生密切相關(guān)的PI3K/Akt 信號通路、Caspase和Bcl-2基因家族在AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生及治療中起著重要作用。PI3K活化后可激活A(yù)kt，Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是P13K的靶蛋白之一。Akt促進下游凋亡基因失活，進而抑制凋亡發(fā)生，保護神經(jīng)元免受Aβ引起的損傷^[7]。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Akt表達(dá)能明顯抑制Aβ_1-42引起的Bax表達(dá)增多，而抑制Akt磷酸化則會加重AD認(rèn)知損害^[8]。

自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)和對不良環(huán)境的一種防御機制，在細(xì)胞的生長分化、結(jié)構(gòu)重建以及清除代謝產(chǎn)物方面發(fā)揮著重要作用。一方面，自噬加速了細(xì)胞的新陳代謝，有助于促進細(xì)胞在不利環(huán)境下的生存，而過度自噬也會造成細(xì)胞損傷或加速衰老及死亡^[9-10]。AD早期階段，自噬有利于腦內(nèi)Aβ的清除，然而，在進展期AD病人腦內(nèi)，當(dāng)Aβ廣泛累積時，自噬機制不足以消除過多的Aβ，過度自噬還會導(dǎo)致關(guān)鍵細(xì)胞成分受損，隨后細(xì)胞在Aβ清除之前即發(fā)生死亡。

自噬和凋亡二者之間相互關(guān)聯(lián)，自噬是誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的因素之一，抑制自噬會延緩凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)這些病理特征出現(xiàn)之前，AD病人腦內(nèi)已經(jīng)檢測到大量自噬體形成的標(biāo)志物——LC3-Ⅱ^[11]，因此，在AD病變早期即有自噬發(fā)生^[12]，并且，Aβ可以誘導(dǎo)激活自噬，Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與其細(xì)胞毒性相關(guān)，其中Aβ42的細(xì)胞毒性最強。

PI3K/Akt-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是細(xì)胞自噬的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了細(xì)胞的生長、增殖與分化的調(diào)節(jié)。在自噬體形成的核心階段，PI3K發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Akt的直接靶點是mTOR，mTOR是參與細(xì)胞生長代謝的重要樞紐因子。首先Akt磷酸化激活mTOR，然后通過不同的下游通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬、凋亡及軸突再生，參與了多種疾病發(fā)生的病理過程^[13]。mTOR信號通路是Aβ激活自噬的主要途徑，mTOR主要通過自噬分子標(biāo)志物Beclin-1和LC3參與自噬的病理過程^[14]。

Beclin-1在自噬中起到鏈接作用，能將自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜上。Aβ能夠激活PC12細(xì)胞內(nèi)Beclin-1發(fā)生自噬，進而維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)及線粒體功能，抑制Aβ42對PC12細(xì)胞的損傷^[15]。既往研究也發(fā)現(xiàn)，AD病人腦組織中Beclin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯減少^[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2能通過與Beclin-1的結(jié)合抑制自噬體的形成，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)或炎癥反應(yīng)時Bcl-2與Beclin-1分離可誘導(dǎo)自噬。作為自噬的標(biāo)志性蛋白，LC3有兩種亞型：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ蛋白的表達(dá)水平與自噬程度呈正相關(guān)。既往研究表明，Aβ可增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)^[17]。

中藥遠(yuǎn)志具有益智安神、抗衰老等作用，臨床多用于心腎不交引起的失眠健忘、驚悸多夢等癥狀。TEN是遠(yuǎn)志的提取物，已證實有多種神經(jīng)保護作用，體現(xiàn)在改善AD模型的學(xué)習(xí)記憶能力^[18-19]；保護微管和軸突，維持細(xì)胞骨架完整^[20]；通過調(diào)節(jié)蛋白激酶和磷酸酯酶，抑制Tau蛋白磷酸化^[21]；調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)功能，減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性作用；抗氧化以及促進神經(jīng)元增殖和再生^[22]；臨床研究還顯示，TEN和β-細(xì)辛醚聯(lián)合應(yīng)用可增強美金剛治療輕中度AD的療效^[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組p-P13K和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)也明顯減少，而促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá)增加，表明Aβ_1-42抑制了PI3K和Akt的磷酸化，從而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，這與文獻報道^[24]一致。TEN的作用在于其激活了PI3K/Akt信號通路，p-Akt的表達(dá)增強了Bcl-2的抗凋亡作用，拮抗了Caspase-3和Bax的促凋亡作用，從而保護神經(jīng)元免受Aβ引起的毒性損傷。本研究還檢測了Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)水平的變化，與對照組比較，模型組Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高，可能與Aβ誘導(dǎo)激活自噬有關(guān)；與模型組比較，TEN各劑量組Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯降低，抑制Aβ誘導(dǎo)的自噬。

綜上所述，TEN可明顯改善Aβ_1-42誘導(dǎo)引起的PC12細(xì)胞損傷，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率，通過抑制細(xì)胞凋亡和自噬，達(dá)到神經(jīng)保護作用。本研究為TEN抗AD藥效研究與分子機制探討及臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2022-04-03）

（本文編輯郭懷?。?/p>