摘要 目的：探討槲皮素通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）信號(hào)通路對(duì)主動(dòng)脈夾層小鼠血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。方法：取主動(dòng)脈夾層模型小鼠進(jìn)行原代血管平滑肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定，分為對(duì)照組、槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組、槲皮素高劑量組。檢測(cè)4組細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞遷移能力及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）、骨橋蛋白（OPN）、基質(zhì)Gla蛋白（MGP）mRNA表達(dá)；檢測(cè)磷酸化-p38絲裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：與對(duì)照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組各時(shí)段細(xì)胞增殖活性明顯降低，劃痕寬度百分比明顯升高，α-SMA、SM22α mRNA表達(dá)明顯升高，OPN、MGP mRNA表達(dá)明顯降低，p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組作用效果最優(yōu)。結(jié)論：槲皮素可抑制主動(dòng)脈夾層小鼠血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞增殖、遷移能力，其作用機(jī)制可能與抑制ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 主動(dòng)脈夾層；槲皮素；血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.011

基金項(xiàng)目 河北省2021年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計(jì)劃項(xiàng)目（No.20211358）

作者單位 唐山市工人醫(yī)院（河北唐山 063000），E-mail：mugtjb@163.com

引用信息 馬青，劉建成，李春波.槲皮素通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路對(duì)主動(dòng)脈夾層小鼠血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2400-2405.

主動(dòng)脈夾層是一種較嚴(yán)重的主動(dòng)脈疾病，主要是血液經(jīng)主動(dòng)脈壁內(nèi)膜撕裂口進(jìn)入血管壁中層，引發(fā)夾層血腫形成，且沿主動(dòng)脈壁延伸剝離的疾病，患病率、病死率均較高^[1]。研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展重要的病理基礎(chǔ)，即自收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移^[2]。槲皮素是提取自槲皮甙、蕓香甙及金絲桃甙的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、修復(fù)腦血管缺血病灶、調(diào)控細(xì)胞增殖等藥理學(xué)作用^[3]。報(bào)道顯示，槲皮素可調(diào)控腦血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)細(xì)胞存活^[4]，但關(guān)于槲皮素對(duì)主動(dòng)脈夾層血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制尚無(wú)明確報(bào)道。本研究探討槲皮素對(duì)主動(dòng)脈夾層小鼠血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取20只健康昆明雄性小鼠，4周齡，體質(zhì)量20～28 g，購(gòu)自北京科興中維生物技術(shù)有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0052。試驗(yàn)前將小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±1）℃、濕度55%、明暗交替（12 h/12 h）動(dòng)物房，自由獲得飲水、飼料。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑、儀器

槲皮素（純度≥98%，西安綠天生物技術(shù)有限公司），β-氨基丙腈（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社），血管緊張素Ⅱ凍干粉（美國(guó)Sigma公司），實(shí)時(shí)熒光定量分析（real-time fluorescence quantitative analysis，RT-PCR）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），兔抗小鼠骨橋蛋白（osteopontin，OPN）一抗、Alexa Fluor 488標(biāo)記抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（深圳子科生物科技有限公司），四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法試劑盒（美國(guó)Biovision公司），兔抗小鼠磷酸化-p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phosphorylated extracellular-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun NH2-terminal kinase，p-JNK）一抗及山羊抗兔IgG二抗[安諾倫（北京）生物科技有限公司]。DSX500光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社），Image Quant LAS 4000型化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國(guó)GE Healthcare公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

將20只小鼠構(gòu)建主動(dòng)脈夾層模型^[5]：小鼠以β-氨基丙腈1 g/kg灌胃，每日1次，給藥4周。4周后經(jīng)腹部皮下植入藥物緩釋泵，注入血管緊張素Ⅱ溶液（以滅菌注射用水將血管緊張素Ⅱ凍干粉制備成1 mg/mL的血管緊張素Ⅱ溶液），注入速度為每分鐘1 μg/kg，給藥1周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剔除建模失敗小鼠。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：給藥期間無(wú)死亡，給藥后麻醉，斷頸處死，取主動(dòng)脈進(jìn)行病理檢查，可見(jiàn)巨大假腔形成，假腔內(nèi)充盈大量紅細(xì)胞，確認(rèn)主動(dòng)脈夾層形成（見(jiàn)圖1）。20只小鼠建模成功16只，成功率80.00%。

1.2.2 原代小鼠血管平滑肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)

采用貼塊法培養(yǎng)。建模成功小鼠以6%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定在鼠板上，打開(kāi)胸腔，右心房剪開(kāi)，分離胸主動(dòng)脈，長(zhǎng)約2 cm。縱向剪開(kāi)分離出的胸主動(dòng)脈，剪成3 mm小段，置入培養(yǎng)皿晾干，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察貼塊周圍血管平滑肌細(xì)胞爬出后，去除貼塊，胰酶消化，細(xì)胞密度1×10⁵個(gè)/mL，開(kāi)始傳代。

1.2.3 血管平滑肌細(xì)胞純度鑒定

采用免疫熒光法鑒定。細(xì)胞傳代時(shí)，細(xì)胞密度3×10⁴個(gè)/mL，接種在6孔板，加入DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，以4%多聚甲醛固定，加0.1% Triton X-100透化細(xì)胞，5%牛血清白蛋白封閉1 h，加兔抗小鼠OPN一抗（1∶100），室溫孵育2 h，洗滌。加Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記二抗（1∶1 500），洗滌，中性樹(shù)膠封片。熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，鑒定細(xì)胞純度。

1.2.4 細(xì)胞分組及處理

取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期血管平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞密度1×10⁶個(gè)/mL，接種于6孔板。CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%，過(guò)夜。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至80%，開(kāi)始處理。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組、槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組、槲皮素高劑量組，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組分別以30、60、120 μmol/L槲皮素處理24 h，對(duì)照組以等量生理鹽水處理24 h。

1.2.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)。取4組細(xì)胞，細(xì)胞密度1.0×10⁴個(gè)/mL，在96孔板接種，復(fù)孔數(shù)均設(shè)為5，另設(shè)空白孔（僅加20 μL培養(yǎng)液）。各孔培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，分別將5 mg/mL的MTT溶液20 μL加入孔內(nèi)，CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%，時(shí)間4 h。隨后將各孔培養(yǎng)上清液清除，加150 μL二甲基亞砜溶液，振蕩10 min。觀察各組酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處吸光度（optical density，OD）值，評(píng)估細(xì)胞增殖活性。

1.2.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)。取4組細(xì)胞，在6孔板接種，待細(xì)胞覆蓋孔板，以200 μL移液器槍頭刮出直徑約200 μm的垂直劃痕。全盤磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，37 ℃，孵育24 h。鏡下記錄細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算劃痕寬度百分比＝（24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度）×100%。

1.2.7 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）、OPN、基質(zhì)Gla蛋白（MGP） mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用RT-PCR法檢測(cè)。取4組細(xì)胞，總RNA以Trizol試劑盒提取，紫外吸收法檢測(cè)總RNA濃度，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。采用GeneBank基因庫(kù)內(nèi)小鼠α-SMA、SM22α、OPN、MGP基因序列檢測(cè)，引物序列詳見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：cDNA Template 2 μL。正向引物、反向引物各1 μL，5×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，蒸餾水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s，預(yù)變性。95 ℃，5 s，變性；60 ℃，30 s，退火；72 ℃，20 s，延伸。共20個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶，以2^－△△CT計(jì)算α-SMA、SM22α、OPN、MGP mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.8 p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)。取4組細(xì)胞，提取總蛋白，加RIPA裂解液1 mL充分裂解，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，加等體積上樣緩沖液，沸水浴10 min，變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脫脂奶粉封閉60 min，洗膜。4 ℃，加兔抗小鼠 p-p38 MAPK（1∶1 000）、p-ERK1（1∶1 000）、p-ERK2（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）一抗，孵育，過(guò)夜，洗膜。室溫下加入山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），孵育2 h，洗膜。Image Quant LAS 4000型化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯影曝光，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值計(jì)算目的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第4天、第5天時(shí)，可見(jiàn)血管平滑肌細(xì)胞自組織塊邊緣長(zhǎng)出。傳代后生長(zhǎng)速度迅速，部分相鄰細(xì)胞融成片，或多層重疊。免疫熒光鑒定顯示，血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)OPN，細(xì)胞純度（95.05±2.85）%。詳見(jiàn)圖2。

2.2 4組細(xì)胞增殖活性O(shè)D值比較

4組細(xì)胞增殖活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)（P＜0.05）；4組間24、48、72 h細(xì)胞增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組24、48、72 h細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組24、48、72 h細(xì)胞增殖活性低于槲皮素低劑量組、中劑量組，槲皮素中劑量組24、48、72 h細(xì)胞增殖活性低于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.3 4組劃痕寬度百分比比較

4組間劃痕寬度百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組劃痕寬度百分比升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組劃痕寬度百分比高于槲皮素低劑量組、中劑量組，槲皮素中劑量組劃痕寬度百分比高于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3、表3。

2.4 4組α-SMA、SM22α、OPN、MGP mRNA表達(dá)比較

4組間α-SMA、SM22α、OPN、MGP mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組α-SMA、SM22α mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），OPN、MGP mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。槲皮素高劑量組α-SMA、SM22α mRNA表達(dá)高于槲皮素低劑量組、中劑量組，OPN、MGP mRNA表達(dá)低于槲皮素低劑量組、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；槲皮素中劑量組α-SMA、SM22α mRNA表達(dá)高于槲皮素低劑量組，OPN、MGP mRNA表達(dá)低于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表4。

2.5 4組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白表達(dá)比較

4組間p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量低于槲皮素低劑量組、中劑量組，槲皮素中劑量組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量低于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖4、表5。

3 討 論

主動(dòng)脈夾層起病急，病情兇險(xiǎn)，發(fā)病后短時(shí)間內(nèi)就可造成主動(dòng)脈壁破裂，病死率高。血管平滑肌細(xì)胞一直是主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)，其按照功能特性可分為兩種表型，即收縮型、合成型，收縮型可收縮血管，是血管平滑肌細(xì)胞成熟類型，合成型則無(wú)收縮蛋白，兩種表型在病理?xiàng)l件下可互相轉(zhuǎn)化。正常情況下機(jī)體血管平滑肌細(xì)胞多為收縮型，而主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞多呈收縮能力弱、增殖及遷移能力較強(qiáng)的合成型^[6]。因此，探尋抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的有效手段以控制主動(dòng)脈夾層病變具有重要臨床意義。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，生物活性強(qiáng)，可促進(jìn)血管修復(fù)，在心血管疾病防治中有較廣闊的應(yīng)用前景^[7]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可對(duì)抗氧化應(yīng)激造成的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞生理功能完整性^[8]；槲皮素可抑制高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞（HCCLM3）內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)，控制細(xì)胞遷移、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞存活^[9]。槲皮素能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，在多種心血管疾病治療中有一定作用^[10]，但有關(guān)槲皮素對(duì)主動(dòng)脈夾層血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素處理后細(xì)胞增殖活性降低，劃痕寬度百分比提升，細(xì)胞遷移能力減弱，收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA、SM22α mRNA表達(dá)升高，合成型標(biāo)志蛋白OPN、MGP mRNA表達(dá)降低，且呈劑量依賴性，提示槲皮素可抑制主動(dòng)脈夾層小鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞增殖、遷移能力。

ERK1/2信號(hào)通路是最早發(fā)現(xiàn)的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在各類細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、絲裂原及激素受體活化后信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，所含蛋白包括p38 MAPK、ERK1、ERK2、JNK等^[11]。其中，ERK可經(jīng)磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)機(jī)體各種生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，其表達(dá)水平與心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。p38 MAPK是一種分子量為38 kD的蛋白，被激活后可轉(zhuǎn)位入核，特異性調(diào)節(jié)JNK蛋白轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，最終調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及死亡^[12]。有學(xué)者提出，抑制ERK1/2信號(hào)通路，能減輕高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞異常增殖、遷移及凋亡^[13]。趙永波等^[14]研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK/ERK信號(hào)通路，可降低血管緊張素Ⅱ刺激的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力，抑制主動(dòng)脈夾層形成。還有報(bào)道顯示，槲皮素可經(jīng)調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路，發(fā)揮血管保護(hù)作用^[15]。這些研究均提示，ERK1/2信號(hào)通路可能在槲皮素調(diào)節(jié)主動(dòng)脈夾層血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化中有一定作用。本研究結(jié)果顯示，槲皮素處理后p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，效果呈劑量依賴性。而且高劑量槲皮素處理后收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA、SM22α mRNA及合成型標(biāo)志蛋白OPN、MGP mRNA表達(dá)均顯著改變，與ERK1/2信號(hào)通路各蛋白表達(dá)變化呈良好同步性，說(shuō)明槲皮素可抑制主動(dòng)脈夾層小鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，作用機(jī)制可能與抑制ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，槲皮素可抑制主動(dòng)脈夾層血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，減弱細(xì)胞增殖、遷移能力，作用機(jī)制可能與抑制ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。本研究局限之處在于僅對(duì)ERK1/2信號(hào)通路做出初步分析，尚未明確其他通路的影響，今后仍需進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2022-01-06）

（本文編輯郭懷印）