摘要 目的：探討麝香保心丸干預(yù)心肌缺血再灌注（I/R）損傷大鼠的作用機(jī)制。方法：將20只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為control組、I/R組、I/R＋麝香保心丸組、I/R＋鐵抑素-1（Fer-1）組，每組5只。對(duì)照組及I/R組給予生理鹽水2 mL/d灌胃，I/R＋麝香保心丸組給予麝香保心丸150 mg/（kg·d）灌胃，I/R＋Fer-1組大鼠腹腔注射1 mg/（kg·d）Fer-1，5 d后制備心肌缺血再灌注模型，control組僅開胸后縫合。再灌注24 h后檢測大鼠心功能以及外周血肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白T水平；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌的病理情況。結(jié)果：麝香保心丸及Fer-1均可改善模型大鼠心功能，降低外周血CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T水平（P＜0.05），下調(diào)心肌miR-144-3p，提高SLC7A11蛋白及谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）表達(dá)水平（P＜0.05）。HE染色提示Fer-1或麝香保心丸預(yù)干預(yù)可以減輕I/R心肌細(xì)胞排列混亂，縮小細(xì)胞組織間隙。結(jié)論：麝香保心丸可以減輕心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與miR-144-3p/SLC7A11信號(hào)通路，減輕心肌細(xì)胞鐵死亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 缺血再灌注損傷；麝香保心丸；鐵死亡；心功能；谷胱甘肽；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.010

基金項(xiàng)目 上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)專科項(xiàng)目（No.ZK2019A11）；上海市普陀區(qū)優(yōu)勢學(xué)科項(xiàng)目（No.2019ysxk01）；上海市中醫(yī)藥傳承和科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No.ZYCC2019026）；中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年人才托舉工程項(xiàng)目（No.QNRC2-B03）；上海市普陀區(qū)衛(wèi)生健康系統(tǒng)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No.ptkwws202209）；上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)項(xiàng)目（No.2021LK054）

作者單位 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院（上海 200062）

通訊作者 李凌燕，E-mail：4707494@qq.com

引用信息 葉健，汪谞，席鑫，等.麝香保心丸通過調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11減輕心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2396-2399.

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，具有高致殘率、致死率，發(fā)病率仍逐年上升^[1]。迅速開通堵塞血管是降低死亡率、改善預(yù)后的重要手段，但無論是介入還是溶栓治療都無法避免再灌注損傷。缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/R）是由于血流恢復(fù)后損傷進(jìn)一步加重的情況，具體機(jī)制尚不明確，其中包含了以壞死和細(xì)胞程序性死亡為主的多種細(xì)胞損傷和死亡模式^[2]。在縮短血管開通時(shí)間的前提下，減輕I/R是改善病人預(yù)后的重要手段。鐵死亡是一種以鐵沉積和脂質(zhì)過氧化物為特征，有別于凋亡、壞死的細(xì)胞程序性死亡方式^[3]。研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在心肌I/R中起重要作用，抑制鐵死亡能減輕再灌注心肌損傷^[4]。

麝香保心丸是治療冠心病的常用藥物，來源于宋代《太平惠民和劑局方》所記載的蘇合香丸。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸具有心肌重構(gòu)、改善血管內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管新生、縮小斑塊及改善心肌I/R等多重作用^[5-7]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可以通過調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號(hào)通路減輕心肌細(xì)胞鐵死亡^[8]，但其減輕心肌I/R是否與該信號(hào)通路有關(guān)不得而知，本研究旨在明確麝香保心丸改善心肌I/R是否與調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號(hào)通路抑制鐵死亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及動(dòng)物

20只SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司（序號(hào)：0043893），所有動(dòng)物遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理，給予充足的食物、飲水，飼養(yǎng)在溫度18～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境中。麝香保心丸（上海和黃藥業(yè)）用無菌生理鹽水制成混懸液，SLC7A11抗體購自Abcam，鐵抑素-1（Fer-1）購自Sigma，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒及發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒由上海萊哲生物科技有限公司提供。

1.2 I/R模型構(gòu)建及分組

3%的戊巴比妥鈉1.5 mL/kg腹腔注射，頸部及胸腔毛發(fā)剪除消毒，頸部中間開口1 cm，胸骨舌骨肌止血鉗鈍性分離暴露氣管，顯微剪刀切開小口，開口不宜過大，插入呼吸機(jī)插管，呼吸機(jī)參數(shù)：呼吸頻率90次/min，呼吸比為1∶2，生理鹽水棉球蓋住創(chuàng)口。于第3肋與第4肋骨間（可手按胸腔感知心臟跳動(dòng)最明顯位置）皮膚開口1 cm，下行處有一條小靜脈可兩端止血鉗夾住10 s，用剪刀剪斷，肋間開小口0.5 cm。兩個(gè)撐開器上下左右以肋骨配合撐開，暴露心臟，止血鉗挑開心包膜，再夾住胸腺部位固定，另一只手持針（5-0縫合線）左心耳下方3 mm處進(jìn)針，深度1 mm，寬度2 mm扎針進(jìn)線后在上方放一根直徑0.53 mm、長5 cm魚線，活結(jié)結(jié)扎?？p合閉胸，2 h后輕抽魚線再灌注。術(shù)后每只大鼠給予8×10⁵ U青霉素0.5 mL抗炎。再灌注24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用隨機(jī)數(shù)字表法分為control組、I/R組、I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組，每組5只。control組及I/R組給予生理鹽水2 mL/d灌胃，I/R＋麝香保心丸組給予麝香保心丸150 mg/（kg·d）灌胃，I/R＋Fer-1組大鼠腹腔注射1 mg/（kg·d）Fer-1，5 d后制備心肌I/R模型，control組僅開胸后縫合。

1.3 心功能檢測

采用PHILIPS CX50超聲系統(tǒng)檢測左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室短軸縮短率（FS）。3%戊巴比妥麻醉后，將大鼠備皮并固定在手術(shù)臺(tái)上，將線陣探頭放在胸骨左側(cè)，采集最佳的二維圖像，清晰顯示心尖及左右房室腔切面、左心室長軸，以看到M型曲線為準(zhǔn)。檢測心功能相關(guān)指標(biāo)，并計(jì)算LVEF，取連續(xù)心動(dòng)周期的平均值作為最后結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 心肌組織處理

取出心臟組織標(biāo)本，清洗后，一部分用4%的多聚甲醛溶液固定，包埋在石蠟中，采用HE染色觀察心肌病理情況；留取部分心肌組織－80 ℃凍存。

1.5 血清學(xué)指標(biāo)

3%戊巴比妥麻醉后，5 mL注射器腹主動(dòng)脈取血，2 000 r/min離心10 min，參考說明書，用ELISA試劑盒檢測大鼠外周血肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白T濃度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測各組miR-144-3p表達(dá)水平

取出－80 ℃中剩余心肌組織，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照說明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。miR-144-3p引物序列：正向引物為5′-GCAGAG TACAGTATAGATGATG-3′；反向引物為5′-GTGCAGGG TCCGAGGT-3′。

1.7 蛋白水平檢測

提?。?0 ℃凍存心肌組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，通過蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌梗死區(qū)SLC7A11，用Promega GSH/GSSG-GloTM Assay試劑盒檢測谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差分析用于比較正態(tài)分布組之間的測量數(shù)據(jù)；如果兩組之間的方差是均勻的，LSD檢驗(yàn)被用作事后檢驗(yàn)，否則使用Games Howell測試。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；當(dāng)兩組之間存在差異時(shí)，使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 梗死區(qū)心肌中miR-144-3p表達(dá)情況

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與control組比較，I/R組梗死區(qū)心肌miR-144-3p表達(dá)明顯升高，I/R＋麝香保心丸組經(jīng)麝香保心丸預(yù)處理后miR-144-3p表達(dá)較I/R組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 心肌組織SLC7A11蛋白表達(dá)情況

Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示，與control組比較，I/R組SLC7A11蛋白表達(dá)下降，I/R＋麝香保心丸組經(jīng)麝香保心丸預(yù)處理后SLC7A11蛋白表達(dá)較I/R組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3 心肌GSH、GSSG表達(dá)情況

與control組比較，I/R組GSH、GSSG表達(dá)明顯下降，I/R＋麝香保心丸組經(jīng)麝香保心丸預(yù)處理后GSH、GSSG表達(dá)水平較I/R組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3。

2.4 外周血CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T濃度比較

與control組比較，I/R組CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組CK-MB、LDH、肌鈣蛋白T水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.5 心功能指標(biāo)比較

與control組比較，I/R組大鼠LVEF、FS明顯降低，LVEDD明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組LVEF、FS明顯升高，LVEDD明顯縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.6 HE染色

control組大鼠梗死區(qū)HE染色未見明顯損傷，心肌細(xì)胞排列整齊，I/R組大鼠細(xì)胞排列混亂并可見組織間隙變大，I/R＋麝香保心丸組、I/R＋Fer-1組大鼠心臟組織病理學(xué)改變均有不同程度的改善。詳見圖4。

3 討 論

I/R是急性心肌梗死治療過程中無法避免的問題，有研究顯示，由于再灌注損傷導(dǎo)致的心肌損傷面積可達(dá)心肌梗死的最終心肌損傷面積的50%^[9]。I/R機(jī)制目前尚未明確，但普遍認(rèn)為與再灌注過程中Ca^2＋積聚、脂質(zhì)氧化及心肌中增加的活性氧（ROS）密切相關(guān)^[10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在缺血再灌注過程中發(fā)揮重要作用^[12-13]，鐵螯合劑的運(yùn)用可以明顯減少心肌I/R損傷^[4]。Fer-1是一種芳烷基胺類化合物，可以通過與Fe^2＋結(jié)合形成鐵素-鐵絡(luò)合物降低細(xì)胞內(nèi)Fe^2＋，減少脂質(zhì)被Fe^2＋氧化，抑制鐵死亡^[14]。在本研究中，I/R組大鼠心功能較control組明顯降低，外周血心肌損傷指標(biāo)明顯升高，F(xiàn)er-1及麝香保心丸預(yù)處理后I/R大鼠心功能得到恢復(fù)，外周血心肌損傷指標(biāo)明顯下降，心肌病理損傷減輕，說明鐵死亡存在于心肌缺血再灌注過程中，且可以通過藥物干預(yù)，前期研究也得到了類似的結(jié)果^[13]，同時(shí)提示麝香保心丸可以減輕心肌I/R，改善心功能。

miR-144-3p是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的非編碼RNA，可以抑制多種細(xì)胞的增殖、遷移能力，且與氧化應(yīng)激密切相關(guān)^[15-18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可以調(diào)控心肌細(xì)胞鐵死亡，且機(jī)制與降低miR-144-3p表達(dá)水平、上調(diào)SLC7A11蛋白相關(guān)^[8]。SLC7A11編碼胱氨酸/谷氨酸交換轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)XC-（xCT），抑制SLC7A11（xCT）能減少細(xì)胞外胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并減少GSH的合成，增加氧化應(yīng)激。已有研究證實(shí)，SLC7A11是鐵死亡的關(guān)鍵信號(hào)分子^[19-20]。在本研究中，麝香保心丸可降低I/R心肌中miR-144-3p表達(dá)水平，并上調(diào)SLC7A11及GSH、GSSG表達(dá)量，與課題組前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似；GSH、GSSG能夠減輕I/R損傷中的氧化應(yīng)激^[21]，提示麝香保心丸可能是通過調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號(hào)通路減輕心肌I/R損傷中的氧化應(yīng)激。

綜上所述，麝香保心丸能改善心肌I/R，其機(jī)制可能與調(diào)控miR-144-3p/SLC7A11信號(hào)通路，上調(diào)GSH、GSSG表達(dá)水平，抑制心肌細(xì)胞鐵死亡，減輕氧化應(yīng)激相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 《中國心血管健康與疾病報(bào)告》編寫組.《中國心血管健康與疾病報(bào)告2020》概述[J].中國心血管病研究，2021，19（7）：582-590.

[2] SCARABELLI T M，GOTTLIEB R A.Functional and clinical repercussions of myocyte apoptosis in the multifaceted damage by ischemia/reperfusion injury：old and new concepts after 10 years of contributions[J].Cell Death and Differentiation，2004，11（Suppl 2）：S144-S152.

[3] DIXON S J，LEMBERG K M，LAMPRECHT M R，et al.Ferroptosis：an iron-dependent form of nonapoptotic cell death[J].Cell，2012，149（5）：1060-1072.

[4] TANG L J，LUO X J，TU H，et al.Ferroptosis occurs in phase of reperfusion but not ischemia in rat heart following ischemia or ischemia/reperfusion[J].Naunyn-Schmiedeberg′s Archives of Pharmacology，2021，394（2）：401-410.

[5] 畢方杰，徐煜佳，孟猛，等.麝香保心丸通過調(diào)節(jié)apelin/APJ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心功能異常的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2018，16（1）：40-44.

[6] 王振興，劉志超，高晟瑋，等.麝香保心丸作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)急癥，2020，29（7）：1309-1312.

[7] 唐芬，江振濤，譚文婷，等.麝香保心丸對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及其Cx43蛋白表達(dá)的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2017，42（8）：906-910.

[8] 葉健，李凌燕，席鑫，等.麝香保心丸基于miR-144-3p/SLC7A11通路減輕心肌細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2022，42（11）：1335-1340.

[9] YELLON D M，HAUSENLOY D J.Myocardial reperfusion injury[J].The New England Journal of Medicine，2007，357（11）：1121-1135.

[10] LITVITSKIP F，KH K A，KUDRIN A N，et al.Mechanisms of free radical liquid peroxidation activation during regional ischemia and subsequent reperfusion of the heart[J].Biull Eksp Biol Med，1981，92（9）：283-285.

[11] KUMAR C，OKUDA M，IKAI I，et al.Luminol enhanced chemiluminescence of the perfused rat heart during ischemia and reperfusion[J].FEBS Letters，1990，272（1/2）：121-124.

[12] FANG X X，WANG H，HAN D，et al.Ferroptosis as a target for protection against cardiomyopathy[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2019，116（7）：2672-2680.

[13] LI W J，F(xiàn)ENG G S，GAUTHIER J M，et al.Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation[J].The Journal of Clinical Investigation，2019，129（6）：2293-2304.

[14] MIOTTO G，ROSSETTO M，DI PAOLO M L，et al.Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1[J].Redox Biology，2020，28：101328.

[15] MANASA V G，THOMAS S，KANNAN S.miR-144/451a cluster synergistically modulates growth and metastasis of Oral Carcinoma[J].Oral Diseases，2023，29（2）：584-594.

[16] BAI J，HU Y Q，CHEN X L，et al.miR-144-3p inhibits the invasion and metastasis of lung adenocarcinoma cells by targeting IRS1[J].Chinese Journal of Lung Cancer，2021，24（5）：323-330.

[17] LIU Y H，WANG X J，JIANG J，et al.Modulation of T cell cytokine production by miR-144* with elevated expression in patients with pulmonary tuberculosis[J].Molecular Immunology，2011，48（9/10）：1084-1090.

[18] LIU Y，CUI X Y，WANG C，et al.Retraction Note to：LncRNA HCG11 regulates proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cell through targeting miR-144-3p/FOXF1 axis in atherosclerosis[J].Biological Research，2021，54（1）：29.

[19] YUE Y J，WANG C L，BENEDICT C，et al.Interleukin-10 deficiency alters endothelial progenitor cell-derived exosome reparative effect on myocardial repair via integrin-linked kinase enrichment[J].Circulation Research，2020，126（3）：315-329.

[20] AN J R，SU J N，SUN G Y，et al.Liraglutide alleviates cognitive deficit in db/db mice：involvement in oxidative stress，iron overload，and ferroptosis[J].Neurochemical Research，2022，47（2）：279-294.

[21] GUO L，LING L，WANG X Q，et al.Exogenous hydrogen sulfide and methylglyoxal alleviate cadmium-induced oxidative stress in Salix matsudana Koidz by regulating glutathione metabolism[J].BMC Plant Biol，2023，23（1）：73.

（收稿日期：2022-12-02）

（本文編輯郭懷?。?/p>