【摘要】 對誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）的應用研究從2006年開始已經(jīng)逐漸成為干細胞研究和臨床治療領(lǐng)域的一個熱門課題。這項技術(shù)的問世為再生醫(yī)學、疾病建模和醫(yī)藥發(fā)展提供了前所未有的機會。本文就iPSC的發(fā)展前景和相關(guān)應用進行綜述。

【關(guān)鍵詞】 誘導多能干細胞 疾病模型 再生醫(yī)學 遺傳安全性

Research Progress of Induced Pluripotent Stem Cell/JIANG Yuxiao， YU Hao. //Medical Innovation of China， 2023， 20（20）： -188

[Abstract] The application of induced pluripotent stem cell （iPSC） has gradually become a hot topic in the field of stem cell research and clinical treatment since 2006. The advent of this technology offers unprecedented opportunities for regenerative medicine， disease modeling and pharmaceutical development. This paper reviews the development prospect and related applications of iPSC.

[Key words] Induced pluripotent stem cell Disease model Regenerative medicine Genetic safety

First-author's address： Clinical Medicine Major of Capital Medical University Eighth Clinical School， Beijing 100038， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.20.042

1981年，研究人員首次從鼠胚胎中提取出一種能不斷增殖并能充分發(fā)育的小鼠胚胎干細胞（mESCs）。17年后，Thomson團隊成功從人體的胚胎中分離出了人胚胎干細胞（hESCs）[1]。胚胎干細胞（ESCs）在離體培養(yǎng)中的應用表明，ESCs具有修復損傷器官、加速細胞壞死的作用。然而，ESCs的臨床使用仍有許多問題，如缺乏細胞來源、致瘤性、免疫原性及倫理問題等。誘導多能干細胞（iPSC）的問世，為干細胞在臨床上的應用提供了一個新的可能。但是，iPSC是如何發(fā)揮作用的，其機制尚不清楚，使其在臨床上的應用受到很大的制約。在過去的十幾年中，關(guān)于iPSC形成機制的研究已有很大的進展，但仍有很多的缺陷，有待于進一步的完善。

1 iPSC的發(fā)展歷程和應用前景

2006年Takahashi和Yamanaka的研究證明了4種

轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc（OSKM）可以使小鼠成纖維細胞恢復多能性，獲得iPSC[2]。次年，Takahashi等[3]和Yu等[4]兩個實驗團隊先后將人的體細胞重編程為多功能干細胞，開創(chuàng)了人誘導多功能干細胞（hiPSCs）的研究，為其應用于人類疾病臨床治療提供了可能。此后，iPSC的研究和關(guān)注度呈爆發(fā)式增長，并在細胞來源、誘導方式、效率等方面進行了改良和提高[5-6]。從細胞來源上看，iPSC目前可以從多種動物如小鼠、大鼠、猿、恒河猴、豬、兔和人中誘導。除了最開始的成纖維細胞，研究者們還成功從肝細胞、胃上皮細胞、角質(zhì)細胞、臍帶血細胞、淋巴等中誘導出iPSC。其誘導方式除了病毒轉(zhuǎn)導，發(fā)展到目前可用脂質(zhì)體、質(zhì)粒、RNA、蛋白質(zhì)及小分子化合物等多種方式進行轉(zhuǎn)化，研究者們可根據(jù)對安全性和誘導效率的要求進行選擇，極大地拓展了iPSC的研究和應用場景。

經(jīng)過某些特定轉(zhuǎn)錄因子的誘導后，iPSC能夠表達經(jīng)典ESCs標志物，模擬ESCs形態(tài)，并能分化成三層胚層，表現(xiàn)出多能性的特點。iPSC除了能解決ESCs的細胞來源、倫理等問題，由于其來源于患者，它們也是理想的自體移植干細胞來源。iPSC技術(shù)利用患者自己的分化體細胞把它重組成iPSC，再通過轉(zhuǎn)分化得到各種類型的細胞，因此很好地避免了免疫排斥的問題。iPSC與現(xiàn)有的移植技術(shù)相比，其優(yōu)點還在于可利用同源重組技術(shù)對特定的致病基因進行修復，有望解決一些已知的遺傳性疾病，如鐮刀型紅細胞貧血[7]。除此之外，這些重編程細胞也具有促進實驗結(jié)果走向臨床應用的能力，例如將其用于疾病模型和藥物測試[8-9]。因此，iPSC在精準醫(yī)學、再生醫(yī)學、細胞治療等領(lǐng)域尤其具有前景與吸引力。

2 iPSC的分子機制

iPSC的形成需要細胞中各轉(zhuǎn)錄因子的參與，進而彌補體細胞具有表觀遺傳障礙的缺陷。在體細胞重編程的初始階段，先鋒轉(zhuǎn)錄因子（PTF）首先與閉合的染色質(zhì)結(jié)合，開放相應的基因位點，使其他轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合，這是促進多能性誘導的關(guān)鍵[10]。

在OSKM系統(tǒng)中，Oct4、Sox2、Klf4都起到了PTF的作用。他們可以與封閉的染色質(zhì)結(jié)合，并與其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用，使染色質(zhì)發(fā)生表觀遺傳變化，而c-Myc易與開口染色質(zhì)結(jié)合[11]。其次，間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET）是體細胞重新編碼的一個重要的分子事件[12]。重組編碼因子與其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用，使Snai1表達降低，TGF-β信號受到抑制，Cdh1水平升高，從而使間充質(zhì)細胞向上皮細胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化[13]。

此外，誘導的多能性還可使體細胞的整個基因表觀修飾發(fā)生改變，其中包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、乙酰化等。在體細胞中，Oct4、Nanog、Sox2的起始子區(qū)被甲基化，從而引起了轉(zhuǎn)錄的抑制，但是，在重編程的時候，它們會再次被激活[14]。重編程因子是怎樣突破這個屏障的，機制尚未完全明確，但其作用機制已被部分地揭露。一些基因轉(zhuǎn)錄因子對DNA-甲基轉(zhuǎn)氨酶（DNMT）的抑制作用，使體細胞在分化時的甲基化程度逐漸下降。因為整個基因去甲基化對細胞有害，所以去甲基化一定要在某些區(qū)域進行，或者重編碼的分子能迅速地與新的雙鏈DNA結(jié)合，從而阻止它的甲基化[15]。在基因重組方面，也觀察到了DNA的活性去甲基化現(xiàn)象，但是有關(guān)的分子機制尚未得到充分的闡明[16]。

要重建多能性網(wǎng)絡，既要活化內(nèi)源性的多能性基因，又要靠細胞的增殖。成纖維細胞和大部分體細胞一樣，具有一定程度的繁殖能力，但在細胞培養(yǎng)的過程中易發(fā)生凋亡、生長停滯或老化[17]。所以如何獲得高度增殖能力的細胞是iPSC形成過程中面臨的又一難題。Guo等[18]研究證明，重編程過程中，高增殖能力細胞占重編程細胞的99%以上。與此同時，另一些研究證明，幾種周期蛋白和CDK的異位表達提高了重編程效率，而它們的缺失則具有相反的效果[19]。這些觀察結(jié)果都提示，細胞周期的加速可能是重編程的一個重要因素，對高增殖的細胞進行選擇及提高細胞周期蛋白的表達有助于提高iPSC的誘導效率。然而，細胞周期蛋白如何幫助iPSC獲得和增強多潛能狀態(tài)的確切分子機制在很大程度上仍未探明。綜上所述，雖然iPSC的原理及分子機制已被廣泛研究，但是仍有許多亟待研究的部分。

3 iPSC的應用

3.1 細胞移植治療

自1998年開始，hESCs被視為治療諸如帕金森綜合征、脊髓損傷等疑難雜癥的重要手段。2010年，Geron公司發(fā)起了第一個用于治療脊髓創(chuàng)傷患者的早期ESCs的研究。另外一家名為Advanced Cell Technology的生物科技公司報道了一個關(guān)于利用ESCs制造視網(wǎng)膜色素上皮的研究。但是，在獲得hESCs時，仍然存在一些道德倫理和技術(shù)方面問題，其中包括hESCs的來源，以及移植后的免疫排斥等，iPSC技術(shù)則有希望解決上述問題。

2007年Hanna等[7]構(gòu)建了一個小鼠模型并誘導其發(fā)生鐮刀型細胞貧血并利用iPSC成功治療。首先將小鼠的成纖維細胞重編程為iPSC，將致病突變借助基因編輯技術(shù)整合到iPSC上，隨后將其移植到造血干細胞上使其產(chǎn)生健康的細胞，在此基礎(chǔ)上，將這些健康的細胞移植到患有鐮刀型細胞貧血的老鼠體內(nèi)，觀察到原本異常的細胞因為移植健康的細胞進而產(chǎn)生了正常的紅細胞，最后痊愈。從理論上講，這種技術(shù)可以用于所有已知其可能的變異，運用細胞移植進行治療，這就是iPSC作為再生醫(yī)療的最佳范例。iPSC技術(shù)的特點和多分化的潛能為個性化治療提供了可靠的技術(shù)支持，且由于iPSC與免疫排斥、未知的病毒或其他病原體的感染沒有關(guān)系，因此與其他供體的異體移植相比，iPSC更具優(yōu)勢。

3.2 疾病建模和藥物篩選

iPSC的應用價值不僅僅體現(xiàn)在個體化的細胞療法，還有疾病建模等。疾病建模是指醫(yī)學研究中建立的具有人類疾病表現(xiàn)的實驗對象或相關(guān)材料。疾病建模的模式極大地促進了人們對疾病機制的了解，但由于技術(shù)或經(jīng)費的限制，大部分研究中利用的是動物或動物來源的細胞來進行人類疾病模型的建立，這樣的建模方式具有一定的限制性，比如，有些在小鼠身上表現(xiàn)出的療效被證實用于治療人類疾病是無效的，這一情況凸顯出需要利用人體自身細胞來構(gòu)建疾病模型的重要性。同時，患者來源的iPSC已被證明在Rett綜合征和家族性自主神經(jīng)障礙的藥物驗證中是有用的[20-21]。這些結(jié)果不僅表明使用來自患者的iPSC復制疾病表型是可能的，而且表明iPSC在藥物篩選中也具有一定的應用價值。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，iPSC常被應用于帕金森病（PD）的疾病模型建立。由于模型在體外觀察方便、可動態(tài)模擬PD患者的發(fā)病過程，從而促進了人們對PD發(fā)病機制的了解。自iPSC技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來，研究者們已經(jīng)成功從患者中建立攜帶與家族性PD有關(guān)的各種關(guān)鍵基因突變的疾病模型，包括PARK2、PINK1、LRRK2、SNCA和GBA等，以剖析導致其疾病發(fā)病的分子機制，更好地指導臨床治療及進行藥物篩選。

除此之外，在傳染病領(lǐng)域中，Tanaka等[22]建立起了由人誘導的多能干細胞產(chǎn)生的可感染SARS-CoV-2的人誘導唾液腺（hiSGs）疾病模型，證實了SARS-CoV-2在hiSGs中的感染和復制，提示無癥狀感染者的唾液中可能參與了病毒的傳播。有望通過該模型對無癥狀新冠病毒感染患者的傳播方式進行進一步的探索。

4 iPSC的安全性問題及研究

4.1 細胞的表觀遺傳學問題

與ESCs相比，iPSC表現(xiàn)出更多的多樣性，例如表觀遺傳記憶、遺傳背景及重編程期間新獲得的特征。研究者們對老鼠和人類的重編程過程進行了分析[23]，結(jié)果表明，過渡階段的細胞和完全重編程的細胞是完全不同的。因此，體細胞產(chǎn)生iPSC可能與其表觀遺傳動力學有關(guān)。證據(jù)顯示，許多人類、鼠iPSC具有類似于ESCs的特征，例如形態(tài)學、標記基因表達及畸胎瘤形成等基本多能性，但它們表現(xiàn)出特殊缺陷，例如分化質(zhì)量差、生長速度慢、轉(zhuǎn)錄異常、DNA甲基化、染色質(zhì)調(diào)節(jié)，或嵌合動物作用[24-25]，對細胞的遺傳安全性提出了挑戰(zhàn)。所以，分析不同的iPSC系分子和生物學上的差異，特別是表觀遺傳學上的差異，對于深入了解完全多能性至關(guān)重要的機制是非常有必要的。

4.2 細胞基因結(jié)構(gòu)變異

雖然iPSC技術(shù)可以拓寬干細胞的來源，但是誘導的過程中也有可能會使其發(fā)生基因突變，進而對其安全產(chǎn)生不利的作用。已有的實驗結(jié)果顯示，胚胎干細胞特異性染色質(zhì)重構(gòu)復合體BAF中Brg1、BAF155可與Oct4、Sox2、Klf4共同作用于成纖維細胞，染色質(zhì)重構(gòu)不僅有助于Oct4對其下游的基因進行調(diào)節(jié)，而且還可以促進Oct4與Tcf3、Dppa4啟動子區(qū)的融合。在誘變的同時，也會發(fā)生某些突變，某些體細胞在誘變中受到損傷，而已發(fā)生的突變也會引起更多的復制突變。另外，由于采用多種檢測手段，其基因的穩(wěn)定程度和檢測結(jié)果也不盡相同。因此利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)可以較常規(guī)的細胞遺傳學技術(shù)找到更多的基因變異，以保證細胞基因結(jié)構(gòu)的安全性。

4.3 致瘤性

iPSC的致瘤性也使得它在醫(yī)學上的安全性備受爭議，促使研究者們進一步開展相關(guān)的研究。研究人員證實，小鼠iPSC所產(chǎn)生的細胞激素能夠引起癌癥細胞的誘導微環(huán)境的生成，誘發(fā)了Lewis肺癌細胞的上皮間質(zhì)的變化，進而促使癌細胞的產(chǎn)生、擴散和轉(zhuǎn)移[26]。除了iPSC本身的成瘤性外，通過iPSC轉(zhuǎn)移后所產(chǎn)生的局部誘導微環(huán)境，也可能引起轉(zhuǎn)移的宿主細胞產(chǎn)生成癌性變化。

由于不同組織細胞的基因修飾和表達方式存在著差異，因此，誘導其進入“臨界狀態(tài)”的難度也是不同的，不同的組織細胞因其功能、適宜環(huán)境有很大差異，因此其誘導分化多能干細胞的能力和所需的轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量也會有不同程度的差異。研究表明，iPSC的基因異常隨著外源基因?qū)氲臄?shù)量增多而相應增加[27]，說明轉(zhuǎn)錄因子的過度使用會引起更多的基因變異，從而導致腫瘤的發(fā)生率提高。

5 小結(jié)

從發(fā)育的觀點出發(fā)，假設(shè)環(huán)境適宜，ESCs可以誘導分化成不同的組織細胞進行組織修復。但是，由于自身無法產(chǎn)生ESCs，在細胞來源、倫理法律等方面存在諸多限制，所以其應用存在著很大的困難。而iPSC技術(shù)的出現(xiàn)則很好地彌補了這些缺陷，通過對自身細胞進行重編程，使其成為iPSC，恢復其生長和分化能力，并能夠如早期的ESCs那樣，進行定向分化，從而達到多種臨床應用的目的。此外，iPSC可能來源于自身，它可以解決移植面臨免疫排斥的問題。但是，由于iPSC的重組程序會包含外部的基因和表觀遺傳學變化，它們自身存在著不安全的可能，因此，在運用到實際治療前，我們需要探究清楚其機制和風險。此外，不同來源的細胞重編碼的難度也會導致其表現(xiàn)出的基因變化和安全方面的差異。所以，對其重編程的機制進行深入的探討，篩選出一種安全高效的可重用的新的編程方式，并在此基礎(chǔ)上制訂一套統(tǒng)一的移植規(guī)范，對于確保其在臨床中的應用具有十分關(guān)鍵的作用，一旦iPSC技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)安全、高效、實用，相信它的應用對醫(yī)療科研和各種病癥的處理都會產(chǎn)生巨大的進步。

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（收稿日期：2023-01-06） （本文編輯：陳韻）