【摘要】 目的：研究三才封髓丹治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機制。方法：利用TCMSP、BATMAN數(shù)據(jù)庫預(yù)測和篩選出三才封髓丹治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的潛在靶點，采用CTD和DisGeNET數(shù)據(jù)庫對口腔潰瘍相關(guān)基因和靶標(biāo)篩選，并與前面數(shù)據(jù)庫篩選的靶標(biāo)整合，縮小范圍。基于Cytoscape插件對獲得的靶點蛋白進行GO富集分析和KEGG通路注釋，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和“活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖確定組方的作用機制。結(jié)果：組方中71個活性成分被篩選出。通過交叉驗證55個靶蛋白顯著富集28條GO功能術(shù)語中，最后劃分為8個類別功能。靶蛋白主要通過JAK-STAT信號通路、細胞因子-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路等通路作用?；诓菟?成分-靶蛋白-通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)，最終構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)共122個節(jié)點，363條關(guān)系對，其中化學(xué)成分節(jié)點27個，靶蛋白節(jié)點73個，通路相關(guān)靶蛋白節(jié)點35個，通路節(jié)點17個。結(jié)論：本研究結(jié)果初步預(yù)測了三才封髓丹治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的主要活性成分、靶點和相關(guān)通路，為進一步深入揭示其作用機制奠定了良好基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 三才封髓丹 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

Study on the Mechanism of Action of Sancai Fengsui Dan in the Treatment of Recurrent Aphthous Ulcer Based on Network Pharmacology/CHEN Aifang， XU Jing， CHEN Dong， GUO Dandan， LIAO Jing. //Medical Innovation of China， 2023， 20（20）： -164

[Abstract] Objective： To study the mechanism of network pharmacology of Sancai Fengsui Dan in the treatment of recurrent aphthous ulcer. Method： TCMSP and BATMAN databases were used to predict and screen out potential targets of Sancai Fengsui Dan in the treatment of recurrent aphthous ulcer. CTD and DisGeNET databases were used to screen oral ulcer-related genes and targets， and integrated with the targets screened in the previous databases to narrow down the scope. GO enrichment analysis and KEGG pathway annotation were carried out on the obtained target proteins based on Cytoscape plug-in. Protein interaction network and \"bioactive component-target-signaling pathway\" network map were drawn to determine the mechanism of action of the formula. Result： 71 active ingredients were screened. Through cross-verification， 55 target proteins were significantly enriched in 28 GO functional terms， which were finally divided into 8 functional categories. The target protein mainly acts through JAK-STAT signaling pathway， cytokine-receptor interaction， PI3K-Akt signaling pathway and other pathways. A network pharmacological network was constructed based on the herb-composition-target protein-pathway. The final network consisted of 122 nodes and 363 relationship pairs， including 27 chemical composition nodes， 73 target protein nodes， 35 pathway-related target protein nodes， and 17 pathway nodes. Conclusion： The results of this study preliminarily predicted the main bioactive component， targets and related pathways of Sancai Fengsui Dan in the treatment of recurrent aphthous ulcer， and laid a good foundation for further revealing its mechanism of action.

[Key words] Sancai Fengsui Dan Recurrent aphthous ulcer Network pharmacology

First-author's address： Beijing Royal Integrative Medicine Hospital， Beijing 100027， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.20.037

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent aphthous ulcer，RAU）在中醫(yī)上屬于“口瘡”“口糜”“口瘍”等范疇，病因主要歸結(jié)于患者飲食不節(jié)、嗜酒無度損傷脾胃，以致健運失司濕濁滯于中焦，久而化熱；抑或是勞累過度、七情不暢致使氣血陰陽不足，虛火上熏于口而發(fā)病[1-3]，該病易反復(fù)發(fā)作，不易根治，是口腔黏膜病中最常見的病癥?；颊甙l(fā)病時病變部疼痛劇烈，吃飯、講話和吞咽都會受到影響。目前治療的方法很多，效果各異，主要是對癥治療，局部用藥有膜劑、軟膏、含漱液、口腔潰瘍散等，以消炎止痛的作用為主。

和西藥不同，中藥通過多種成分的相互作用對機體的功能進行多靶點的廣泛調(diào)節(jié)。因此我們很難掌握中藥起效的全部作用機制[4]。在現(xiàn)代生物科學(xué)背景下，闡明中藥的作用機制就變得很有必要。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的水平上闡明中藥的作用機制[5]，為多靶點藥物發(fā)現(xiàn)提供有益的啟示和借鑒。

三才封髓丹組方中含有熟地黃、黨參、黃柏、天冬、肉蓯蓉、砂仁、甘草[6]。方中黨參甘、溫，益氣健脾；熟地黃甘、微溫，補腎滋陰；天冬甘、寒，養(yǎng)陰清肺，潤燥生津；黃柏入腎，藥性苦寒，可清熱燥濕、瀉火解毒；砂仁辛、溫，行滯醒脾，兼潤腎燥；甘草甘、溫，補氣緩急、調(diào)和諸藥，既助黨參寧神益氣，又調(diào)和黃柏、砂仁之寒溫。合方使水火既濟，相火不再妄動。桑鳳梅等[7]做過三才封髓丹治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的療效觀察，結(jié)果顯示有較好的治療作用。有研究顯示，三才封髓丹能夠增強小白鼠的免疫系統(tǒng)功能[8]。另有研究結(jié)果顯示，三才封髓丹能夠有效調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群及相關(guān)炎癥因子水平[9]。本文將運用分子層面的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對組方進行相關(guān)性分析，以期得到組方中針對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍具體的藥物作用靶點和作用機制。

1 資料與方法

1.1 TCMSP數(shù)據(jù)庫成分篩選

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫[10]獲得藥物成分信息，包括此味藥包含多少種成分、分子名稱（molecule name）、分子質(zhì)量（MW）、脂水分配系數(shù)（AlogP）、氫鍵供體數(shù)（Hdon）、氫鍵受體數(shù)（Hacc）、口服生物利用度（OB）、腸上皮滲透率（Caco-2）、血腦屏障（BBB）、藥物相似性（DL）、藥物半衰期（HL）等。

1.2 藥物有效成分篩選

藥物在體內(nèi)吸收代謝的過程會有多種小分子物質(zhì)參與，借助ADME[11-12]參數(shù)來篩選有效小分子。ADME數(shù)據(jù)來源于TCMSP數(shù)據(jù)庫。ADME參數(shù)包括OB、DL及HL等。本分析使用主要常規(guī)參數(shù)進行藥物成分篩選，閾值定為OB≥30%、DL≥0.18。

1.3 成分靶蛋白預(yù)測篩選

TCMSP結(jié)合BATMAN數(shù)據(jù)庫[13-14]可以將小分子對應(yīng)的靶蛋白進行一個預(yù)估。BATMAN數(shù)據(jù)庫預(yù)估其中的小分子代謝的潛在靶點，給出DrugBank、KEGG、TTD數(shù)據(jù)庫中的靶標(biāo)，然后將靶標(biāo)排序。BATMAN將藥物靶向預(yù)測作為一個二元分類問題，建立了區(qū)分藥物靶向相互作用的預(yù)測模型。對于每個查詢藥物-蛋白質(zhì)相互作用，將分類特征的特征值定義為該查詢相互作用與所有已知藥物-目標(biāo)相互作用（即金標(biāo)準(zhǔn)陽性數(shù)據(jù)集）之間的相似性得分中最大的特征值。兩種藥物靶向相互作用的相似性是其DL得分與靶向相似性得分的乘積。

1.4 靶蛋白交叉驗證

從CTD中搜索“oral ulcer”相關(guān)基因，并根據(jù)inference score[15-16]排序，將得分20以上的與上一步所預(yù)測的靶蛋白取交集進行篩選以縮小靶蛋白范圍，inference score是通過兩個公共鄰域統(tǒng)計數(shù)據(jù)的對數(shù)轉(zhuǎn)換積計算而來，用以評估蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中蛋白之間的功能相關(guān)性。DisGeNET數(shù)據(jù)庫包含628 685個基因-疾病關(guān)系，17 549個基因及24 166種疾病。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中以“oral ulcer”為關(guān)鍵詞搜索相關(guān)基因。數(shù)據(jù)庫中疾病-基因關(guān)聯(lián)的依據(jù)參數(shù)包括diseases （number of diseases/phenotypes associated to this gene）， DSI（disease specificity index for the gene）， DPI（disease pleiotropy index for the gene）， PLI （probability of being loss of function intolerant）， score （gene-disease association score）等。

1.5 篩選出來的成分進行GO功能和信號通路分析

通過Cytoscape的插件和ClueGO+ CluePedia[17]語言進行GO[18]功能網(wǎng)絡(luò)研究，構(gòu)建大小適合的網(wǎng)絡(luò)，每簇選取10個以上基因，并用Cytoscape做靶蛋白功能網(wǎng)絡(luò)圖。ClueGO插件算法中，由于GO樹（有向無環(huán)圖）結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，GO項可以分為若干層次。在使用沒有層次結(jié)構(gòu)（KEGG，BioCarta）的數(shù)據(jù)的情況下，將其級別指定為-1。第一個GO級別（1～3），GO數(shù)據(jù)非常常見，有很多相關(guān)基因，這些條目提供一般的生物學(xué)信息；GO級別9～14開始為特定術(shù)語，只有很少的相關(guān)基因，但是信息量大、更具研究價值。Kappa系數(shù)[19]用于一致性檢驗，也可以用于衡量分類精度，但Kappa系數(shù)的計算是基于混淆矩陣的。ClueGO插件中，Kappa系數(shù)顯示了基于重疊基因的GO術(shù)語之間的關(guān)系，基于Kappa系數(shù)對GO功能進行分組。Kappa系數(shù)越高，術(shù)語關(guān)聯(lián)強度越強。

1.6 得出的靶蛋白進行互作的研究

通過登錄以下網(wǎng)址http：//www.string-db.org/的數(shù)據(jù)庫[20]進行PPI分析，將combined scoregt;0.4作為蛋白的閾值。得到PPI關(guān)系對文件后，運用Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 篩選中藥的成分

通過篩選得到信息如下：黨參134種，黃柏140種，肉蓯蓉75種，砂仁165種，熟地黃76種，天冬32種，甘草280種，見表1。

2.2 成分靶蛋白預(yù)測篩選及交叉驗證

通過BATMAN的工具得到預(yù)測結(jié)果，最終有草藥的相關(guān)靶標(biāo)。每種成分篩選出得分大于20的靶標(biāo)，得到共862個靶標(biāo)。對上述靶標(biāo)與CTD數(shù)據(jù)庫中以“oral ulcer”關(guān)鍵詞相關(guān)inference score大于20的基因及DisGeNet數(shù)據(jù)庫中“oral ulcer”相關(guān)的基因取交集，最終得到73個交集相關(guān)靶標(biāo)。其中存在于CTD數(shù)據(jù)庫的有71個，存在于DisGeNet數(shù)據(jù)庫的有7個，有5個在兩個疾病數(shù)據(jù)庫中都有記錄，分別為TNF、CAT、FAS、IL10、EDN1。見圖1。

2.3 交叉靶蛋白GO功能、信號通路分析

對交叉靶標(biāo)行GO功能分析，共富集到28條GO功能，根據(jù)Kappa系數(shù)將功能分為了8類。8類主要功能為外源性凋亡信號通路的負調(diào)控、炎癥反應(yīng)、細胞位置維持、活性氧代謝過程、JAK-STAT對受體信號通路的正調(diào)控、平滑肌細胞增殖的調(diào)控、類固醇代謝過程、脂多糖響應(yīng)。經(jīng)查閱文獻分析口腔潰瘍主要為炎癥反應(yīng)，對應(yīng)的功能基因包括ADA，CCL3，F(xiàn)2，GGT1，GPX1，IGF1，IL10，IL1B，IL4，NFKB1，NOS2，NR1H4，NT5E，PPARD，PTGIS，PTGS2，S100A9，SERPINE1，TNF。對交叉靶蛋白基因通過clusterProfiler進行通路富集分析，共富集到224條顯著通路，其中P值小于0.01且富集基因個數(shù)大于等于10的通路14條，表明靶蛋白主要通過JAK-STAT信號通路、細胞因子-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路等通路作用，而篩選出來的炎癥反應(yīng)功能基因可能通過作用于這些信號通路達到治療口腔潰瘍的目的。見圖2、3、4。

2.4 靶蛋白相互作用分析

圖5中的圓點代表了交叉驗證的靶蛋白信息。top10的連接度如表2中所述，連接度越高代表蛋白越關(guān)鍵，即為潛在的樞紐蛋白。

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于草藥-成分-靶蛋白-通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)。最終構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)共122個節(jié)點，363條關(guān)系對，其中化學(xué)成分節(jié)點27個，靶蛋白節(jié)點73個，通路相關(guān)靶蛋白節(jié)點35個，通路節(jié)點17個。

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究三才封髓丹治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的機制，通過數(shù)據(jù)庫篩選得到有效的小分子，找到對應(yīng)的靶蛋白，通過信號通路富集將對應(yīng)的靶蛋白（基因）直接映射到通路上，通過藥物靶點富集的通路找到了藥物的調(diào)控通路。最后共55個靶蛋白顯著富集28條GO功能術(shù)語中，歸類后主要分為8類通路。確定口腔潰瘍最有可能涉及的炎癥反應(yīng)通路中涉及的功能基因有19個，為ADA，CCL3，F(xiàn)2，GGT1，GPX1，IGF1，IL10，IL1B，IL4，NFKB1，NOS2，NR1H4，NT5E，PPARD，PTGIS，PTGS2，S100A9，SERPINE1，TNF。位于圖4氣泡圖中展示功能基因作用主要富集在JAK-STAT信號通路、細胞因子-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路等通路，有多個通路在口腔潰瘍信號通路上都屬于首次報道，靶點信息有極大的分析意義。另未于氣泡圖中展示的包括NF-kappa B signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway等炎癥免疫相關(guān)通路，矯正P值均小于0.01。有研究表明NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的易感性有關(guān)[21]。本文通過網(wǎng)絡(luò)信號通路再次驗證該結(jié)論，這三條通路相關(guān)基因后續(xù)可以分析研究。通過靶蛋白相互作用分析列出了前10位相關(guān)的關(guān)鍵蛋白因子。最后構(gòu)建出草藥-成分-靶蛋白-通路-炎癥表型-疾病這樣一條線。篩選的靶點網(wǎng)絡(luò)中有靶蛋白（genes）若干個，都是比較明確的免疫通路靶蛋白。

通過本文的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建最后將三才封髓丹中的小分子和復(fù)發(fā)性口腔潰瘍對應(yīng)的關(guān)鍵靶蛋白交叉驗證，梳理出了化學(xué)成分節(jié)點27個，靶蛋白節(jié)點73個，其中通路相關(guān)靶蛋白節(jié)點35個，通路節(jié)點17個。初步驗證了該方治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的藥理作用及相關(guān)機制，為今后進一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-12-05） （本文編輯：陳韻）