郭寧，孫華，馬紅霞，劉樹森，張海劍，石潔，鄭曉娟，董躍廣

玉米腐霉莖腐病生防木霉菌株的篩選、鑒定及防治效果分析

郭寧，孫華，馬紅霞，劉樹森，張海劍，石潔，鄭曉娟，董躍廣

河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治技術(shù)創(chuàng)新中心/河北省作物有害生物綜合防治國際科技聯(lián)合研究中心，河北保定 071000

【目的】篩選對玉米腐霉莖腐病病原菌具有抑制作用的木霉（spp.）菌株，明確其分類地位以及對腐霉莖腐病的防治效果和抑菌機(jī)理，為腐霉莖腐病生防制劑的研發(fā)提供菌種資源?！痉椒ā坎捎镁z生長速率法測試候選木霉菌株對腫囊腐霉（）、強(qiáng)雄腐霉（）和芒孢腐霉（）的抑制作用，篩選拮抗菌株；通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性確定Tr21菌株的分類地位；采用常規(guī)抑菌方法觀察Tr21對腐霉菌絲形態(tài)的影響；采用溴化丙啶（PI）染液檢測法及對不同處理時間菌絲上清液中蛋白和核酸吸光值的檢測，分析Tr21發(fā)酵液對腐霉菌細(xì)胞膜通透性的影響；通過不同濃度Tr21發(fā)酵濾液浸種試驗(yàn)，檢測Tr21發(fā)酵濾液對玉米種子發(fā)芽性狀的影響；通過溫室盆栽試驗(yàn)和田間人工接種試驗(yàn)，明確Tr21對腐霉莖腐病的防治效果。【結(jié)果】從實(shí)驗(yàn)室保存的109株木霉菌中，篩選到7株木霉菌對腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉具有拮抗活性，抑制率均＞60%，其中Tr21菌株對3種腐霉菌的抑制率達(dá)到100%，其5×、10×和20×稀釋液對3種腐霉菌的抑制率均達(dá)到100%。50×稀釋液對3種腐霉菌的最低抑制率也達(dá)到55.56%。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，Tr21為非洲哈茨木霉（）。顯微鏡觀察顯示Tr21發(fā)酵濾液能夠造成腐霉菌菌絲變粗、菌絲分枝增多、節(jié)點(diǎn)縮短、斷裂、內(nèi)含物溢出等畸形現(xiàn)象。PI熒光染色試驗(yàn)顯示Tr21發(fā)酵濾液導(dǎo)致3種腐霉菌的細(xì)胞膜受損，PI染液更易穿透受損的細(xì)胞膜進(jìn)入到菌絲體內(nèi)，使菌絲染成紅色。核酸、蛋白泄露試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵濾液處理過的菌絲吸光值變化較大，處理5 h后，腫囊腐霉、芒孢腐霉和強(qiáng)雄腐霉菌絲的OD260均增加了0.08，OD280分別增加了0.10、0.11和0.10，表明腐霉菌菌絲細(xì)胞膜受損或其完整性被破壞，導(dǎo)致菌絲內(nèi)含物外溢。不同濃度Tr21發(fā)酵濾液對玉米種子的發(fā)芽性狀無影響，且當(dāng)Tr21發(fā)酵濾液濃度為20×稀釋液時對玉米種子的萌發(fā)和生長促進(jìn)效果最好。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，Tr21發(fā)酵濾液濃度為5×稀釋液時，對3種腐霉莖腐病的室內(nèi)防治效果最佳，分別為60.67%、63.15%和59.66%。用Tr21的5×稀釋液進(jìn)行種子處理，當(dāng)藥種質(zhì)量比例為1﹕100時，對腐霉莖腐病的防治效果最高，達(dá)82.25%?！窘Y(jié)論】獲得一株有效防治玉米腐霉莖腐病的木霉菌株Tr21，經(jīng)鑒定該菌為非洲哈茨木霉，該菌株發(fā)酵濾液可導(dǎo)致腐霉菌菌絲畸形、斷裂、細(xì)胞膜受損、內(nèi)含物溢出等，是一株具有開發(fā)前景的生防微生物。

腐霉菌；莖腐?。挥衩?；非洲哈茨木霉；生物防治

0 引言

【研究意義】玉米莖腐?。╯talk rot）是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種重要病害，在我國各玉米種植區(qū)均有發(fā)生，不僅造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，該病害造成的倒伏玉米還會增加穗腐病發(fā)生機(jī)率[1]，嚴(yán)重影響玉米品質(zhì)。玉米莖腐病的病原菌種類繁多，目前已報道的有30種[2]，這些病原菌單獨(dú)或復(fù)合侵染導(dǎo)致玉米莖腐病發(fā)生[3]。我國莖腐病主要病原菌為鐮孢菌（spp.）和腐霉菌（spp.）[4]。腐霉莖腐病發(fā)生在玉米生育后期，受環(huán)境影響較大，病害一旦發(fā)生，沒有有效的田間控制措施，一般發(fā)生年份腐霉莖腐病田間發(fā)病率為5%—10%，重發(fā)年份田間發(fā)病率可達(dá)20%—30%，部分感病品種的發(fā)病率可高達(dá)40%—80%[5-6]，因此，針對腐霉莖腐病的防治工作至關(guān)重要。目前防治方法主要為種植抗病品種、化學(xué)防治和生物防治。種植抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、有效的措施，但玉米品種間對腐霉莖腐病的抗性差異較大，高抗品種稀缺。同時生產(chǎn)中針對腐霉莖腐病的化學(xué)藥劑防治效果欠佳，目前主要采取含精甲霜靈成分的化學(xué)種衣劑和增施鉀肥來減少病害發(fā)生。隨著化學(xué)農(nóng)藥的長期和大量使用而引起的環(huán)境和抗藥性等問題日益凸顯。因此，開發(fā)高效、安全的生物防治產(chǎn)品是防治腐霉莖腐病的重要途徑。【前人研究進(jìn)展】生物防治是以具有防病和促生作用的微生物作為生防因子來防治植物病害。近年來，以其安全、高效的優(yōu)勢逐漸受到重視，成為替代化學(xué)防治的重要措施。目前報道的生防微生物主要包括木霉菌（spp.）[7]、芽孢桿菌（spp.）[8]、假單胞菌（spp.）[9]和鏈霉菌（spp.）[10]等。但在腐霉莖腐病的防治中可應(yīng)用的生防資源較少，陳捷等[7,11]利用假單胞菌P6拌種和綠色木霉（）T3穴施+假單胞菌P6拌種進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這兩個處理對玉米苗期腐霉莖腐病的防治效果分別為52.87%和58.15%。李紅磊等[12]分離到的生防細(xì)菌K3-3對禾生腐霉（）引起的莖腐病的室內(nèi)盆栽防治效果為54.29％；生防細(xì)菌K18-5對腫囊腐霉（）引起的莖腐病的盆栽防治效果為35.71%。任學(xué)祥等[13]用產(chǎn)酶溶桿菌（）菌株OH11制備種衣劑，藥種比為1﹕200時對玉米莖基腐病的室內(nèi)盆栽防治效果達(dá)93.55%，1﹕500時防治效果達(dá)80.51%。郭成等[14]分離鑒定出短密木霉（）菌株GAS1-1，對腫囊腐霉的平板抑制率為100%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對腐霉莖腐病的防治研究主要集中于玉米抗病品種和種質(zhì)資源篩選、基因挖掘及種質(zhì)創(chuàng)新等方面[5-6,15-21]，關(guān)于腐霉莖腐病生物防治的研究報道較少，對該病害生防資源的發(fā)掘及防病、促生潛力的研究較為缺乏，而用木霉代謝物防治腐霉莖腐病的研究幾乎沒有被涉及。引起腐霉莖腐病的病原較多[3,22]，單一病原菌的防治會出現(xiàn)地域局限性以及病原菌產(chǎn)生抗性的風(fēng)險，目前，未見對多種腐霉莖腐病病原菌同時開展生物防治的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉（）和芒孢腐霉（）為靶標(biāo)，篩選對腐霉莖腐病菌具有拮抗作用的木霉菌株，明確其分類地位，評價其對由3種腐霉菌引起的莖腐病的室內(nèi)、大田防治效果，淺析防病機(jī)理，為該病害生防菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年3月至2023年7月在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所和河北省衡水市饒陽實(shí)驗(yàn)基地完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：供試木霉菌株和芒孢腐霉由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米綜合防治研究室分離保存，腫囊腐霉和強(qiáng)雄腐霉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所段燦星老師惠贈。

供試玉米品種為鄭單958；S紅成膜劑由北農(nóng)（海利）涿州種衣劑有限公司提供。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖15 g、瓊脂粉12 g、蒸餾水1 L；玉米粒培養(yǎng)基：玉米粒清洗，水泡12 h后，裝入滅菌袋中高壓滅菌30 min。

腐霉菌玉米粒培養(yǎng)物的制備：將腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉3種腐霉菌分別在PDA平板上培養(yǎng)5 d，用滅菌的手術(shù)刀將帶菌的培養(yǎng)基劃成小塊，置于250 mL無菌水中，搖勻后按3%（v/w）比例將3種腐霉菌液分別接種于玉米粒培養(yǎng)基中，28 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)7—10 d，即為腐霉菌玉米粒培養(yǎng)物。

1.2 木霉拮抗菌株的篩選

采用菌絲生長速率法測試木霉菌株對玉米腐霉莖腐病病原菌的抑制作用。將活化后的木霉菌、腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉分別在PDA平板上培養(yǎng)5 d至菌落生長充分，在木霉菌邊緣用直徑0.5 cm的打孔器打取菌餅10個，接種于含有100 mL PD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)5 d，用滅菌的紗布過濾菌絲體，得到的液體經(jīng)0.22 μm微孔濾膜二次過濾，得到木霉菌發(fā)酵濾液備用。將得到的發(fā)酵濾液按10%的體積比加入到PDA培養(yǎng)基中，制成平板，平板中心接種腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉的新鮮菌餅（直徑0.5 cm），以添加等量PD的PDA平板為對照，每處理重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待對照平板布滿菌絲后，用十字交叉法測量各處理菌落直徑，并計算抑制率。

抑制率（%）＝100×（對照病原菌的菌落直徑-處理病原菌的菌落直徑）/（對照病原菌的菌落直徑-0.5 cm）。

1.3 不同濃度Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌的抑制作用

按1.2方法得到Tr21發(fā)酵濾液。將發(fā)酵濾液按不同體積比加入到PDA培養(yǎng)基中，制成平板，使平板中發(fā)酵液的終濃度為5×、10×、20×、50×和100×稀釋液。平板中心接種腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉的新鮮菌餅（直徑0.5 cm），以添加等量PD的PDA平板為對照，每處理重復(fù)3次。將接種后的平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待對照平板布滿菌絲后，用十字交叉法測量各處理菌落直徑，并計算抑制率。

1.4 Tr21菌株的種類鑒定

形態(tài)鑒定：用打孔器在Tr21菌落邊緣打取直徑為0.5 cm的菌餅置于PDA平板上，于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)皿上菌落的生長速度、顏色變化等特征。待菌落培養(yǎng)3—5 d后，挑取菌株Tr21菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子以及孢子梗的顏色、形狀、數(shù)量、大小等特征。

分子鑒定：采用CTAB法提取Tr21的總DNA。分別利用引物EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTT CGAGAAGG-3′）[23]/TEF1LLErev（5′-AACTTGCAGG CAATGTGG-3′）[24]，引物5F（GAYGAYMGWG ATCAYTTYGG）[25]/7CR（CCCATRGCTTGYTTRC CCAT）[25]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：DNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，退火溫度分別為53 ℃（引物EF1-728F和TEF1LLErev）和51 ℃（引物5F和7CR），時間均為30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比對，同時選取與該序列同源性較高的已知序列信息，利用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原菌的分類地位。

1.5 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌菌絲生長的影響

按1.3方法制備Tr21發(fā)酵濾液平板，使發(fā)酵液在PDA中的終濃度為50×稀釋液，將培養(yǎng)5 d的腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉菌餅（直徑0.5 cm）接種于平板中心，28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，3 d后觀察Tr21無菌發(fā)酵液50×稀釋液對3種腐霉菌絲生長的影響。

1.6 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌細(xì)胞膜通透性的影響

采用溴化丙啶（PI）染液檢測法[26]：將腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉的菌餅（直徑0.5 cm）接于無菌培養(yǎng)皿中央，加入10 mL PDB培養(yǎng)液，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用生理鹽水輕輕沖洗菌絲2—3次，加入用生理鹽水稀釋50×的Tr21發(fā)酵濾液于28 ℃培養(yǎng)箱中處理4 h；輕輕吸出Tr21稀釋液，加入10 mL 2.5 μg·mL-1的PI染液，在避光條件下染色15 min，然后用生理鹽水沖洗菌絲表面的染液，立即于熒光顯微鏡下觀察菌絲的染色情況。以不含Tr21無菌發(fā)酵液的生理鹽水為對照。

1.7 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌核酸、蛋白泄露的影響

根據(jù)核酸和蛋白分別在260和280 nm處有最大吸收值的原理進(jìn)行菌絲上清液中核酸和蛋白濃度的檢測，檢測分析參照李明通等[26]的方法：按1.6的方法獲得用生理鹽水清洗過的腐霉菌菌絲，置于含Tr21無菌發(fā)酵液50×稀釋液（用生理鹽水稀釋）中處理，在0、1、2、3、4、5 h時分別取樣，整個過程需在低溫下操作，用酶標(biāo)儀檢測各處理在260和280 nm處吸光值。

1.8 Tr21發(fā)酵濾液對玉米種子生長性狀的影響

按1.2方法得到Tr21發(fā)酵濾液。對玉米種子生長性狀的影響參照張婷[27]的方法，具體如下：將Tr21發(fā)酵濾液用無菌水分別稀釋成2×、5×、10×、20×、50×、100×、200×、500×后備用。挑選大小一致、健康的鄭單958種子，75%酒精消毒30 s，2%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水洗滌3次后用滅菌濾紙吸取種子表面水分，然后將消毒后的種子加入到上述不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液中浸泡3 h，取出后于超凈工作臺中自然晾干，置于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于28 ℃中培養(yǎng)48 h后加入適量無菌水，然后置于28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)10顆玉米種子。待發(fā)芽后，測量不同處理的發(fā)芽率。7 d后，測量胚芽、胚根長度以及根的數(shù)量。

1.9 Tr21發(fā)酵濾液對苗期腐霉莖腐病的抑制效果

按1.2方法得到Tr21發(fā)酵濾液，并將其稀釋5×、20×、100×備用。將土、草炭和蛭石按照7﹕2﹕1體積比混合均勻，121 ℃濕熱滅菌2 h得無菌基質(zhì)。按1.8的方法進(jìn)行玉米種子消毒。將Tr21不同濃度的發(fā)酵濾液浸泡消毒的種子3 h，以浸泡在無菌水中的鄭單958種子為對照，晾干后備用。接種方法：每盆中放入腐霉菌玉米粒30—40 g，然后在含病菌的基質(zhì)上覆蓋3 cm的無菌基質(zhì)，再置入5粒浸泡過的玉米種子，最后覆土。20 d后調(diào)查各處理發(fā)病級別，計算防治效果。苗期腐霉菌莖腐病分級標(biāo)準(zhǔn)參照晉齊鳴等[28]的方法。病情指數(shù)及防治效果的計算方法如下：病情指數(shù)=100×∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）；防治效果（%）=100×（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)。

1.10 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉莖腐病的田間防治效果

菌株Tr21田間防效試驗(yàn)在河北省衡水市饒陽縣溫室大棚進(jìn)行，試驗(yàn)于2023年3月中旬播種，5月份撤去蓋棚塑料膜，其他管理與田間一致。按1.2方法得到Tr21發(fā)酵濾液，將Tr21發(fā)酵濾液稀釋5×，按發(fā)酵濾液與成膜劑4﹕1比例，將成膜劑加入到發(fā)酵濾液中，混合均勻后得到Tr21包衣劑備用。試驗(yàn)設(shè)4個處理，將包衣劑與玉米種子按藥種質(zhì)量比1﹕50、1﹕100和1﹕200進(jìn)行包衣，以不包衣玉米為空白對照。試驗(yàn)小區(qū)采取隨機(jī)排列，小區(qū)平均面積30 m2，每處理3次重復(fù)。采用根埋法進(jìn)行人工接種，具體方法：在接種當(dāng)天，將提前制備的3種腐霉菌的玉米粒培養(yǎng)物按質(zhì)量比1﹕1﹕1進(jìn)行混合均勻備用，在玉米11—12葉期，刨開植株根部表土，在近根部處撒放20—30 g混合后的帶菌玉米粒后覆土。于玉米乳熟期調(diào)查發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病率和防治效果。發(fā)病率（%）=100×發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)；防治效果（%）=100×（對照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/對照發(fā)病率。

2 結(jié)果

2.1 玉米腐霉莖腐病拮抗木霉菌株的篩選

將保存的109株木霉菌株編號為Tr1—109。通過菌絲生長速率法測試候選木霉菌株對腐霉莖腐病菌的抑制作用，結(jié)果表明只有7株木霉對3種腐霉菌同時具有拮抗活性，抑制率均＞60%（結(jié)果未列出）。其中菌株Tr21的抑菌效果最好，對3種腐霉菌的抑制率均達(dá)到100%。

2.2 不同濃度Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌的抑制作用

Tr21不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵濾液對腐霉菌的抑制效果如圖1所示。Tr21菌株發(fā)酵濾液的5×、10×和20×稀釋液對3種腐霉菌的抑制率均達(dá)到100%（表1）。50×稀釋液對3種腐霉菌的抑制率也達(dá)到50%以上，分別為69.11%、76.00%和55.56%。100×稀釋液的抑制率有所下降，其中對強(qiáng)雄腐霉的抑制率最高，為50.22%，表明Tr21發(fā)酵濾液中存在的拮抗物質(zhì)活性較高。

表1 Tr21不同濃度發(fā)酵濾液對3種腐霉菌的抑制率

數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著Different lowercases after the data indicate significantly different among the treatments (＜0.05)。下同The same as below

2.3 Tr21菌株的種類鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定 Tr21菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，氣生菌絲生長迅速。菌落圓形，初期為白色，逐漸變成綠色。菌絲絲狀，較細(xì)長，呈棉絮狀，從中心向四周輻射狀生長。分生孢子梗呈燒瓶形至安瓿形，中間膨大，頂端最細(xì)并可產(chǎn)孢，瓶梗細(xì)胞單生或2—5個輪生。分生孢子呈球形或橢球形，單細(xì)胞，表面光滑，淡綠色，老熟后呈深綠色（圖2）。通過以上菌種的形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定其為木霉菌屬中的一種。

圖2 Tr21菌株形態(tài)

Fig 2 morphology of Tr21 strain

2.3.2 分子鑒定 對Tr21菌株的和進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1 280和1 143 bp。將獲得的Tr21序列和序列在GenBank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tr21與非洲哈茨木霉（）菌株Z19的基因序列親緣關(guān)系最近（圖3），同源性為99.84%；與非洲哈茨木霉菌株Tri-1的序列的親緣關(guān)系最近（圖4），同源性為99.74%。利用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，Tr21與非洲哈茨木霉聚合到一起，說明Tr21屬于木霉屬非洲哈茨木霉。

根據(jù)Tr21菌株的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征、序列和序列分析結(jié)果，將其鑒定為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、黏孢菌類的木霉屬真菌非洲哈茨木霉。

2.4 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌菌絲生長的影響

通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，50×稀釋液處理的腐霉菌菌絲明顯增粗、菌絲分枝增多、節(jié)點(diǎn)縮短，部分菌絲外壁粗糙、扭曲，部分菌絲斷裂導(dǎo)致內(nèi)含物溢出。對照組菌絲光滑均勻，生長正常（圖5）。

2.5 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌細(xì)胞膜通透性的影響

腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉菌絲經(jīng)Tr21發(fā)酵濾液50×稀釋液處理后，經(jīng)過PI染液染色，結(jié)果如圖6所示，3種腐霉菌的菌絲均被染成紅色，染色面積與明場視野下菌絲的面積幾乎相同，而空白對照則只有少量菌絲被染成紅色。表明非洲哈茨木霉Tr21發(fā)酵濾液可造成腐霉菌菌絲的細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致其通透性增強(qiáng)，甚至破壞其完整性，從而使PI染液更易穿透受損的細(xì)胞膜進(jìn)入到菌絲體內(nèi)。

圖3 根據(jù)Ef-1α序列獲得的Tr21菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 根據(jù)RPB2序列獲得的Tr21菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

A：菌絲畸形Mycelial deformity；B：菌絲斷裂，黑色箭頭指示菌絲斷裂，內(nèi)含物溢出Mycelial rupture, the black arrow indicatesthe mycelia rupture, and overflow of mycelia contents

圖6 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌細(xì)胞膜通透性的影響

2.6 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌核酸、蛋白泄露的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌細(xì)胞膜通透性的影響，檢測了3種腐霉菌菌絲經(jīng)Tr21發(fā)酵濾液50×稀釋液處理不同時間的核酸和蛋白濃度，結(jié)果如圖7所示，隨著處理時間的延長，腫囊腐霉、芒孢腐霉和強(qiáng)雄腐霉空白對照組結(jié)果比較平穩(wěn)，處理5 h后OD260分別增加了0.03、0.02和0.02；OD280分別增加了0.03、0.02和0.03。而用發(fā)酵液處理過的菌絲吸光值變化較大，處理5 h后，腫囊腐霉菌絲OD260和OD280分別增加0.08和0.10，芒孢腐霉菌絲OD260和OD280分別增加0.08和0.11，強(qiáng)雄腐霉菌絲OD260和OD280分別增加0.08和0.10。

圖7 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉菌核酸（A）和蛋白（B）泄露的影響

2.7 Tr21發(fā)酵濾液對玉米種子發(fā)芽性狀的影響

由表2可知，不同濃度Tr21發(fā)酵濾液浸泡的玉米種子的發(fā)芽率、胚芽和胚根長度以及根系數(shù)量均高于對照，表明Tr21發(fā)酵濾液對玉米種子發(fā)芽生長無影響，對玉米具有較高的安全性。從表中可以看出，當(dāng)Tr21發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)為20×?xí)r，對玉米種子的發(fā)芽和生長效果最佳，其胚芽長度、胚根長度和根總數(shù)分別較CK提高了38.82%、70.53%和57.84%，選用該濃度進(jìn)行防效試驗(yàn)，同時結(jié)合2.2試驗(yàn)結(jié)果，選用高濃度5×稀釋液和低濃度100×稀釋液為對照進(jìn)行防效試驗(yàn)。

2.8 Tr21發(fā)酵濾液對苗期腐霉莖腐病的室內(nèi)防治效果

在溫室條件下測定了Tr21發(fā)酵濾液5×、20×和100×稀釋液對苗期腐霉莖腐病的防治效果，結(jié)果表明（表3）Tr21不同濃度發(fā)酵液對腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉引起的苗期莖腐病均有一定的防治效果，其中濃度為5×稀釋液時，對3種腐霉菌莖腐病的防治效果最好，分別為60.67%、63.15%和59.66%。

2.9 Tr21發(fā)酵濾液對腐霉莖腐病的田間防治效果

用Tr21發(fā)酵濾液的5×稀釋液按不同比例包衣玉米，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對照田玉米全株葉片變黃、變枯，果穗下垂，莖基部1—3節(jié)莖稈變成黃褐色，手捏變軟（圖8）；統(tǒng)計結(jié)果表明（表4），3個包衣比例腐霉莖腐病的發(fā)病率均低于對照，對腐霉莖腐病均有一定的防治效果，其中包衣比例為1﹕100時，植株仍為綠色，僅邊緣變黃，果穗正常，莖基部莖稈綠色、堅硬（圖8），其對腐霉莖腐病的防治效果最高，為82.25%，另外兩個包衣比例對該病的防治效果差異不明顯，分別為43.97%和49.13%。

表3 Tr21發(fā)酵濾液對苗期腐霉莖腐病的室內(nèi)防治效果

表4 Tr21發(fā)酵濾液不同包衣比例對腐霉莖腐病的田間防治效果

3 討論

3.1 發(fā)掘腐霉莖腐病生防資源的重要性

腐霉莖腐病具有突發(fā)性強(qiáng)和防治困難等特點(diǎn)，尤其在玉米生長后期，如果雨水較多，可在極短的時間內(nèi)導(dǎo)致病害流行，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來毀滅性的經(jīng)濟(jì)損失，因此該病的預(yù)防工作極其重要。木霉菌作為重要的生防資源，已廣泛應(yīng)用于多種作物的病害防治，在玉米莖腐病的生物防治中也發(fā)揮了極其重要的作用，但由于莖腐病的病原菌組成復(fù)雜，木霉菌大都以鐮孢菌作為防治對象[29]，以腐霉菌為靶標(biāo)菌的研究報道甚少。由于腐霉菌莖腐病病原菌種類較多[22]，本研究在篩選生防菌的過程中，以腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉為靶標(biāo)，篩到一株非洲哈茨木霉Tr21，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵濾液對3種腐霉菌均具有較強(qiáng)的抑制活性，證實(shí)了非洲哈茨木霉Tr21對腐霉莖腐病的防治效果較為明顯，豐富了腐霉莖腐病生防種質(zhì)資源，也拓展了非洲哈茨木霉的應(yīng)用領(lǐng)域。

3.2 非洲哈茨木霉Tr21的拮抗作用

木霉菌能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，包括多種非揮發(fā)性和揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物，可抑制多種病原菌的生長[30]，分泌抑菌性代謝產(chǎn)物是其發(fā)揮生防作用的重要機(jī)制之一。這些抗菌物質(zhì)主要包括膠霉毒素、吡喃酮、萜類化合物和抗菌肽等。如綠木霉（）TY009產(chǎn)生的代謝物膠霉毒素，不僅對水稻紋枯病菌（）菌絲和菌核萌發(fā)有顯著的抑制作用，對稻瘟病菌（）孢子萌發(fā)、附著胞形成和稻曲病菌（）孢子萌發(fā)、次生孢子形成均有顯著的抑制作用[31]。綠色木霉（）LTR-2產(chǎn)生的吡喃酮類物質(zhì)5,6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮在20 mg·L-1的濃度下對禾谷絲核菌（）和立枯絲核菌（）等11種植物病原菌均有抑制作用[32]。哈茨木霉（）可產(chǎn)生抗菌肽，對水稻紋枯病菌、黃瓜立枯菌、稻瘟病菌的抑制效果較好[33]。同種木霉菌可以產(chǎn)生多種抗生物質(zhì)，如葦狀木霉（）3199菌株可通過產(chǎn)生對植物無毒性的倍半萜類化合物哈茨木霉素抑制多種病原真菌生長[34]，可產(chǎn)生聚酮類物質(zhì)抑制灰霉病菌（）[35]，還可產(chǎn)生抑菌的活性肽阿拉霉素[36]。研究表明，同種而不同來源的木霉菌株可產(chǎn)生不同的拮抗化合物[37]，如哈茨木霉可以產(chǎn)生聚酮類、抗菌肽等物質(zhì)[33,38]。不同生防菌中產(chǎn)生的同一化合物對病原菌的拮抗效果也不一樣，如漸綠木霉（）[37]、哈茨木霉[38]、綠色木霉[39]、康寧木霉（.）[40]均能產(chǎn)生6-戊基-2H-吡喃酮，該化合物對許多子囊菌和擔(dān)子菌有抑制活性，但抑菌效果存在差異。本研究中非洲哈茨木霉Tr21的發(fā)酵液對3種腐霉菌均有較好的抑制效果，其發(fā)酵液5×、10×和20×稀釋液的抑制率均達(dá)到100%，表明發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物對病原菌生長有抑制作用，但抗生性代謝物種類仍需進(jìn)一步探究。

用Tr21的發(fā)酵濾液處理腐霉菌菌絲，發(fā)現(xiàn)腐霉菌菌絲畸形、細(xì)胞壁受損導(dǎo)致通透性增強(qiáng)以及內(nèi)含物溢出等現(xiàn)象。據(jù)報道，木霉菌可產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶，導(dǎo)致其細(xì)胞壁溶解，如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶以及蛋白酶等[41]。但造成這一現(xiàn)象的原因，是細(xì)胞壁降解酶還是代謝物發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步研究。

3.3 應(yīng)用前景

目前國內(nèi)登記的24種木霉菌菌劑的有效成分均為菌株孢子，為活體制劑，生物活體制劑對環(huán)境條件要求較高，在田間應(yīng)用經(jīng)常受到土壤中土著微生物群落及土壤溫度、濕度、pH等外界因素的影響。施入土壤后，部分木霉菌活力會下降甚至死亡，從而導(dǎo)致定殖數(shù)量下降[42-43]，影響其生防作用的發(fā)揮。而利用微生物次級代謝產(chǎn)物抑菌，可以減輕對環(huán)境的依賴，保證生防效果的穩(wěn)定發(fā)揮，是生物防治中控制植物病害的有效手段，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的有效策略。本研究發(fā)現(xiàn)非洲哈茨木霉Tr21的發(fā)酵液包衣玉米對腐霉莖腐病有很好的防治效果，田間防效達(dá)到82.25%，是一株具有開發(fā)應(yīng)用潛力的生防菌株，今后的工作中應(yīng)研發(fā)以Tr21代謝產(chǎn)物為主要成分的種衣劑，為腐霉莖腐病新型殺菌劑的研發(fā)提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

從109份木霉菌株中篩選到對腫囊腐霉、強(qiáng)雄腐霉和芒孢腐霉均具有較高活性的菌株Tr21，該菌株的發(fā)酵濾液可導(dǎo)致腐霉菌菌絲畸形、斷裂、細(xì)胞膜受損、內(nèi)含物溢出等，經(jīng)鑒定Tr21為非洲哈茨木霉。室內(nèi)防治試驗(yàn)和田間人工接種試驗(yàn)均表明該菌株發(fā)酵液包衣玉米可有效抑制腐霉莖腐病的發(fā)生。

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Screening, identification and control efficacy analysis ofstrains against Maize Pythium stalk rot

GUO Ning, SUN Hua, MA HongXia, LIU ShuSen, ZHANG HaiJian, SHI Jie, ZHENG XiaoJuan, DONG YueGuang

Plant Protection Institute, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/IPM Innovation Center of Hebei Province/ International Science and Technology Joint Research Center on IPM of Hebei Province, Baoding 071000, Hebei

【Objective】The objective of this study is to screenstrains which have inhibitory effect on thespp. causing maize stalk rot, and to clarify their taxonomic status, control efficacy and antifungal mechanism. This study will provide important resources for the research and development of biocontrol agent against Pythium stalk rot.【Method】For the antagonistic strains screening, the inhibitory effect ofstrains on,andwas tested by measuring the mycelia growth. The taxonomic status of Tr21 was determined by morphological and molecular characteristics. The effect of Tr21 on the mycelia morphology ofspp. was observed in the laboratory. In order to analyze the effect of Tr21 fermentation broth on the membrane permeability ofspp., propyridine bromide (PI) dye solution was used to stain, and the absorbance values of protein and nucleic acid in mycelia supernatant at different treatment times were detected. The effect of Tr21 fermentation broth on germination characteristics of maize seeds was tested by seed soaking with different concentrations of fermentation broth. The control efficacy of Tr21 on stalk rot was confirmed through greenhouse pot and field inoculation experiments.【Result】From the 109 strains ofspp., seven strains were screened with antagonistic activity against,and, and the inhibition rate was above 60%. The inhibition rate of Tr21 to threespecies reached 100%, the inhibition rate of 5×, 10× and 20× diluent to threespecies reached 100%, andthe inhibition rate of 50× diluent to threespecies was also more than 55.56%. Tr21 strain was identified by morphological and molecular biology as. The results of microscopic observation showed that the fermentation broth of Tr21 could cause mycelial malformations, such as rough mycelia, increased mycelial branching, shortened nodes, and overflow of mycelia contents. The result of PI fluorescence stainshowed that the cell membrane of threespecies was damaged by Tr21 fermentation broth, and the PI dye was more likely to penetrate the damaged cell membrane into the mycelium and stain the mycelia red. The results of nucleic acid and protein leakage showed that the absorbance values of the mycelia treated by the fermentation broth changed greatly. After treatment for 5 h, the OD260increased by 0.08 and OD280increased by 0.10, 0.11 and 0.10, respectively, indicating that the membrane of the mycelia was damaged, leading to the overflow of mycelia contents. The different concentrations of Tr21 fermentation broth had no effect on the germination characteristics of maize seeds, and the 20× diluent had the best effect on germination and growth of seeds. The results of pot experiment showed that 5× diluted fermentation broth of Tr21 had the best control efficacy on Pythium stalk rot caused by threespecies, which was 60.67%, 63.15% and 59.66%, respectively. The control efficacy on Pythium stalk rot of 5× diluent was the highest, reaching 82.25%, with a mass ratio of 1﹕100 (5× diluent to seed).【Conclusion】An effectivestrain Tr21 was obtained for preventing and controlling of maize Pythium stalk rot. The fermentation broth of Tr21 can lead to mycelia malformation, breakage, cell membrane damage and contents leakage, etc. In conclusion, thestrain Tr21 is a promising biocontrol microbial.

; stalk rot; maize;; biological control

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.008

2023-08-02；

2023-08-27

河北省省級科技計劃（20326516D）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02）

郭寧，E-mail：guoning433@163.com。通信作者石潔，E-mail：shij99@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）