黃露文,朱麗萍,顏世敢

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學部,山東 濟南 250353

食用色素可以根據(jù)來源不同,分成天然色素和人工合成色素兩大類[1]。在以往的研究中,天然色素已經(jīng)被證明具有良好的著色性能和促進健康的作用,但運用于工業(yè)生產(chǎn)仍然存在著成本較高、來源有限等挑戰(zhàn)[2]。近年來,合成色素在食品工業(yè)中被廣泛應用,但所有的人工合成色素幾乎都不是營養(yǎng)物質,部分甚至有致癌危險。因此,天然色素再次回歸大眾的視野[3]。在天然色素中,天然藍色素出現(xiàn)的頻率遠低于紅色、綠色或黑色[4]。目前市面上所使用的藍色素,例如常被用來裝點食物的輝煌藍(FD&C Blue No.1)和靛青(FD&C Blue No.2)大多是由人工合成[5]。雖然在一定程度上這些人造藍色素被認為是安全的,但消費者無疑更喜歡天然的東西[6]。因此,從自然界中分離出稀有的天然藍色素,并找到大規(guī)模的生產(chǎn)方法具有重要的現(xiàn)實意義和巨大的市場前景[7]。

大多數(shù)天然色素是從植物組織中提取,但考慮到工業(yè)應用,這類原材料的獲取將受到眾多自然因素的制約[8]。近年來,利用微生物發(fā)酵代謝的方式獲取天然色素受到了廣泛關注[9]。然而,目前所研究的產(chǎn)色素的菌種中只有極少數(shù)能夠產(chǎn)生藍色素,所以開發(fā)新的生產(chǎn)藍色素的菌種是當今市場的一個主要需求[10]。本研究采用由實驗室保藏的藍色刺孢霉菌株在液態(tài)搖瓶培養(yǎng)條件下生產(chǎn)藍色素,并對其發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行系統(tǒng)優(yōu)化,旨在為天然藍色素的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所采用的藍色刺孢霉QY229為本實驗室保藏菌株;碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和果糖)、氮源(蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、酵母膏、牛肉膏和硝酸鈉)、瓊脂粉、無機鹽等試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA);種子培養(yǎng)基:40 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L MgSO4、1.0 g/L KH2PO4、pH為5.5～6.0。初始發(fā)酵培養(yǎng)基:60 g/L葡萄糖、30 g/L蛋白胨、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L MgSO4、1.0 g/L KH2PO4、pH為5.5～6.0。

取藍色刺孢霉QY229劃線接種到PDA斜面培養(yǎng)基,35 ℃下恒溫培養(yǎng)5～7 d。吸取5 mL無菌水反復沖洗斜面制備孢子懸浮液,并將其添加到30 mL的種子培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶),于32 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器(150 r/min)上培養(yǎng)48 h,獲得種子培養(yǎng)液。最后,以體積分數(shù)5%的接種量將種子培養(yǎng)液轉移到100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶),6層紗布封口,在32 ℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器(180 r/min)上培養(yǎng)6 d,獲得含藍色素的發(fā)酵液。

1.2.2 發(fā)酵液的預處理與色價測定方法

收集含藍色素的發(fā)酵液于4 ℃下離心20 min(6 000×g),棄去沉淀,上清液用蒸餾水定容至原發(fā)酵液體積。

參照已報道的方法進行發(fā)酵液色價的測定[11]。每毫升含藍色素的發(fā)酵上清液,稀釋合適倍數(shù)后,在pH為9,于580 nm下測定吸光度,吸光度值為0.1時相當于1個色素效價相對單位(U/mL),藍色素發(fā)酵液色價計算公式如下:

色價=總稀釋倍數(shù)×OD_580 nm。 (1)

1.2.3 單因素試驗設計

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分為基礎,添加不同種類的碳源(乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖)和氮源(硝酸銨、硫酸銨、酵母膏、蛋白胨、硝酸鈉、牛肉膏),檢測其對藍色刺孢霉產(chǎn)藍色素的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上,選取葡萄糖質量濃度、蛋白胨質量濃度、溫度、裝瓶量、時間、接種量、初始pH、轉速、種齡9種因素作為考察對象,以發(fā)酵液色價(Y)為響應值,通過Design-Expert 8.0軟件中Plackett-Burman篩選影響發(fā)酵液色價的顯著性因素。各因素試驗設計水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman設計的因素與水平

1.2.5 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗分析結果,將篩選出的影響發(fā)酵液色價的顯著性因素進行最陡爬坡試驗設計,得到關鍵因子的最佳水平范圍。爬坡試驗的方向通過回歸方程關鍵因素系數(shù)的正負確定,爬坡試驗的步長依據(jù)響應值的變化進行設計,旨在快速、經(jīng)濟地逼近最大響應區(qū)域。

1.2.6 Box-Behnken試驗設計

以最陡爬坡試驗設計得出的試驗結果為依據(jù)進行3因素3水平Box-Behnken試驗,利用Minitab 18軟件將得到的數(shù)據(jù)構建二次多項式數(shù)學模型同時進行回歸分析,最終確定藍色刺孢霉QY229產(chǎn)天然藍色素的最佳發(fā)酵參數(shù),優(yōu)化后各因素間的交互關系通過三維響應面圖呈現(xiàn)。

1.2.7 試驗驗證

將Box-Behnken分析得到的藍色刺孢霉最佳發(fā)酵參數(shù)進行3次重復試驗,3次試驗得到的結果取平均值,進而驗證該試驗模型及試驗設計應用是否合理可行,并得出最終優(yōu)化結果。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 培養(yǎng)基碳源種類的影響

碳源的種類直接關系到微生物的生長和代謝物質的產(chǎn)生[12]。果糖、葡萄糖是常見碳源里能被微生物直接利用的單糖,尤其是葡萄糖,也是發(fā)酵培養(yǎng)基中最常被選擇作為碳源和能源的糖類物質之一[13]。其他雙糖或多糖類物質如蔗糖、麥芽糖和淀粉在水解后也可被微生物逐步利用[14]。本試驗以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,更換不同種類的碳源測定其對發(fā)酵液色價的影響,試驗結果見圖1。

注:不同字母代表兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(p<0.05);相同字母代表兩組數(shù)據(jù)之間不存在顯著性差異(p>0.05)。碳源質量濃度為60 g/L。

由圖1可知,當碳源質量濃度均為60 g/L時,以葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源,發(fā)酵液色價達到167.7 U/mL,顯著(p<0.05)高于其它底物作為碳源時的色價。因此,本研究選擇葡萄糖作為藍色刺孢霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)藍色素的最優(yōu)碳源。

2.1.2 培養(yǎng)基氮源種類的影響

氮源參與各類微生物細胞重要成分的構建,應用于培養(yǎng)基中的無機氮源在發(fā)酵過程早期可以被微生物快速利用,同時能夠促使培養(yǎng)基的pH發(fā)生變化[15]。而有機氮源如牛肉膏、酵母膏和蛋白胨等工業(yè)副產(chǎn)品,除提供氮源外,還可以提供大量的無機鹽及生長因子[16]。該過程以葡萄糖為碳源(最佳碳源),結合初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件,研究不同氮源對菌株發(fā)酵液色價的影響,依據(jù)發(fā)酵液色價值的高低選擇出最佳氮源,實驗結果見圖2。

由圖2可知,蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源色價達到164.4 U/mL,普遍高于其他物質作為氮源時發(fā)酵液的色價,其次是酵母膏。而硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨作為氮源,色價均在60 U/mL以下,與有機氮源存在顯著(p<0.05)差異性,這就說明與無機氮源相比,有機氮源更能促使該菌株代謝產(chǎn)生藍色素。因此,本實驗中蛋白胨可以作為藍色刺孢霉液態(tài)發(fā)酵獲取藍色素的最優(yōu)氮源。

注:氮源質量濃度為30 g/L。

2.2 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman試驗設計對菌株發(fā)酵關鍵影響因素的篩選結果如表2所示。采用Minitab 18軟件對試驗數(shù)據(jù)進行擬合分析,獲得發(fā)酵液色價Y(響應值)對X1～X9(自變量的編碼值)9個因素的一次回歸方程:

Y=149.28+8.57X1+11.33X2+62.96X3-26.03X4-5.51X5+6.53X6+7.24X7+1.12X8+1.04X9。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果

經(jīng)分析,該回歸方程顯著(p=0.010 3),相關系數(shù)R2=0.997 7,這表明該回歸模型的可信度較高,該方程可以對試驗中99.77%的數(shù)據(jù)作出解釋,模型試驗誤差合理可靠。

另外,根據(jù)表3中效應值的大小可知影響藍色刺孢霉產(chǎn)天然藍色素的關鍵因素依次為溫度、蛋白胨質量濃度、裝瓶量。其中溫度和蛋白胨質量濃度對發(fā)酵液色價的影響達到了極顯著水平(p<0.01),裝瓶量對發(fā)酵液色價的影響達到了顯著水平(p<0.05),其余因素的影響均不顯著(p>0.05)。因此后續(xù)試驗選取X2(蛋白胨質量濃度)和X3(溫度)、X4(裝瓶量)為關鍵因素。

2.3 最陡爬坡試驗

由Plackett-Burman回歸方程可知X2(蛋白胨質量濃度)和X3(溫度)對Y(發(fā)酵液色價)具有正效應,X4(裝瓶量)對Y(發(fā)酵液色價)具有負效應。梯度增加溫度和蛋白胨質量濃度,同時梯度降低裝瓶量,進行最陡爬坡試驗,進而確定3個關鍵因素的最佳水平范圍,試驗設計及結果如表4所示。由表4可知,試驗的最優(yōu)點在試驗4附近。因此,以試驗4的條件設置作為后續(xù)響應面試驗的中心點,實現(xiàn)以最少試驗量快速逼近最大發(fā)酵液色價區(qū)域的目的。

表4 最陡爬坡試驗設計及試驗結果

2.4 Box-Behnken試驗優(yōu)化確定最佳因素水平

在最陡爬坡實驗結果的基礎上,以蛋白胨質量濃度(X2)、溫度(X3)及裝瓶量(X4)作為響應因素,發(fā)酵液色價(Y)作為響應值,共計進行15次試驗,優(yōu)化確定最佳因素水平,試驗設計與結果見表5和表6。

表5 Box-Behnken設計的因素與水平

表6 Box-Behnken試驗設計與結果

表7 Box-Behnken試驗設計回歸分析結果

采用Design-Expert 8.0軟件,對Box-Behnken試驗建立的回歸模型中各因素交互作用結果進行響應曲面作圖,結果見圖3。從圖3(a)可以看出,以蛋白胨質量濃度和溫度二因素交互生成的三維響應面圖中,隨著蛋白胨質量濃度和溫度的增加,發(fā)酵液色價先升高后降低。其中蛋白胨質量濃度的曲面坡度較緩慢于培養(yǎng)溫度的曲面坡度,說明發(fā)酵液色價受培養(yǎng)溫度的影響更大[18]。圖3(b)為蛋白胨質量濃度與裝瓶量交互生成的三維響應面圖,圖中等高線的形狀為橢圓形,表明二因素交互作用明顯,同時驗證了方差分析交互項中分析結果的顯著性[19]。圖3(c)為溫度和裝瓶量交互生成的三維響應面圖,溫度和裝瓶量交互作用顯著,且溫度的曲面坡度比裝瓶量的曲面坡度陡峭,可知溫度對發(fā)酵液色價的影響更大[20]。對模型最優(yōu)點進行分析,得到上述關鍵因素的最佳水平:培養(yǎng)溫度為31.67 ℃,蛋白胨質量濃度為34.61 g/L,裝瓶量為72.33 mL,對應發(fā)酵液色價的預測值為350.4 U/mL。

(a)蛋白胨質量濃度與培養(yǎng)溫度之間的相互作用

(b)裝瓶量與蛋白胨質量濃度之間的相互作用

2.5 試驗驗證

為了驗證Box-Behnken分析方法所建模型的預測值與實際值是否能夠較好的擬合,將上述優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件:蛋白胨質量濃度34.61 g/L,溫度為31.67 ℃,裝瓶量72.33 mL,進行3次試驗,3次試驗結果的平均值為348.2 U/mL,與理論預測值350.4 U/mL相接近,說明本試驗設計的優(yōu)化模型切實可靠,可應用于藍色刺孢霉的發(fā)酵條件優(yōu)化。經(jīng)分析,優(yōu)化后的發(fā)酵液色價是優(yōu)化前色價的2.1倍,得出該方案可以明顯提高藍色刺孢霉QY229液態(tài)發(fā)酵條件下藍色素的產(chǎn)量。

3 結 論

本研究對藍色刺孢霉產(chǎn)天然藍色素的液態(tài)發(fā)酵工藝進行系統(tǒng)優(yōu)化。以單因素試驗結果為基礎,采用Plackett-Burman試驗設計從9種考察因素中篩選出關鍵影響因素:氮源質量濃度(蛋白胨)、培養(yǎng)溫度、裝瓶量。利用最陡爬坡實驗設計和Box-Behnken試驗對篩選出的3個關鍵影響因素進行響應面分析,結果表明當?shù)鞍纂速|量濃度為34.61 g/L,溫度為31.67 ℃,裝瓶量為72.33 mL時,發(fā)酵液色價達348.2 U/mL,是優(yōu)化前色價的2.1倍。試驗驗證顯示,預測值與試驗值之間沒有顯著差異,表明優(yōu)化后的條件是合理可行的。由此可見,藍色刺孢霉液態(tài)QY229發(fā)酵產(chǎn)藍色素作為稀有天然藍色素的又一新來源,具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Α?/p>