劉慶梅 楊永仕 劉 艷 劉光明 孫勁旅 （變態(tài)過敏反應科，疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京協(xié)和醫(yī)院，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院，北京 100730）

全球范圍內受過敏性疾病困擾的人群愈來愈多，世界衛(wèi)生組織將過敏性疾病列為21世紀重點防治的三大疾病之一，是當前世界性的重大衛(wèi)生學問題［1-2］。我國過敏性疾病的發(fā)病率也越來越高［3-6］。過敏性疾病是指機體接觸致敏物質而引起的過敏反應或變態(tài)反應疾病，主要包括過敏性鼻炎、過敏性哮喘、特應性皮炎、蕁麻疹、過敏性腸炎以及食物或藥物所引發(fā)的特異性過敏反應等［7］。過敏性疾病多數(shù)反應迅速、癥狀反復，發(fā)生過程分為致敏階段和效應階段。機體初次接觸過敏原后產生特異性IgE，過敏原的再次接觸會與IgE 結合并激活過敏反應的效應細胞（肥大、嗜酸及嗜堿性粒細胞），同時釋放過敏介質，如組胺、肥大細胞蛋白酶、白三烯等，引發(fā)機體全身性過敏癥狀及炎癥反應［8］。

肥大細胞和嗜堿性粒細胞是Ⅰ型超敏反應的重要效應細胞，是食物過敏、哮喘、特應性皮炎、克羅恩病、炎癥性腸病和潰瘍性結腸炎等疾病的關鍵因素［9-11］。越來越多的研究利用肥大細胞或嗜堿性粒細胞系作為診斷分析過敏反應的工具，以評估過敏原組分的致敏性、過敏原檢測及活性功能因子對過敏反應的防控效果［12］。在過敏反應中，肥大細胞或嗜堿性粒細胞再次與特異性過敏原蛋白接觸時，IgE 會與之交聯(lián)，誘發(fā)細胞的激活并脫顆粒，過敏反應的嚴重程度取決于這兩種效應細胞的脫顆粒和介質釋放程度。因此，良好的細胞評價模型對于過敏反應的發(fā)病機制及防控藥物研究極其重要。本文歸納肥大細胞和嗜堿性粒細胞的細胞系基本特征，闡明多種細胞系之間的異同點和應用范圍，以期為過敏性疾病的機制和防控研究提供新的思路。

1 人源效應細胞系

目前獲得的無限增殖的人肥大細胞和嗜堿性粒細胞系較少?，F(xiàn)有報道主要包括人肥大細胞-1（HMC-1）、LAD-1、LAD-2、LUVA、ROSA 和KU812 嗜堿性粒細胞等細胞系，由于這幾種細胞系的表型特征不同，適用的研究方向也有所不同。

1.1 人肥大細胞 HMC-1 細胞系最初來自于1 例肥大細胞白血病患者的外周血，其表型是典型的未成熟肥大細胞，但也表現(xiàn)出一些肥大細胞的特征，比如其表面表達CD2、CD18、CD40 和CD54 等，胞內含有內源性顆粒包含組胺、β-類胰蛋白酶、肝磷脂等，然而，HMC-1 細胞系缺乏功能性的IgE 高親和力受體FcεRⅠ、α-類胰蛋白酶和糜蛋白酶類。Kit 受體（CD117）是肥大細胞表面另一個關鍵標志，是由原癌基因c-kit編碼的酪氨酸激酶受體，Kit信號通路的激活在肥大細胞分化、增殖和生存過程發(fā)揮至關重要的作用［13-14］。HMC-1 細胞表達具有構型活性的Kit 亞型，是由于受體細胞內結構域的點突變引起的。據(jù)CD117 突變方面的不同可將HMC-1 分為HMC-1.1 和HMC-1.2，HMC-1.1 在鄰近膜區(qū)域和催化域同時具有V560G 和V816A 點突變，而HMC-1.2僅有V560G 點突變［15］。V816A 突變常常存在于成人散發(fā)性肥大細胞增多癥和骨髓增生性疾病患者中，是代表HMC-1.1 的一個關鍵特征，HMC-1.1 和HMC-1.2 顯示出不同的增殖速率和其他生長特征［16］。因此，HMC-1細胞系能夠用于更好地了解Kit對肥大細胞調節(jié)、增殖和存活的作用，還可用于Kit受體抑制劑的篩選和機理探究，且由于其Kit 突變位點的存在，HMC-1 細胞系培養(yǎng)無須添加干細胞因子（stem cell factor，SCF）刺激，大大降低了實驗成本。HMC-1 細胞系表面不表達IgE 高親和力受體FcεRⅠ和低親和力的FcεRⅡ，F(xiàn)cεRⅠ β 鏈mRNA以低水平表達，而γ 鏈的基因高表達于HMC-1 細胞系［17］。與所有缺乏功能FcεRⅠ的細胞一致，HMC-1不能由IgE 介導產生脫顆?，F(xiàn)象，這是該細胞系在過敏相關研究中的一個關鍵限制因素。然而，由鈣離子激活劑A23187、Compound 48/80 等進行非免疫刺激后，HMC-1 已被用于脫顆粒和抗炎癥研究［18］。趙洪偉等［19］報道芝麻素能通過PKCα/NFκB 信號通路抑制HMC-1 細胞的活化；LU 等［20］利用HMC-1 細胞系解析了hsa-miR-20a-5p 緩解過敏性炎癥的作用機理；WANG 等［21］報道稱芍藥苷能夠通過抑制NFκB 和MAPK 信號通路發(fā)揮治療過敏性鼻炎的生物活性；同樣的作用機制還表現(xiàn)在香葉醇抑制HMC-1的炎癥反應中［22］。由于HMC-1 細胞系相對容易培養(yǎng)，并且不需SCF 即可增殖，XIA 等［23］通過轉染人FcεRⅠα 基因進入HMC-1 細胞中，獲得穩(wěn)定表達人FcεRⅠα 的HMC-1 亞型（HMC-α），實驗證明該細胞系能夠與IgE 交聯(lián)結合，并在抗原刺激后釋放細胞因子IL-6、IL-8 等，但卻不能在免疫激活后脫顆粒，原因可能在于FcεRⅠ的特殊形式（αγ2 與αβγ2）之間的比率產生影響?？傊琀MC-α 細胞系朝著更具代表性的人肥大細胞模型邁進了一步。

1.2 LAD肥大細胞 2003年，KIRSHENBAUM等［24］報道了兩種新型的人肥大細胞系，即LAD-1和LAD-2，這兩株細胞系源于1 例肥大細胞肉瘤患者的骨髓，目前僅有LAD-2 細胞系是可用的。與HMC-1 細胞系不同，LAD-2 細胞不表達Kit 的激活突變體，其生長依賴于培養(yǎng)基中的SCF，與CD34+干細胞衍生的人類肥大細胞的原代培養(yǎng)極為相似。LAD-2細胞系表達成熟肥大細胞的結構特征，如CD14、CD45、CD64、CD103、CD117、CD132、CXCR4、CCR5 以及胞質內組胺、胰蛋白酶和裂解酶，也表達功能性FcεRⅠ和FcγRⅠ受體，能夠在IgE 介導的受體交聯(lián)后脫顆粒［25］。

LAD-2能夠作為研究IgE-FcεRⅠ交聯(lián)及其下游信號通路以及抗過敏新藥物的模型工具。MI 等［26］利用LAD-2 細胞系結合非標蛋白質組學解析了吐溫-80 誘發(fā)過敏反應的作用機制；通過LAD-2 細胞系，LIU 等［27］證實了麻醉藥物鹽酸哌替啶和枸櫞芬太尼誘發(fā)的藥物過敏與肥大細胞MRGPRX2之間的相互關系；也有學者利用LAD-2 細胞組胺釋放指數(shù)評估藥物的過敏反應［28］；WANG 等［29］發(fā)現(xiàn)n-3 多不飽和脂肪酸能夠調控LAD-2 細胞FcεRⅠ的脂質閥穿梭及其下游信號通路。LAD-2細胞系在抗過敏活性物質的篩選和機理探究方面也多有報道，LV等［30］建立了LAD-2 細胞膜色譜與UHPLC-ESI-MS/MS 的耦合系統(tǒng)，以LAD-2 細胞組胺釋放量為指標成功篩選出黃芪中的抗過敏活性有效組分-芒柄花黃素；利用DNP-BSA 建立IgE 介導的LAD-2 細胞模型，DING等［31］解析了槲皮苷的抗過敏作用機制，主要在于抑制IgE 誘導的Lyn/PLCγ/IP3R-Ca2+、Lyn/ERK1/2、Lyn/NF-κB信號通路；此外，該團隊同時證實了山柰酚對于IgE 介導LAD-2 細胞激活的作用機制［32］；在特應性皮炎的免疫性治療研究中，有報道稱人臍帶血來源的間充質干細胞能夠抑制激活的LAD-2 細胞釋放TNF-α［33］。由此可知，LAD-2 細胞是過敏性疾病研究中的強大工具，但由于其培養(yǎng)成本高、增殖緩慢，也在一定程度上限制了其適用性。

1.3 LUVA肥大細胞 LUVA細胞系建立于2011年，從患有阿司匹林加重性呼吸道疾病的供體中提取的CD34+單個核細胞，利用SCF、IL-6 和IL-3 培養(yǎng)8 周獲得的肥大細胞系，其能夠在沒有添加任何生長因子的情況下存活和增殖約2 年［34］。LAIDLAW等［34］發(fā)現(xiàn)LUVA 細胞系含有對類胰蛋白酶、組織蛋白酶及羧肽酶有免疫反應性的胞內顆粒，細胞核內表達編碼FcεRⅠ、c-Kit、白三烯Ⅰ型受體等蛋白的轉錄基因，用流式細胞術也驗證了LUVA 細胞表面FcεRⅠ、c-Kit、FcγRⅡ的均勻表達，并且能夠由IgE交聯(lián)誘導β-氨基己糖苷酶、前列腺素D2、炎癥蛋白1β等過敏炎癥介質的釋放。LUVA細胞是能夠無限增殖的人肥大細胞系，高表達FcεRⅠ、c-Kit，且不需要SCF 刺激增殖，對于過敏性疾病和肥大細胞功能學研究意義重大。

由于LUVA 細胞系發(fā)現(xiàn)較晚，其相關研究還較少。FOSTER 等［35］對比了LAD-2 和LUVA 兩株人肥大細胞的白三烯E4 信號轉導情況，發(fā)現(xiàn)CysLT1 是LAD-2 細胞中誘發(fā)白三烯E4 有效應答的受體，但并非LUVA 細胞的，將LUVA 細胞過表達CysLT1 后能夠增強白三烯E4 誘導的胞內鈣信號轉導；利用LUVA 細胞和人肺成纖維細胞共培養(yǎng)。REEVES 等［36］證實引起呼吸道哮喘或感染的RSV 病毒是通過透明質酸與細胞外基質的直接相互作用，從而增強肥大細胞結合并促進肥大細胞蛋白酶的表達；LUVA細胞可用于模擬結締組織表型肥大細胞或黏膜表型肥大細胞，有學者利用LUVA 細胞更好地闡明了肥大細胞亞型的調節(jié)因子及其不同的效應功能［37］；通過LUVA 細胞激活模擬過敏性哮喘反應，SZYMCZAK-PAJOR 等［38］發(fā)現(xiàn)維生素D 能夠調節(jié)LUVA 胞內多種磷酸酯的表達，為維生素D 用于哮喘治療的發(fā)展提供了理論依據(jù)。

1.4 ROSA肥大細胞 上述3種肥大細胞系為肥大細胞及相關過敏性疾病的研究提供了有利的工具，然而，這些均未單獨表達D816V 突變的Kit 受體或同時表達功能性FcεRⅠ和D816V 突變的Kit 受體。在肥大細胞增多癥影響的患者中，D816V 突變會導致肥大細胞異常增殖和介質異常釋放，因此表達功能性FcεRⅠ和D816V突變的Kit受體細胞系是研究此類疾病的有效工具。2014年，SALEH 等［39］建立了正常表達KIT 受體（KIT WT）的SCF 依賴型肥大細胞系（ROSAKITWT）和表達FcεRI 并包含D816V KIT 的SCF 依賴型亞克?。≧OSAKITD816V）。ROSAKITWT細胞來源于正常人臍帶血CD34+細胞，表達功能齊全的IgE受體和正常的Kit 受體，能夠經IgE 介導后脫顆粒，同時釋放組胺、TNF-α 和前列腺素D2 等介質，用A23187 誘導也可釋放高達80%的β-氨基己糖苷酶［39-40］。ROSAKITWT細胞能夠在SCF 存在下無限期生存，成長周期快，非常有利于過敏性疾病的基礎研究和抗過敏藥物篩選及機理探究，但至今未見ROSAKITWT細胞用于過敏性疾病研究的報道。

1.5 KU812嗜堿性粒細胞 KU812細胞是來自1例慢性髓細胞白血病患者的嗜堿性粒細胞，具有嗜堿性粒細胞前體的表型特征，胞內含有少量組胺和胰蛋白酶的堿性顆粒。KU812細胞低表達FcεRⅠ，不表達FcεRⅡ。MAGNUSSON［41］及其團隊探究了IgE與KU812 結合的特異性，發(fā)現(xiàn)盡管KU812 細胞表面的FcεRⅠ豐度不高，但IgE 與其結合具有高度特異性，該細胞為研究IgE/FcεRⅠ相互作用提供了獨特的模型。

KU812 是唯一的人嗜堿性粒細胞系，作為研究抗原依賴性的嗜堿性細胞脫顆粒的模型，廣泛應用于過敏性疾病的基礎研究中。ZHONG 等［42］利用KU812 細胞探究過敏原對嗜堿性粒細胞的作用，發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體9 表達可能與包括過敏性鼻炎在內的Th2 型過敏性炎癥有關。ZHANG 等［43］利用KU812細胞表面CD63 和CD203c 表達情況，評估不同分子大小的糖對白蝦原肌球蛋白糖基化作用后的致敏性差異，發(fā)現(xiàn)去糖基化后的原肌球蛋白會表現(xiàn)出更強的KU812 激活現(xiàn)象［44］，為白蝦引起的食物過敏脫敏防控提供新的見解；利用KU812 細胞的IgE 結合能力和炎癥介質分泌來判定過敏原的致敏性，有研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助輻射能夠降低β-乳球蛋白的致敏性，同時以此模型作為熱加工對花生過敏原致敏性影響的評估體系［45-46］。

此外，有不少學者利用KU812 細胞模型檢測天然來源活性物質的抗過敏活性及機理。異槲皮苷能夠抑制KU812 細胞MAPK 和NF-κB 通路，從而降低組胺和促炎因子的產生［47］；利用A23187 和PMA刺激KU812 細胞，MOTOJIMA 等［48］驗證了阿克替甙抑制Ⅰ型過敏反應的機理在于下調嗜堿性粒細胞的鈣調神經磷酸酶/活化T 細胞核因子（phosphatase calcineurin/nuclear factor of an activated T cell，NFAT）和JNK MAPK 信號通路；IgE 交聯(lián)結合FcεRⅠ誘導了KU812細胞mTOR 和p70S6K的磷酸化，紅參提取物被證明是一種潛在的針對p70S6K 信號轉導途徑的過敏性皮膚炎癥治療物質［49］；LIU 等［50］也報道龍須菜硫酸多糖能夠抑制KU812 細胞p38 MAPK 信號分子的磷酸化，發(fā)揮抗過敏作用。

2 嚙齒類動物細胞系

由于缺乏完全成熟、易于培養(yǎng)的人肥大細胞或嗜堿性粒細胞的細胞株，嚙齒動物來源的細胞系幾乎涵蓋了整個過敏性疾病的肥大細胞或嗜堿性粒細胞的相關研究。但不同物種的肥大細胞或嗜堿性粒細胞在生理特性上存在著重要差異，也會表現(xiàn)出癥狀上的明顯不同?，F(xiàn)將目前應用于過敏性疾病研究的幾種常用嚙齒類動物細胞系的主要特征介紹如下。

2.1 RBL-2H3 RBL 細胞系來自白血病大鼠的嗜堿性粒細胞，包括RBL-1 和RBL-2H3 細胞系，1974年KULCZYCKI 等［51］獲得的能夠釋放組胺的RBL-2H3細胞系使用最廣泛。RBL-2H3細胞同時具有黏膜肥大細胞和嗜堿性粒細胞的特征，其表面穩(wěn)定表達FcεRI，分別由1 個α、1 個β 和2 個γ 亞基（αβγ2）組成四聚體結構，并以高親和力結合IgE，對免疫或非免疫刺激均產生脫顆粒反應，其方式與原代肥大細胞和嗜堿性粒細胞的脫顆粒動力學非常相似［52］。RBL-2H3 細胞系廣泛應用于過敏性疾病的基礎研究。AYO 等［53］利用該細胞系，明確了Munc13-4基因是RBL-2H3 激活和釋放TNF-γ 的關鍵；利用Mrgprb3（大鼠中與人Mrgprx2同源的基因）敲除RBL-2H3 細胞系，WANG 等［54］報道稱黃芩苷能夠通過Mrgprx2 誘導假性過敏反應；一種基于VAMP-8-EGFP 的RBL-2H3 細胞模型也被用于多種不同過敏原的快速檢測中［55］。在過敏性疾病的防控藥物研究中，RBL-2H3 細胞系有舉足輕重的影響。余潔等［56］報道木犀草能夠抑制RBL-2H3 肥大細胞脫顆粒，且通過調節(jié)細胞內Ca2+濃度與AKT 活性參與其中；MATSUDA 等［57］系統(tǒng)綜述了能夠抑制RBL-2H3細胞脫顆粒的藥用植物如類黃酮、芪類、姜黃素等，并闡明它們抗過敏活性的結構要求以及作用機制；本課題組也利用IgE 介導的RBL-2H3 細胞模型，篩選得到多種有效抑制肥大細胞脫顆粒的海洋來源活性物質，并初步解析作用機理，以期應用于抗過敏特殊食品或藥品的研發(fā)［58-63］。

2.2 人源化RBL 嚙齒動物的FcεR不能識別人類的免疫球蛋白，無法用于人類過敏性疾病的研究中。將人FcεRⅠ的αβγ 基因轉染至RBL-2H3 細胞后，該細胞顯示了交聯(lián)人IgE 并刺激脫顆粒的能力。其中，RBL-SX38 細胞表達所有3 個αβγ 亞基，可直接用于患者血清致敏后過敏原刺激效應細胞的激活［64］；MILLS等［65］利用RBL-SX38細胞系驗證了維生素E 對塵螨過敏患者嗜堿性粒細胞應答的抑制作用；在食物過敏研究領域，也有學者利用該細胞系探究了小麥過敏原熱加工前后的致敏性變化［66］；STARKL 等［67］將RBL-SX38 細胞系用于驗證花生過敏原Ara h2還原或烷基化后刺激效應細胞激活能力的變化。人源化RBL 細胞系除了RBL-SX38 之外，還有RBL-hEIα-2B12和RBL-30/25細胞系，這兩種細胞系只表達人FcεR 的α 亞基，盡管不表達人源β 和γ 亞基，其胞內的信號轉導包括磷酸肌醇水解、鈣離子內流、酪氨酸磷酸、組胺/花生四烯酸代謝等也是完整的。人的FcεRⅠα 可與大鼠本身β 和γ 亞基締合，使得人IgE 敏化后的RBL-hEIα-2B12 細胞系能夠被抗人IgE 所激活，說明該細胞系有望應用于檢測人血清中FcεRⅠα 可結合的IgE［68］；REESE 等［69］利用RBL-30/25 細胞系探究對蝦主要過敏原-原肌球蛋白的突變體VR9-1 的免疫應答，發(fā)現(xiàn)VR9-1 激活效應細胞的能力下降了90%～98%。

FcεRⅠ亞基的差異表達使不同RBL 嵌合體細胞對IgE 的結合能力也有所不同，有報道稱RBLSX38 的結合能力最強，其次是RBL-30/25 和RBLhEIα-2B12。經IgE 介導激活后，三種細胞系的脫顆粒效率分別為94%、84%和54%。利用1 例花生過敏患者血清來源的純化IgE 敏化三種細胞系，經過花生提取物的刺激后，發(fā)現(xiàn)三種細胞系均能夠發(fā)生脫顆粒，脫顆粒效率分別是65%、18%和40%～45%，而其他3 例花生過敏患者的血清敏化后不能誘導RBL-hEIα-2B12 的脫顆粒，另有1 例患者的血清敏化后，能刺激RBL-SX38和RBL-30/25的60%和30%脫顆粒效率［12］。此外，國內也有建立穩(wěn)定表達人FcεRⅠ-αβγ 的RBL 細胞株，但具體應用仍有待深入［70］。由此可知，人源化的RBL 嵌合體細胞系生長速度、培養(yǎng)成本等方面與RBL-2H3 有相同的優(yōu)勢，然而這類細胞系在安全性評估、免疫反應性預測和可重復性方面的實用性還需進一步探究。

2.3 NCL-2 2014 年，HIRAGUN 等［71］建立了Kit 受體未突變的源自NC 小鼠骨髓的肥大細胞系，NCL-2細胞表達FcεRⅠ和Kit，被抗原刺激后能釋放組胺和白三烯。NCL-2 是不貼壁的非腫瘤細胞系，培養(yǎng)過程中無須添加IL-3 和SCF［72］。因此，有研究認為NCL-2 細胞系可能是分析正常肥大細胞增殖、分化和功能的有用工具［71-72］，然而至今尚未被廣泛用于實驗研究中。

3 總結

肥大細胞和嗜堿性粒細胞是過敏、炎癥和先天免疫的關鍵效應細胞，然而其研究往往由于缺乏現(xiàn)成的模型系統(tǒng)而受到阻礙，現(xiàn)有的肥大細胞和嗜堿性粒細胞系數(shù)量有限，而且這些細胞系的培養(yǎng)條件、增殖周期、受體表達及刺激激活能力不盡相同，也不能完全代表典型肥大細胞或嗜堿性粒細胞特征。此外，無限增殖的細胞系容易出現(xiàn)變異或其他異常特征，有可能無法反映機體原代初級細胞的生理學現(xiàn)象。本篇綜述對現(xiàn)有的肥大細胞和嗜堿性粒細胞系的來源、FcεRⅠ表達、Kit 受體情況進行了歸納總結（表1），并系統(tǒng)概述了這些細胞系在過敏性疾病實驗研究中的應用。現(xiàn)有應用較多的是RBL-2H3 和HMC-1 細胞，針對IgE 介導過敏反應的優(yōu)勢明顯的是LAD-2 和LUVA，但也都有各自的不足和缺陷，而近些年新發(fā)現(xiàn)的ROSA 以及人源化的RBL-SX38 對于過敏性疾病的檢測、診斷和防控研究來說更為適宜。隨著對效應細胞系特征和功能的深入了解，可知過敏性疾病的相關研究需要開發(fā)一種新的細胞系，該細胞系能夠由IgE 介導激活并表達FcεRⅠ的αβγ 亞基，且具備培養(yǎng)成本較低、增殖周期短的特點。此外，原代培養(yǎng)的效應細胞系（比如原代人外周血來源的肥大細胞和小鼠骨髓來源肥大細胞）也可用于過敏性疾病的研究。

表1 過敏性疾病主要效應細胞系一覽表Tab.1 List of main effector cell lines for allergic diseases