張磊磊 謝周良 權(quán)曉強(qiáng) 丁付燕

（河南省人民醫(yī)院心臟中心，華中阜外醫(yī)院，鄭州大學(xué)華中阜外醫(yī)院成人心臟外科，鄭州 450003）

急性心肌梗死是全球除癌癥外導(dǎo)致人類死亡的主要原因［1］。急性心肌梗死的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是打開阻塞的冠狀動(dòng)脈及時(shí)進(jìn)行再灌注治療，但該方法會(huì)造成心臟的額外損傷，稱為缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷，大大降低了患者的再灌注治療效果［2］。I/R 損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，再灌注后炎癥因子的異常釋放、心肌細(xì)胞的大量凋亡及自由基的大量生成均能進(jìn)一步加重心臟損傷［3］。研究表明miRNA 在I/R 損傷中發(fā)揮重要作用，其通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路及靶基因表達(dá)成為心肌I/R 損傷的潛在治療靶點(diǎn)［4］。最新研究顯示，miR-155-5p參與調(diào)控心肌I/R 損傷［5］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin 1，SIRT1）-腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）通路不僅與脂質(zhì)代謝有關(guān)，而且參與調(diào)控心肌I/R 損傷［6-7］。丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，TⅡA）是唇形科植物丹參的主要活性物質(zhì)，具有擴(kuò)展血管、降低血壓、抗血栓等功能，在冠心病、心率過(guò)速等心血管疾病中有顯著的治療效果［8］。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，TⅡA有助于減輕心肌I/R 損傷，但其具體作用機(jī)制尚不完全明確，目前尚未見TⅡA 通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1-AMPK通路在心肌I/R 損傷中發(fā)揮作用的報(bào)道［9］。本研究擬利用H9c2 心肌細(xì)胞構(gòu)建I/R 損傷模型，初步探討TⅡA 對(duì)H9c2 心肌細(xì)胞I/R 損傷的保護(hù)作用及其與miR-155-5p、SIRT1-AMPK 通路的調(diào)控關(guān)系，旨在為心肌I/R 損傷的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為完善TⅡA 保護(hù)心肌細(xì)胞I/R 損傷的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。H9c2 細(xì)胞復(fù)蘇后置于添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；TⅡA購(gòu)自成都儀睿生物科技有限公司；miR-155-5p 模擬物（miR-155-5p mimics）及其陰性對(duì)照（miR-NC）購(gòu)自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）試劑盒購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物科技公司；TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17、乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢賽培生物科技有限公司；SIRT1、AMPK、p-AMPK、β-actin 抗體及對(duì)應(yīng)二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自廣州南方生化醫(yī)學(xué)儀器有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀購(gòu)自上海普迪生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建與分組 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞采用缺氧/復(fù)氧的方法構(gòu)建I/R 損傷模型：首先將H9c2細(xì)胞置于不含糖的DMEM 培養(yǎng)基中，于缺氧培養(yǎng)箱（參數(shù)設(shè)置為：37 ℃、1%O2、5%CO2）中持續(xù)培養(yǎng)4 h；然后將細(xì)胞更換至高糖的DMEM 培養(yǎng)基中，在正常培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。TⅡA 溶解于DMSO，并調(diào)節(jié)濃度至10 μmol/L。將造模成功的H9c2 細(xì)胞隨機(jī)分為模型組、TⅡA 組（加入10 μmol/L TⅡA 干預(yù)24 h）、TⅡA+miR-NC 組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC 后加入10 μmol/L TⅡA 干預(yù)24 h）、TⅡA+miR-155-5p mimics 組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics 后加入10 μmol/L TⅡA 干預(yù)24 h），TⅡA 的干預(yù)濃度和時(shí)間是在參考文獻(xiàn)［10］的基礎(chǔ)上通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)所確定，另取常規(guī)培養(yǎng)的H9c2 細(xì)胞（添加等量DMSO）作為對(duì)照組，miRNA 轉(zhuǎn)染的具體操作按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)miR-155-5p 表達(dá)水平 提取各組處理后的H9c2 細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix 配制PCR 反應(yīng)體系，采用qRT-PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以U6為內(nèi)參進(jìn)行歸一化，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155-5p 的相對(duì)表達(dá)水平。U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-155-5p 正向引物：5'-GTATCCAGTGCGTGTCGTGG-3'，反向引物：5'-GTATCCAGTGCGTGTCGTGG-3'。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將H9c2細(xì)胞接種至96 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，并按照1.2.1方法進(jìn)行處理，然后分別加入MTT 試劑10 μl，37 ℃下培養(yǎng)4 h，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm 時(shí)各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算其細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組H9c2細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，置于圓底管中（細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml），先加入5 μl Annexin V，反應(yīng)15 min后，再加入5 μl PI，然后使用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況，并用Flow Jo 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。Annexin V 單獨(dú)染色表示細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，Annexin V/PI雙染表示細(xì)胞處于晚期凋亡。凋亡率（%）=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)炎癥因子、心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物及氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平 將處理后的各組H9c2 細(xì)胞進(jìn)行離心，收集上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17、心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物L(fēng)DH 和氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA、SOD水平。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)SIRT1、AMPK 蛋白表達(dá)分別提取1.2.1中各組H9c2細(xì)胞總蛋白，采用SDSPAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，使用5%～8%的脫脂牛奶阻斷印跡1 h，加入SIRT1、AMPK、p-AMPK、β-actin 抗體，4 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，緩沖液沖洗膜3 次后加入對(duì)應(yīng)二抗，2 h 后采用ECL 檢測(cè)系統(tǒng)和NIH Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TⅡA 通過(guò)miR-155-5p 對(duì)H9c2 細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，模型組miR-155-5p 表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，TⅡA組miR-155-5p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高（P<0.05）；與TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組相比，TⅡA+miR-155-5p mimics組miR-155-5p表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低（P<0.05），見表1。

表1 MTT法檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞活力（±s，n=6）Tab.1 H9c2 cell viability of each group detected by MTT method （±s， n=6）

表1 MTT法檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞活力（±s，n=6）Tab.1 H9c2 cell viability of each group detected by MTT method （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics miR-155-5p Cell viability/%100.00±0.11 67.49±5.231）93.67±8.462）92.58±8.15 52.94±4.283）4）1.00±0.03 1.56±0.211）1.03±0.082）1.05±0.12 2.89±0.433）4）

2.2 TⅡA 通過(guò)miR-155-5p 對(duì)H9c2 細(xì)胞損傷的影響 圖1、表2顯示，模型組細(xì)胞凋亡率、LDH活性較對(duì)照組明顯升高（P<0.05）；TⅡA 組細(xì)胞凋亡率、LDH 活性較模型組明顯降低（P<0.05）；TⅡA+miR-155-5p mimics 組細(xì)胞凋亡率、LDH 活性較TⅡA+miR-NC組和TⅡA組明顯升高（P<0.05）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡Fig.1 Apoptosis of H9c2 cells in each group detected by flow cytometry

表2 流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡和LDH水平（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis and LDH level of H9c2 cells in each group were detected by flow cytometry and ELISA（±s， n=6）

表2 流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡和LDH水平（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis and LDH level of H9c2 cells in each group were detected by flow cytometry and ELISA（±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

LDH/（U·L-1）352.36±51.42 745.86±72.831）426.51±43.152）431.27±45.24 1 123.42±124.383）4）Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics Apoptosis rate/%4.23±0.11 23.68±3.451）7.35±1.232）8.17±1.46 29.58±2.143）4）

2.3 TⅡA 通過(guò)miR-155-5p 對(duì)H9c2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與對(duì)照組比較，模型組TNF-α和IL-17水平升高，IL-4 和IL-10 水平降低（P<0.05）；與模型組比較，TⅡA 組TNF-α 和IL-17 水平降低，IL-4 和IL-10水平升高（P<0.05）；與TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組比較，TⅡA+miR-155-5p mimics 組TNF-α 和IL-17 水平升高，IL-4和IL-10水平降低（P<0.05），見表3。

表3 ELISA檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞炎癥因子水平（±s，ng/L，n=6）Tab.3 ELISA detection of H9c2 cell inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n=6）

表3 ELISA檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞炎癥因子水平（±s，ng/L，n=6）Tab.3 ELISA detection of H9c2 cell inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

IL-17 11.26±1.12 19.65±0.891）12.14±1.162）12.35±1.23 33.56±2.053）4）Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics TNF-α 22.43±1.05 43.56±2.141）26.35±1.422）27.06±1.53 52.89±2.373）4）IL-4 44.35±2.36 32.51±1.841）43.56±2.412）42.78±2.35 28.47±1.383）4）IL-10 65.49±1.57 56.27±1.251）63.85±1.622）62.58±1.65 49.34±1.133）4）

2.4 TⅡA 通過(guò)miR-155-5p 對(duì)H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響 模型組MDA含量顯著高于對(duì)照組，SOD 活性顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；TⅡA 組MDA含量明顯低于模型組，SOD 活性明顯高于模型組（P<0.05）；TⅡA+miR-155-5p mimics 組MDA 含量顯著高于TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組，SOD 活性顯著低于TⅡA組和TⅡA+miR-NC組（P<0.05），見表4。

表4 ELISA檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞MDA、SOD水平（±s，n=6）Tab.4 MDA and SOD levels of H9c2 cells in each group detected by ELISA （±s， n=6）

表4 ELISA檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞MDA、SOD水平（±s，n=6）Tab.4 MDA and SOD levels of H9c2 cells in each group detected by ELISA （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with TⅡA group， 3）P<0.05； compared with TⅡA+miR-NC group， 4）P<0.05.

Groups Control Model TⅡA TⅡA+miR-NC TⅡA+miR-155-5p mimics MDA/（mmol·ml-1）SOD/（U·ml-1）137.45±5.78 85.64±3.261）134.58±9.422）133.68±8.79 46.95±9.533）4）5.02±0.13 13.24±3.211）7.16±1.542）7.21±1.65 21.45±2.673）4）

2.5 T ⅡA 通 過(guò)miR-155-5p 對(duì)H9c2 細(xì) 胞SIRT1-AMPK 通路的影響 如圖2所示，模型組SIRT1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，p-AMPK/AMPK 值明顯小于對(duì)照組（P<0.05）；TⅡA 組SIRT1蛋白表達(dá)明顯高于模型組，p-AMPK/AMPK 值明顯高于模型組（P<0.05）；TⅡA+miR-155-5p mimics 組SIRT1 蛋白表達(dá)明 顯 低 于T ⅡA 組 和T ⅡA+miR-NC 組，p-AMPK/AMPK 值明顯小于TⅡA 組和TⅡA+miR-NC 組（P<0.05）。

3 討論

心肌缺血發(fā)生時(shí)，進(jìn)行再灌注治療有助于減小患者心肌梗死面積并保護(hù)心臟功能，但再灌注治療過(guò)程中往往會(huì)誘發(fā)更嚴(yán)重的心肌損傷，進(jìn)而加速心臟功能惡化［11］。心肌I/R 損傷的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)顯示TⅡA 具有抗炎、抗氧化等作用，能夠通過(guò)提高SOD 活性、降低IL-1β 表達(dá)減輕心肌 I/R損傷［12］。miR-155 參與調(diào)控心血管疾病的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)敲低miR-155 可有效降低大鼠心肌I/R 損傷和H9c2 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷［13］。此外，近期研究顯示TⅡA 可通過(guò)抑制miR-155 表達(dá)改善骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。而miR-155-5p 是miR-155 的亞型之一，本研究猜測(cè)TⅡA 可能通過(guò)調(diào)控miR-155-5p 改善心肌細(xì)胞I/R損傷。

本研究構(gòu)建了H9c2 心肌細(xì)胞I/R 損傷模型，結(jié)果顯示，模型組miR-155-5p 表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低；TⅡA 處理后細(xì)胞活性顯著升高；在TⅡA 組的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics 上調(diào)miR-155-5p 表達(dá)后，細(xì)胞活力明顯下降，提示TⅡA 可能通過(guò)抑制miR-155-5p 提高H9c2 心肌細(xì)胞活力。心肌細(xì)胞異常凋亡是導(dǎo)致心肌I/R 損傷的主要原因之一，研究表明在心肌I/R 損傷大鼠模型中細(xì)胞凋亡率明顯升高［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高；TⅡA可降低細(xì)胞凋亡率，而上調(diào)miR-155-5p使TⅡA 處理后的細(xì)胞凋亡率再次升高，說(shuō)明TⅡA可能通過(guò)抑制miR-155-5p 降低H9c2 心肌細(xì)胞凋亡。

減輕炎癥反應(yīng)、抑制機(jī)體的氧化應(yīng)激是治療I/R損傷的關(guān)鍵。TNF-α 的大量積累會(huì)誘發(fā)IL-17 等促炎因子表達(dá)，從而加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［16］。IL-4、IL-10 是細(xì)胞中的抗炎因子，其含量增加對(duì)心肌損傷有改善作用［17］。LDH 在機(jī)體細(xì)胞中廣泛存在，與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)有關(guān)，可作為標(biāo)志物評(píng)估心肌細(xì)胞損傷［18-19］。在心肌發(fā)生I/R 損傷時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量自由基，自由基發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)最終會(huì)生成MDA，因此MDA 水平的檢測(cè)有助于評(píng)定細(xì)胞的氧化損傷程度；而SOD 可清除細(xì)胞中的氧自由基，從而使細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能［20］。本研究結(jié)果顯示，TⅡA 處理可減輕H9c2細(xì)胞的炎癥因子和氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平，miR-155-5p mimics 的加入使TⅡA 處理后的相關(guān)因子水平得到逆轉(zhuǎn)，提示TⅡA 能夠有效降低H9c2心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制與下調(diào)miR-155-5p表達(dá)有關(guān)。

據(jù)報(bào)道，SIRT1-AMPK 通路不僅與心血管疾病、糖尿病、肝損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還與氧化應(yīng)激進(jìn)程及能量代謝相關(guān)［7，21-23］。SIRT1活化后可激活LKB1，而LKB1 表達(dá)上調(diào)能夠提高AMPK 的磷酸化水平，從而抑制心肌梗死誘導(dǎo)的心肌凋亡和心肌能量代謝紊亂［23］。WANG 等［24］研究發(fā)現(xiàn)山楂酸通過(guò)激活SIRT1/AMPK 信號(hào)通路改善I/R 損傷大鼠的心臟功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p 負(fù)調(diào)控SIRT1 表達(dá)，且miR-155-5p 通過(guò)抑制SIRT1 信號(hào)通路促進(jìn)梗阻性腎病腎間質(zhì)纖維化［25］?；诖?，本研究推測(cè)上調(diào)miR-155-5p 對(duì)H9c2 心肌細(xì)胞I/R 損傷的促進(jìn)作用與SIRT1-AMPK 通路有關(guān)。本研究通過(guò)Western blot 分析發(fā)現(xiàn)，TⅡA 處理可使模型組細(xì)胞中SIRT1 蛋白表達(dá)及AMPK 磷酸化水平（p-AMPK/AMPK）顯著升高；miR-155-5p mimics 的干預(yù)則逆轉(zhuǎn)了TⅡA 對(duì)SIRT1 蛋白表達(dá)及AMPK 磷酸化水平的影響，提示TⅡA 可能通過(guò)下調(diào)miR-155-5p 激活SIRT1-AMPK通路，緩解H9c2心肌細(xì)胞的I/R損傷。

綜上所述，TⅡA可通過(guò)抑制miR-155-5p表達(dá)改善H9c2 心肌細(xì)胞I/R 損傷，這可能與激活SIRT1-AMPK 通路有關(guān)，為心肌I/R 損傷的機(jī)制研究和臨床治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。