魏宗強 王琳茹 胡文賢 張娟子 黃賢明 李 林 李 強

（青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院血管外科中心，青島 266033）

缺血再灌注損傷是發(fā)生于腦卒中、心肌梗死、休克、器官移植等疾病中的病理現(xiàn)象，可引發(fā)強烈的過氧化及炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞變性、凋亡，造成器官功能衰竭，極大威脅患者生命安全［1-2］。在缺血再灌注病理損傷過程中，血管內(nèi)皮細胞作為前沿細胞，可因缺氧/復(fù)氧（H/R）過程而造成損傷，促使凋亡發(fā)生，抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡對于緩解組織器官缺血再灌注損傷至關(guān)重要［3-4］。小核仁RNA 宿主基因12（small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12）是一種長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，Lnc-RNA），參與介導(dǎo)細胞H/R 病理過程，沉默SNHG12可促進H/R 引發(fā)的炎癥細胞因子產(chǎn)生及細胞凋亡，上調(diào)SNHG12表達，抑制炎癥發(fā)生及進展，提高腦缺血再灌注后微血管內(nèi)皮細胞活力，減輕腦組織損傷，因此，LncRNA SNHG12 可作為改善H/R 人血管內(nèi)皮細胞損傷的潛在作用靶點［5-6］。miR-138-5p 是調(diào)控細胞活力、凋亡、遷移和炎癥損傷等生理病理過程的重要因子，下調(diào)其表達可增強細胞活力，阻礙炎癥反應(yīng)，進而抑制其凋亡［7］。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是miR-138-5p的下游調(diào)控靶點，兩者表達呈負相關(guān)［8］。HIF-1α 是一種缺氧誘導(dǎo)因子，可以減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放，降低細胞凋亡，保護細胞免于氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖造成的損傷［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，SNHG12 可負調(diào)控miR-138 的表達，敲除SNHG12 可通過上調(diào)miR-138 而抑制非小細胞肺癌細胞生長，并誘導(dǎo)細胞凋亡，因而推測LncRNA SNHG12 可能通過調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 軸改善H/R引發(fā)的人血管內(nèi)皮細胞損傷［11］。本研究通過建立H/R 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）模型對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 HUVECs 及其專用培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司；LncRNA SNHG12、miR-138-5p、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、U6 及HIF-1α 引物、LncRNA SNHG12 過表達質(zhì)粒、Lnc-RNA SNHG12 空載質(zhì)粒、miR-138-5p mimics、miR-138-5p mimics 陰性對照由上海吉瑪基因有限公司提供；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）（含雙抗）培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA（含酚紅）消化液、減少了血清的MEM（Eagle's）培養(yǎng)基（Opti-MEM）、脂質(zhì)體2000、CCK-8 試劑盒、Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒、一步法實時熒光定量試劑盒、總RNA 提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、高效放射免疫沉淀法（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、人IL-6、IL-17、IL-18 ELISA 試劑盒、ROS 檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司；兔源GAPDH 一抗、兔源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）一抗、兔源Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）一抗、兔源HIF-1α一抗、羊抗兔二抗均購于美國Abcam公司。

1.1.2 主要儀器 En-Vision 型多功能酶標(biāo)儀購于珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；Countstar Rigel 熒光細胞分析儀購于上海睿鈺生物科技有限公司；UV5Nano紫外可見分光光度計購于梅特勒-托利多國際有限公司；ABI7500 型PCR 儀購于美國ABI 公司；FACS caliber 流式細胞儀、PowerPac 蛋白電泳儀購于美國BD 公司；Trans-Blot SD 型轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS型凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞模型建立及分組轉(zhuǎn)染 快速解凍復(fù)蘇HUVECs，以培養(yǎng)HUVECs 的專用培養(yǎng)基重懸后，接種于T-25 培養(yǎng)瓶，進行無菌培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至80%左右時以1∶3比例傳代。

細胞分組：取上述傳代的HUVECs，接種于24孔板，無菌培養(yǎng)24 h，隨機分為對照組、H/R 模型組（細胞H/R 模型）、H/R+LncRNA SNHG12 過表達組、H/R+miR-138-5p mimics組、H/R+共轉(zhuǎn)染組（用來驗證LncRNA SNHG12 改善H/R 人血管內(nèi)皮細胞損傷是否通過調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 實現(xiàn)）、H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照（LncRNA SNHG12 空載質(zhì)粒+miR-138-5p mimics陰性對照）組（每組6個重復(fù)孔）。

細胞轉(zhuǎn)染：分別以50 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基溶解質(zhì)粒、mimics、mimics 陰性對照，配制為LncRNA SNHG12過表達質(zhì)粒、LncRNA SNHG12空載質(zhì)粒、miR-138-5p mimics 及miR-138-5p mimics 陰性對照溶液，再以200 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基脂質(zhì)體2000，配制為脂質(zhì)體2000 溶液，將50 μl 脂質(zhì)體2000 溶液分別與上述質(zhì)粒、miR-138-5p mimics 及miR-138-5p mimics陰性對照溶液混勻，制成轉(zhuǎn)染液，各組濃度參照各自說明書進行設(shè)定，將培養(yǎng)液替換為Opti-MEM 培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染液后轉(zhuǎn)染6 h，棄去Opti-MEM 培養(yǎng)基后替換為細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h完成轉(zhuǎn)染。

細胞模型建立及標(biāo)本采集：取上述分組后的各組細胞，除對照組、H/R 模型組外的其余各組細胞按上述細胞轉(zhuǎn)染方法進行分組轉(zhuǎn)染：H/R+LncRNA SNHG12 過表達組轉(zhuǎn)染LncRNA SNHG12 過表達質(zhì)粒，H/R+miR-138-5p mimics 組轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimics，H/R+共轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染LncRNA SNHG12 過表達質(zhì)粒和miR-138-5p mimics，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照組轉(zhuǎn)染Lnc-RNA SNHG12 空載質(zhì)粒和miR-138-5p mimics 陰性對照，轉(zhuǎn)染的同時對H/R 模型組和轉(zhuǎn)染組細胞給予5 h 缺氧后復(fù)氧1 h［12］，來誘導(dǎo)建立H/R細胞模型，對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)，均于造模2 h 后收集各組細胞，重復(fù)上述操作4 次，得到4 份細胞標(biāo)本。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞活力 通過細胞計數(shù)板檢測HUVECs 濃度后，稀釋為1.0×105個/ml，接種于96 孔板，無菌培養(yǎng)24 h，隨機分為上述6 組，另選6個孔不接種細胞作為空白對照組， 除對照組外，其余各組細胞給予5 h 缺氧后復(fù)氧1 h，誘導(dǎo)建立H/R模型，同時參照1.2.1中方法進行分組轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄細胞培養(yǎng)液，替換為含適量CCK-8試劑的新培養(yǎng)液，2 h 后酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A），計算細胞活力（%）=（A實驗組-A空白對照組）/（A對照組-A空白對照組）×100%［12］。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將傳代的HUVECs 接種于24 孔板，按照1.2.1 中方法分組處理后，加入適量胰酶消化、100 g離心，得到各組細胞沉淀，經(jīng)PBS（8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于800 ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L）洗滌后重懸，依次加入適量Annexin V-FITC 與PI混勻，于37.5 ℃下避光孵育15 min，100 g 離心，以PBS 洗滌細胞沉淀，以500 μl PBS 重懸各組細胞，上樣至流式細胞儀中，檢測各組細胞凋亡情況［12］。

1.2.4 ELISA 檢測細胞IL-6、IL-17、IL-18 水平 取1 份1.2.1 中收集的各組細胞，加入高效RIPA 裂解液，混勻后于冰水浴中裂解2 h，然后1 000 g 離心收集上清，各取0.1 ml 以ELISA 試劑盒分別測量其中IL-6、IL-17、IL-18 水平：包被96 孔板、加入樣品液孵育、加入酶標(biāo)抗體孵育、加入底物液顯色后終止反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測定各孔吸光度后，根據(jù)說明書中方法計算出IL-6、IL-17、IL-18水平。

1.2.5 熒光探針法測定ROS 水平 取1 份1.2.1中收集的各組細胞，加入熒光探針DCFH-DA，DCFH-DA 可自由穿過細胞膜，其本身沒有熒光，進入細胞后，能被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，從而使探針被裝載到細胞內(nèi)，細胞內(nèi)的活性氧可氧化DCFH，使其成為有熒光的DCF，測定DCF 的熒光值，即可知道細胞內(nèi)活性氧的水平，以相對熒光強度表示（A.U.）。

1.2.6 分光光度計法檢測細胞LDH 水平 取1.2.4 中細胞裂解樣品液0.1 ml，加入工作液顯色后終止反應(yīng)，以分光光度計測定各孔吸光度后，根據(jù)說明書方法計算LDH水平［9-10］。

1.2.7 qRT-PCR 檢 測 細 胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 表達 取1份1.2.1中收集的各組細胞，以試劑盒提取其總RNA 后，采用一步法實時熒光定量試劑盒做qRT-PCR 實驗，具體步驟及反應(yīng)條件設(shè)置參照各自說明指導(dǎo)進行，HIF-1α 使用GAPDH 做內(nèi)參，miR-138-5p 使用U6 做內(nèi)參，所得各組基因Ct 值運用2-ΔΔCt算法進行分析，最終測出各組miR-138-5p 及HIF-1α mRNA的相對表達，各基因引物序列見表1。

1.2.8 Western blot 檢測細胞凋亡蛋白caspase-9、Bax 及HIF-1α 蛋白表達 取1 份1.2.1 中收集的各組細胞，加入高效RIPA 裂解液，于4 ℃下裂解、1 000 g 離心，提取總蛋白，使用試劑盒經(jīng)BCA 法測出濃度后調(diào)至各組相等［10］，將其變性后分別取20 μl上樣，110 V 下電泳75 min 分離蛋白，然后40 mA 下濕轉(zhuǎn)60 min 將其移至硝酸纖維膜上，37.5 ℃下孵育5%脫脂奶粉溶液2 h，封閉膜上蛋白，然后根據(jù)分子量分別剪下caspase-9、Bax、GAPDH 及HIF-1α 蛋白條帶，4 ℃下孵育相應(yīng)一抗10 h，TBST（10 mmol/L Tris-HCl+150 mmol/L NaCl+2%Tween20，pH7.4）洗膜3 次，37.5 ℃下孵育羊抗兔二抗1.5 h，TBST 洗膜3 次，顯色、拍照，以Image J 軟件定量各蛋白條帶灰度值，對其進行統(tǒng)計分析后得出各蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞活力情況 與對照組相比，H/R 模型組細胞活力降低（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達組細胞活力升高（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics組細胞活力降低（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表2）。

表2 各組細胞活力（±s，n=6）Tab.2 Cell viability of each group （±s，n=6）

表2 各組細胞活力（±s，n=6）Tab.2 Cell viability of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Cell viability/%100.0±0.00 41.03±9.121）96.01±15.732）3）25.13±4.052）3）41.17±7.481）41.09±8.021）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control

2.2 各組細胞凋亡情況 與對照組相比，H/R 模型組細胞凋亡率升高（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達組細胞凋亡率降低（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics組細胞凋亡率升高（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖1、表3）。

圖1 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況Fig.1 Apoptosis was detected by flow cytometry

表3 各組細胞凋亡率（±s，n=6）Tab.3 Apoptosis rate of each group （±s，n=6）

表3 各組細胞凋亡率（±s，n=6）Tab.3 Apoptosis rate of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Apoptosis rate/%10.06±1.01 64.02±9.201）9.96±0.832）3）81.73±4.222）3）63.97±8.411）64.06±8.521）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control

2.3 各組細胞ROS、LDH 檢測水平 與對照組相比，H/R 模型組細胞ROS、LDH 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達組細胞ROS、LDH 水平降低（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics 組細胞ROS、LDH 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細胞ROS、LDH 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表4）。

表4 各組細胞ROS、LDH檢測水平（±s，n=6）Tab.4 Detection levels of ROS and LDH in cells of each group （±s，n=6）

表4 各組細胞ROS、LDH檢測水平（±s，n=6）Tab.4 Detection levels of ROS and LDH in cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control ROS/（×103A.U.）4.64±0.59 43.07±8.221）LDH/（U·kg prot）0.54±0.10 1.32±0.271）6.04±0.832）3）0.56±0.112）3）67.31±10.242）3）41.98±9.041）1.97±0.322）3）1.30±0.251）43.74±8.651）1.33±0.281）

2.4 各組細胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18水平 與對照組相比，H/R 模型組細胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達組細胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18 水平降低（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics 組 細 胞 炎 癥 因 子IL-6、IL-17、IL-18 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表5）。

表5 各組細胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18水平（±s，n=6）Tab.5 Levels of cytokines IL-6， IL-17 and IL-18 in each group （±s，n=6）

表5 各組細胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18水平（±s，n=6）Tab.5 Levels of cytokines IL-6， IL-17 and IL-18 in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

IL-18/（ng·L-1）12.62±1.10 67.25±7.281）14.01±1.132）3）84.17±9.242）3）64.98±6.121）65.81±7.501）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control IL-6/（ng·L-1）16.18±2.12 63.72±10.871）18.06±2.982）3）95.83±12.722）3）60.39±8.401）64.96±11.051）IL-17/（ng·L-1）5.65±0.71 37.24±5.821）7.03±1.022）3）58.79±6.922）3）34.97±3.811）37.54±5.531）

2.5 各組細胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平

與對照組相比，H/R 模型組細胞HIF-1α mRNA 水平升高（P<0.05），miR-138-5p 水平降低（P<0.05）。與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達組細胞HIF-1α mRNA 水平升高（P<0.05），miR-138-5p 水平降低（P<0.05）；H/R+miR-138-5p mimics 組 細 胞miR-138-5p 水 平 升 高（P<0.05），HIF-1α mRNA 水平降低（P<0.05）。與H/R模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表6）。

表6 各組細胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平（±s，n=6）Tab.6 miR-138-5p and HIF-1α mRNA level of cells in each group （±s，n=6）

表6 各組細胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平（±s，n=6）Tab.6 miR-138-5p and HIF-1α mRNA level of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control miR-138-5p/U6 1.01±0.08 0.82±0.071）HIF-1α/GAPDH 0.98±0.09 1.29±0.111）0.37±0.052）3）1.98±0.182）3）0.99±0.122）3）1.31±0.101）1.30±0.131）1.04±0.102）3）0.80±0.091）0.83±0.061）

2.6 Western blot檢測各組細胞凋亡蛋白caspase-9、Bax 及HIF-1α 蛋白水平 與對照組相比，H/R 模型組細胞caspase-9、Bax 及HIF-1α 蛋白水平升高（P<0.05）。與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達組細胞HIF-1α 蛋白水平升高（P<0.05），caspase-9、Bax 蛋 白 水 平 降 低（P<0.05）；H/R+miR-138-5p mimics 組細胞HIF-1α 蛋白水平降低（P<0.05），caspase-9、Bax 蛋白水平升高（P<0.05）。與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細胞caspase-9、Bax 及HIF-1α蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2、表7）。

圖2 蛋白免疫印跡檢測各組細胞凋亡蛋白caspase-9、Bax及HIF-1α的表達Fig.2 Apoptosis proteins caspase-9， Bax and HIF-1α were detected by Western blot

表7 各組細胞caspase-9、Bax及HIF-1α蛋白表達水平（±s，n=6）Tab.7 caspase-9， Bax and HIF-1α protein expression levels of cells in each group （±s，n=6）

表7 各組細胞caspase-9、Bax及HIF-1α蛋白表達水平（±s，n=6）Tab.7 caspase-9， Bax and HIF-1α protein expression levels of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

HIF-1α/GAPDH 0.48±0.05 0.63±0.061）1.38±0.172）3）0.49±0.042）3）0.62±0.071）0.64±0.051）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control caspase-9/GAPDH 0.37±0.04 0.86±0.121）0.39±0.052）3）1.29±0.162）3）0.85±0.121）0.87±0.111）Bax/GAPDH 0.41±0.07 0.95±0.111）0.43±0.082）3）1.34±0.152）3）0.94±0.101）0.96±0.131）

3 討論

缺血再灌注發(fā)生后，血管內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致ROS、自由基大量產(chǎn)生釋放，誘導(dǎo)促炎因子過表達，造成血管內(nèi)皮細胞嚴重損傷與凋亡，是缺血再灌注組織損傷的主要發(fā)病機制之一，建立血管內(nèi)皮細胞H/R 模型，對于體外研究組織缺血再灌注損傷具有重大意義［13-14］。本研究給予體外培養(yǎng)的HUVECs 缺氧5 h，再進行復(fù)氧1 h 處理，誘導(dǎo)建立細胞模型，結(jié)果顯示，相比未做處理的細胞，其凋亡率、細胞ROS、LDH、IL-6、IL-17 及IL-18 水平、細胞caspase-9 及Bax 蛋白水平升高，細胞活力降低，表明H/R 可誘導(dǎo)ROS、促炎細胞因子大量產(chǎn)生釋放，引發(fā)過氧化及炎癥反應(yīng)，促使細胞凋亡，造成嚴重的細胞損傷，揭示H/R模型構(gòu)建成功。

LncRNA SNHG12是細胞存活、凋亡及損傷的重要調(diào)控因子，在腦缺血再灌注損傷后，表達水平會有所上調(diào)，發(fā)揮腦組織保護作用，過表達LncRNA SNHG12，可抑制自噬，降低缺血再灌注誘導(dǎo)的ROS和丙二醛（malondialdehyde，MDA）釋放，抑制氧化應(yīng)激，顯著提高細胞活力，減弱其凋亡，改善腦缺血再灌注損傷［15-17］。本研究結(jié)果顯示，過表達H/R 模型細胞中LncRNA SNHG12，可增強細胞活力，降低細胞凋亡率、細胞ROS、LDH、IL-6、IL-17及IL-18水平、細胞caspase-9 與Bax 蛋白水平，表明LncRNA SNHG12 表達會在細胞H/R 后保護性升高，促進其表達，可阻止氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，促使細胞存活，抑制其凋亡，減輕細胞損傷，進一步增強LncRNA SNHG12的細胞保護作用。

HIF-1α 作為一種缺氧誘導(dǎo)因子，在H/R 處理后，表達會上調(diào)，可保護細胞免于H/R造成的炎癥及氧化應(yīng)激損傷［18］。miR-138-5p 是HIF-1α 的一個調(diào)控因子，可負向調(diào)節(jié)其表達水平，且缺血再灌注可誘導(dǎo)miR-138-5p 表達上調(diào)，而下調(diào)miR-138-5p 表達可顯著降低心肌細胞凋亡率，減輕心肌梗死后心肌組織損傷，改善心功能［8，19］。另有研究表明，LncRNA SNHG12 可正調(diào)控HIF-1α 表達，改善氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞表型變化，因而推測調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 軸可能是LncRNA SNHG12 改善H/R 引發(fā)的人血管內(nèi)皮細胞損傷的分子機制［20］。本研究結(jié)果顯示，過表達H/R 模型細胞中miR-138-5p，可降低其細胞活力、細胞HIF-1α mRNA 及蛋白水平，升高細胞凋亡率、細胞ROS、LDH、IL-6、IL-17 及IL-18 水平、細胞caspase-9 與Bax蛋白水平，表明miR-138-5p/HIF-1α 軸參與介導(dǎo)H/R引發(fā)的血管內(nèi)皮細胞損傷過程，促進miR-138-5p 表達，可下調(diào)HIF-1α表達，加重細胞損傷及凋亡，且在H/R 模型細胞中過表達LncRNA SNHG12，可降低其miR-138-5p 水平，升高HIF-1α mRNA 及蛋白水平，但Lnc-RNA SNHG12改善H/R 人血管內(nèi)皮細胞損傷是否通過調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α實現(xiàn)的，目前尚未有明確報道，本研究為了對此進行研究驗證，于H/R模型細胞中共轉(zhuǎn)染了LncRNA SNHG12 過表達質(zhì)粒和miR-138-5p mimics，結(jié)果顯示，以miR-138-5p mimics 可減弱LncRNA SNHG12 阻止H/R 引發(fā)的嚴重與氧化應(yīng)激，增強細胞活力的作用，逆轉(zhuǎn)其抗凋亡功效，表明LncRNA SNHG12 阻止H/R 引發(fā)的炎癥與氧化應(yīng)激，促使細胞活力增強和逆轉(zhuǎn)其抗凋亡功效，最終改善H/R 人血管內(nèi)皮細胞損傷是通過下調(diào)miR-138-5p，上調(diào)HIF-1α表達實現(xiàn)的。

總 之，LncRNA SNHG12 可 下 調(diào)miR-138-5p 表達，促進HIF-1α 表達，抑制ROS 和炎癥細胞因子釋放，阻止氧化應(yīng)激及炎癥發(fā)生發(fā)展，增強細胞活力，減弱凋亡過程，改善細胞損傷，調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 軸是其分子機制之一，本研究為臨床各種組織器官缺血再灌注損傷的防治提供了新的治療靶點，促進了心血管疾病治療策略的發(fā)展。