李進(jìn)冬，徐 震，張 楠，高 一，瞿建江，季曉慧△

（1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300； 2. 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004； 3. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214023）

機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的失衡可損傷胰島細(xì)胞功能，同時(shí)降低外周組織對(duì)胰島素的敏感性，是導(dǎo)致糖尿病的重要因素［1］。氧化應(yīng)激損傷可促進(jìn)2 型糖尿病患者動(dòng)樣硬化的發(fā)生，故成為動(dòng)脈硬化干預(yù)的重要手段［2］。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）在氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體在病理狀態(tài)下發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2 會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活下游醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素加氧酶-1（HO-1）等基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，達(dá)到抗氧化的目的。研究表明，在多種因素刺激下，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）可由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型，VSMC 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是一個(gè)主動(dòng)、可逆轉(zhuǎn)、受高度調(diào)控且可預(yù)防的過(guò)程，在動(dòng)脈硬化病變的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用［3］。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）可通過(guò)刺激VSMC 發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而由收縮表型向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，最終引起動(dòng)脈硬化［4］。萊菔硫烷（SFN）屬異硫氰酸鹽類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、心血管保護(hù)等治療作用，在多種器官及組織中可激活Nrf2 相關(guān)信號(hào)通路，提高組織抗氧化應(yīng)激能力，從而發(fā)揮保護(hù)作用［5］。本研究中以大鼠VSMC 為研究對(duì)象，探討了SFN 在AGE 誘導(dǎo)的VSMC 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中所起的作用及其機(jī)制，以期為臨床預(yù)防及治療糖尿病患者動(dòng)脈硬化提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：DNM-9602型酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；TG16W型微量高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；GBOX -CHEMI-XX9-E 型高性能熒光、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（基因有限公司）。

試藥：SFN（美國(guó)MedChemExpress公司，批號(hào)為HY-13755）；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（美國(guó)Bio-World 公司，批號(hào)為BS70000）；Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）抗體（批號(hào)為WL03358）、骨橋蛋白（OPN）抗體（批號(hào)為WL00691），均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、鈣離子的檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A003-1-2、A001-3-2、C004-2-1）；Nrf2 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)為16396-1-AP）；NQO1抗體（批號(hào)為ab80588）、HO - 1 抗體（批號(hào)為ab189491），均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；RIPA 裂解液（批號(hào)為P0013B），苯甲基磺酰氟（PMSF，批號(hào)為ST506-2）、5×蛋白上樣緩沖液（批號(hào)為P0015），均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AGE（南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室制備［6］）。

細(xì)胞：大鼠VSMC（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號(hào)為ZQ0847）。

1.2 分組與處理

取細(xì)胞培養(yǎng)傳代至第5 代的VSMC 適量，按細(xì)胞密度每孔2 × 105個(gè)均勻接種于6 孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組［普通培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d+ 含牛血清白蛋白（BSA）的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d］、AGE 組（普通培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d + 含200 mg/L的AGE培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d）、SFN組（含10μmol/L的SFN 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d + 含BSA 的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d）、SFN + AGE 組（含10 μmol/ L 的SFN 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d +含200 mg/L的AGE培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d）。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

鈣離子、MDA 含量及SOD活性：取培養(yǎng)完成后各組細(xì)胞適量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。平行操作3次。

蛋白表達(dá)水平：采用Western blot法。取培養(yǎng)完成后各組細(xì)胞適量，加入細(xì)胞裂解液［RIPA - PMSF（100∶1，V/V）］，提取總蛋白，按4∶1比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃下加熱10 min。取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶封閉，孵育α - SMA、RUNX2、OPN、Nrf2、NQO1、HO-1、GAPDH 及β-actin 的一抗孵育（均以1∶1 000 稀釋?zhuān)┻^(guò)夜（4 ℃），洗脫，室溫孵育二抗1 h，顯影、定影。采取半定量分析法解讀結(jié)果，以?xún)?nèi)參GAPDH 及β - actin 信號(hào)強(qiáng)度為基準(zhǔn)，校正檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 鈣離子、MDA 含量及SOD 活性

與對(duì)照組比較，AGE 組細(xì)胞內(nèi)鈣離子、MDA 水平均顯著升高，SOD 水平顯著降低（P< 0.05）；與AGE 組比較，SFN + AGE 組細(xì)胞內(nèi)鈣離子、MDA 水平均顯著降低，SOD水平顯著升高（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子、MDA及SOD水平比較（，n=3）Tab.1 Comparison of intracellular calcium ion，MDA and SOD levels in each group（，n = 3）

表1 各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子、MDA及SOD水平比較（，n=3）Tab.1 Comparison of intracellular calcium ion，MDA and SOD levels in each group（，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，*P < 0.05；與AGE 組比較，#P < 0.05。圖1、圖2同。Note：Compared with those in the control group，*P < 0.05. Compared with those in the AGE group，#P < 0.05（for Tab.1 and Fig.1 - 2）.

SOD（U/mg）429.91±23.68 310.01±28.35*458.50±31.33 402.97±24.61#組別對(duì)照組AGE組SFN組SFN+AGE組鈣離子（mmol/L）1.23±0.05 2.52±0.19*1.21±0.04 1.71±0.15#MDA（nmol/mg）1.95±0.08 3.22±0.24*1.84±0.11 2.50±0.27#

2.2 OPN，RUNX2，α-SMA 蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，AGE 組細(xì)胞內(nèi)OPN 和RUNX2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與AGE 組比較，SFN + AGE 組細(xì)胞內(nèi)OPN和RUNX2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，α - SMA 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞內(nèi)OPN、RUNX2及α-SMA蛋白表達(dá)水平A.Electropherograms B.Data statistics（B1.OPN B2.RUNX2 B3.α - SMA）Fig.1 Expression levels of intracellular OPN，RUNX2 and α - SMA proteins

2.3 Nrf2，NQO1，HO-1 蛋白表達(dá)水平

與AGE 組比較，SFN + AGE 組細(xì)胞內(nèi)Nrf2，NQO1，HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1及HO-1蛋白表達(dá)水平A.Electropherograms B.Data statistics（B1.Nrf2 B2.NQO1 B3.HO - 1）Fig.2 Expression levels of intracellular Nrf2，NQO1 and HO - 1 proteins

3 討論

動(dòng)脈硬化是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，其引起的心血管疾病可嚴(yán)重影響該類(lèi)患者的長(zhǎng)期生存率。研究表明，多種原因引起的氧化應(yīng)激損傷在糖尿病患者動(dòng)脈硬化形成中發(fā)揮著重要作用［7］。

VSMC 通常位于動(dòng)脈中膜內(nèi)，以收縮表型存在，主要作用為維持血管的彈性和收縮血管。在受到氧化應(yīng)激損傷等刺激時(shí)，其由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)分化，從而促進(jìn)動(dòng)脈硬化的發(fā)生與發(fā)展。在這一過(guò)程中，細(xì)胞收縮表型標(biāo)志物α - SMA、平滑肌- 22α 等丟失，而合成表型標(biāo)志物OPN、RUNX2、堿性磷酸酶等增加［8］。糖尿病患者通常合并糖代謝異常。在糖尿病患者體內(nèi)，AGE的表達(dá)量明顯增加，而AGE 可通過(guò)刺激細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷從而引起VSMC 轉(zhuǎn)分化［9］。本研究結(jié)果顯示，VSMC 經(jīng)AGE 刺激后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，成骨細(xì)胞標(biāo)志物OPN，RUNX2 蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象。

Nrf2是機(jī)體調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激能力的重要轉(zhuǎn)錄因子，下游NQO1及HO-1是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，可維持細(xì)胞的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)［10］。當(dāng)機(jī)體遭受氧化應(yīng)激損傷時(shí)，外源性刺激物可激活機(jī)體Nrf2基因，并進(jìn)一步上調(diào)NQO1，HO-1基因的表達(dá)，從而提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力以減輕損傷［11］。SFN 可激活多種組織內(nèi)Nrf2基因的表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激引起的損傷，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［12］、肝臟缺血再灌注損傷［13］及心肌缺血再灌注損傷［14］等。本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AGE 刺激后VSMC 內(nèi)氧化損傷顯著，表現(xiàn)為MDA 水平升高，SOD 水平下降。SFN +AGE 組細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平顯著降低，OPN、RUNX2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明SFN 能減輕AGE 誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣化；且細(xì)胞內(nèi)MDA 水平下降，SOD 水平升高，Nrf2，NQO1，HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高，表明AGE 可能通過(guò)激活細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)從而引起細(xì)胞鈣化，SFN 可提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，從而減輕AGE引起的細(xì)胞鈣化，其機(jī)制可能與SFN 激活Nrf2 通路進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶NQO1和HO-1的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，SFN 可增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，從而抑制AGE 誘導(dǎo)的VSMC 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)Nrf2 信號(hào)通路的激活有關(guān)。不足，本研究?jī)H涉及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，后續(xù)需在動(dòng)物層面更進(jìn)一步闡明SFN對(duì)糖尿病引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)機(jī)制。