罌粟科多刺綠絨蒿(Meconopsishorridula) 是一年或多年的草本綠絨蒿屬植物。這種植物一般生長在海拔3 600～5 100 m的草坡上,產(chǎn)于我國的云南、四川、青海、甘肅和西藏等地,在尼泊爾、錫金、不丹也有分布[1-2]?！恫厮幹尽分袑⒕G絨蒿屬植物記載為藏藥“吾巴拉”,入藥部位為全草或地上部分,性寒、味苦、有小毒,具有清熱、止痛、活血化瘀等功效,可有效清除體內(nèi)的過氧自由基,抑制細(xì)胞的退化、衰老及癌癥的發(fā)生,還具有保護(hù)急性心肌缺血的作用,臨床上主要以復(fù)方形式入藥[3-4]。綠絨蒿屬植物是野生高山花卉,具有“高山牡丹”的美譽(yù),其化學(xué)成分主要包括揮發(fā)性成分、黃酮類化合物、生物堿等[5-7]。目前有研究表明可從該植物中檢測到42種生物堿,其中包括碎葉紫堇堿、原鴉片堿、二氫血根堿、小檗堿等[8-11]。

研究顯示糖尿病(diabetes mellitus,DM)、顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm,IA)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)和動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage,aSAH)的發(fā)病均與氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)密切相關(guān)[12-15]。在一般情況下,機(jī)體內(nèi)的抗氧化作用與氧化作用處于一種平衡,然而由于某種因素導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)抗氧化與氧化作用失衡,傾向于氧化,即產(chǎn)生氧化應(yīng)激[16]。有研究表明綠絨蒿中的總生物堿具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17-19],故本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)對多刺綠絨蒿中碎葉紫堇堿的含量進(jìn)行測定,通過薄層生物自顯影技術(shù)(TLC-Bio)判定其抗氧化活性,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出碎葉紫堇堿干預(yù)氧化應(yīng)激性疾病的潛在作用靶點(diǎn)和成分,分析潛在作用靶點(diǎn)參與的通路,解釋碎葉紫堇堿輔助治療以上4種氧化應(yīng)激性疾病的作用機(jī)制。為多刺綠絨蒿中生物堿治療氧化應(yīng)激性疾病的基礎(chǔ)藥理學(xué)提供方向和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 百萬分之一電子天平(TOLEDOXR6TUD5,梅特勒托利多科技有限公司);萬分之一電子天平(BSA224S,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB Sciex API4000,美國AB Sciex公司);超純水機(jī)(UPR-II-20L,四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材與試劑 碎葉紫堇堿(AF21020908,成都埃法生物科技有限公司,純度98%);2,2-聯(lián)苯基-1-苦肼基自由基(C10505863,上海麥克林生化科技有限公司);多刺綠絨蒿(由重慶市中藥研究院劉翔副研究員鑒定基原);10 cm×20 cm薄層板(青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司);乙腈和甲醇(色譜純,美國TEDIA公司);其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 多刺綠絨蒿中碎葉紫堇堿的含量測定

1.3.1 儀器條件 色譜柱為ACE Excel 3 Super C18柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);進(jìn)樣體積為2 μL;流動相為A相,0.2%甲酸溶液,B相,乙腈;流速為0.25 mL/min;梯度洗脫為0～0.5 min,0%～5% B; 0.5～3.5 min,5%～95% B; 3.5～5 min,95% B;5～5.5 min,95%～5% B;5.5～8 min,5%～0% B。

采用電噴霧離子源(ES),在正離子模式下掃描,離子源溫度(TENP)為600 ℃; 正離子模式下噴霧電壓(IS)為5 500 V;氣簾氣壓力(CUR)為15 psi;霧化氣壓力(GS1)為40 psi;輔助氣壓力(GS2)為55 psi。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取碎葉紫堇堿對照品適量,加甲醇配成質(zhì)量濃度為0.587 mg/mL的對照品溶液。將碎葉紫堇堿對照品溶液用甲醇逐級稀釋成由0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 μg/mL組成的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定重量,回流處理1 h,放冷,濾過,稱定重量,減少的重量用甲醇補(bǔ)足,過0.22 μm的微孔濾膜,作為供試品溶液。

1.4 利用薄層生物自顯影對多刺綠絨蒿中的抗氧化活性成分進(jìn)行分析

1.4.1 制備碎葉紫堇堿對照品溶液 精密稱取適量的碎葉紫堇堿對照品,以甲醇為溶劑,配制成質(zhì)量濃度為58.7 μg/mL和5.87 μg/mL的溶液。

1.4.2 TLC-Bio的薄層條件 按照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)試驗(yàn),梯度吸取“1.3.2”項下制備的對照品溶液,分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-丙酮(6∶4)為展開劑,展開,取出,晾干,日光下檢視;噴以0.1%的2,2-聯(lián)苯基-1-苦肼基自由基乙醇溶液,晾干,37 ℃孵化20 min,置于日光下檢視。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.5.1 碎葉紫堇堿成分靶標(biāo)收集 首先通過PubChem數(shù)據(jù)庫查找碎葉紫堇堿的SMILES,然后通過使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(設(shè)定Probability*≥0.1為篩選條件)和Super-PRED數(shù)據(jù)庫(設(shè)定Probability≥50%為篩選條件)獲取碎葉紫堇堿的靶點(diǎn)。

1.5.2 疾病靶標(biāo)收集 分別以“aneurysmal subarachnoid hemorrhage、intracranial aneurysm、chronic obstructive pulmonary disease、diabetes mellitus”作為關(guān)鍵詞,按照相關(guān)性得分(EI_gda=1)作為條件,利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫對疾病的相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行搜索并篩選;以相關(guān)性得分(Relevance score≥5)為條件,利用GeneCards數(shù)據(jù)庫對疾病的靶標(biāo)進(jìn)行搜索并篩選,最后將兩個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果取并集。

1.5.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選核心靶標(biāo) 將碎葉紫堇堿的成分靶標(biāo)、DM、IA、COPD和aSAH的靶標(biāo)分別導(dǎo)入Venny 2.1.0中,繪制韋恩圖并獲取成分靶標(biāo)和4種疾病靶標(biāo)的交集,對靶標(biāo)進(jìn)行初步篩選,然后通過STRING數(shù)據(jù)庫繪制其相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)(combined_score>0.9),最后對其進(jìn)行可視化分析并構(gòu)建化合物和疾病靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)。

1.5.4 KEGG通路的富集與分析 為了分析碎葉紫堇堿與DM、IA、COPD、aSAH交集靶標(biāo)具體的功能以及其在KEGG通路中的作用,以人類為研究對象,使用Metascape數(shù)據(jù)庫對篩選出的靶標(biāo)進(jìn)行通路的富集與分析,以解析碎葉紫堇堿干預(yù)氧化應(yīng)激性疾病的潛在作用機(jī)制。

1.5.5 分子對接驗(yàn)證 取PPI網(wǎng)絡(luò)中以degree,closeness,betweenness為條件篩選出的核心靶標(biāo)作為受體蛋白,將碎葉紫堇堿作為配體分子。通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載碎葉紫堇堿的2D結(jié)構(gòu),然后使用軟件Chem Draw 20.0.0.41對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu),并將文件格式保存為“mol2”。使用軟件Discovery Studio 2019 Client對其進(jìn)行加氫并產(chǎn)生相應(yīng)的異構(gòu)體;通過PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶標(biāo)受體蛋白的結(jié)構(gòu),并將文件格式保存為“pdb”,然后通過使用軟件Discovery Studio 2019 Client對其進(jìn)行蛋白修飾,去除靶蛋白中水分子等非蛋白成分和配體。通過軟件Discovery Studio 2019 Client對以上兩個文件進(jìn)行CDocker分子對接和LibDock分子對接,CDocker的對接主要是根據(jù)配體與受體相互作用的能量(-CDocker Interaction Energy,-ECD)進(jìn)行評價,而LibDock對接則主要是根據(jù)其對接的打分(LibDock score)進(jìn)行評價。

2 結(jié)果

2.1 多刺綠絨蒿中碎葉紫堇堿的含量測定

2.1.1 線性關(guān)系及方法檢出限 以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=330.711 8x-1 074.876 4,相關(guān)系數(shù)為0.997 2;檢測線為5 ng/mL;定量線為10 ng/mL。

2.1.2 樣品的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多刺綠絨蒿中碎葉紫堇堿的含量為0.113 7 μg/mL。

2.2 TLC-Bio分析多刺綠絨蒿的抗氧化活性 根據(jù)TLC-Bio的結(jié)果可知,顯色前薄層板背景為白色(圖1A),顯色后的薄層板背景變?yōu)樽仙?圖1B),這說明薄層板本身沒有抗氧化活性,而顯色后的碎葉紫堇堿對照品卻顯現(xiàn)出明顯的黃白色斑點(diǎn),這說明其具有良好的抗氧化活性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證當(dāng)0.058 7 μg/μL的對照品溶液點(diǎn)樣量低于1 μL時黃白色斑點(diǎn)不明顯。當(dāng)0.005 87 μg/μL的對照品溶液點(diǎn)樣量低于9 μL時幾乎無黃白色斑點(diǎn),即TLC-Bio中碎葉紫堇堿的檢出限為0.052 83 μg。

A:普通色譜圖;B:生物自顯影色譜圖。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.3.1 碎葉紫堇堿的靶標(biāo)分析結(jié)果 基于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(設(shè)定Probability*≥0.1為篩選條件)和Super-PRED數(shù)據(jù)庫(設(shè)定Probability≥50%為篩選條件)獲取碎葉紫堇堿的靶標(biāo),將兩個數(shù)據(jù)庫獲得的靶標(biāo)合并去除重復(fù)值后,共得到靶標(biāo)211個,將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1繪制化學(xué)成分靶點(diǎn)圖(圖2)。

圖2 碎葉紫堇堿的靶標(biāo)

2.3.2 疾病靶標(biāo)分析結(jié)果 通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫下載DM、IA、COPD和aSAH的相關(guān)靶標(biāo),共獲得3 091個相關(guān)靶標(biāo),對靶標(biāo)進(jìn)行篩選(以EI=1為參數(shù)指標(biāo))后得到2 770個靶標(biāo);通過GeneCards數(shù)據(jù)庫下載DM、IA、COPD和aSAH的相關(guān)靶標(biāo),共獲得11 685個相關(guān)靶標(biāo),對靶標(biāo)進(jìn)行篩選(Relevance score>5)后得到4 640個靶標(biāo)。最終將兩個數(shù)據(jù)庫得到的靶標(biāo)合并去除重復(fù)值后得到5 819個疾病相關(guān)靶標(biāo),繪制化合物疾病靶點(diǎn)圖(圖3)。

圖3 化合物疾病靶點(diǎn)

2.3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶標(biāo)的篩選分析結(jié)果 將211個碎葉紫堇堿相關(guān)靶標(biāo)與5 819個疾病相關(guān)靶標(biāo)取交集,最終獲得了168個交集靶標(biāo)(圖4)。利用STRING數(shù)據(jù)庫對這168個相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的分析(PPI),然后根據(jù)得分(PPI得分>0.9)對關(guān)鍵的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行篩選,最后通過軟件Cytoscape 3.7.1構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖5)。圖中根據(jù)度(degree)值繪制圓形節(jié)點(diǎn)的大小;根據(jù)結(jié)合分?jǐn)?shù)繪制顏色的深淺和連接線的粗細(xì),度值越大就表示該靶點(diǎn)越關(guān)鍵。通過分析可知,SRC、HSP90AA1、EGFR、PIK3R1等靶點(diǎn)可能為碎葉紫堇堿治療DM、IA、COPD和aSAH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 碎葉紫堇堿與疾病靶點(diǎn)韋恩

圖5 碎葉紫堇堿靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過軟件Cytoscape 3.7.1中的CytoNCA功能對構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)進(jìn)行分析,分別以betweenness、closeness和degree的中位數(shù)作為閾值(0、0.057 6、3)對其進(jìn)行篩選,最終獲得34個相互作用的核心靶標(biāo),結(jié)果見表1,繪制34個核心靶標(biāo)作用圖和化合物-核心靶點(diǎn)-疾病圖,結(jié)果見圖6、圖7。

表1 核心靶點(diǎn)

圖6 34個核心靶標(biāo)作用圖

圖7 化合物-核心靶點(diǎn)-疾病圖

2.3.4 KEGG通路富集分析結(jié)果 通過使用Metascape數(shù)據(jù)庫對34個核心靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路的富集與分析,共獲得118條信號通路,取按LogP分組的前8條通路繪制通路條形圖(圖8)。圖中條形的長度代表Log10(P)值的大小,條形顏色根據(jù)P值著色。

圖8 通路條形圖

取LogP值最小的前20條通路進(jìn)行如下分析,結(jié)果見表2,表中Log10(P)值表示疾病與通路的相關(guān)性,當(dāng)Log10(P)值越小時其相關(guān)性就越強(qiáng);當(dāng)富集的相關(guān)靶標(biāo)越多時其數(shù)量值就越大。將分析得到的信號通路、篩選后的靶標(biāo)和化合物分別導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.7.1中,構(gòu)建“通路-靶標(biāo)-化合物”網(wǎng)絡(luò)(圖9)。圖9中紫色代表碎葉紫堇堿;綠色代表信號通路;粉色代表核心靶標(biāo);連線代表信號通路、疾病靶標(biāo)和化合物三者之間的關(guān)系。最后通過對分析結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的分析,可知有HSP90AA1、CDK4、CDK2、NFKB1等28個核心蛋白靶標(biāo),對應(yīng)碎葉紫堇堿成分以及Pathways in cancer、Prostate cancer、PI3K-Akt signaling pathway、Viral carcinogenesis等20條通路。

表2 核心靶標(biāo)KEGG通路富集分析表

圖9 通路-靶標(biāo)-化合物

2.3.5 分子對接結(jié)果 以碎葉紫堇堿為配體,利用Discovery Studio 2019 Client軟件中CDocker和LibDock功能進(jìn)行分子對接。最終34個靶點(diǎn)均可進(jìn)行CDocker對接,29個靶點(diǎn)可進(jìn)行LibDock對接,5個不可進(jìn)行LibDock對接。CDocker和LibDock對接結(jié)果見表3。取兩個模塊都可以對接的CDocker 3D作圖,結(jié)果見圖10。

表3 分子對接結(jié)果

圖10 CDocker 3D結(jié)構(gòu)

3 討論

被譽(yù)為“世界屋脊”的青藏高原具有非常特殊的生長環(huán)境,包括氣溫低、空氣稀薄、海拔高、太陽輻射強(qiáng)等特點(diǎn),正是因?yàn)檫@樣的生長環(huán)境導(dǎo)致多刺綠絨蒿中富含萜類、黃酮類和生物堿類等成分,其中生物堿類等成分是其特征性成分[20-21]。除了在《藏藥志》中記載了綠絨蒿屬植物可有效清除體內(nèi)的過氧自由基外,還有研究表明全緣葉綠絨蒿植株或花的提取物也可以清除多種自由基,在治療氧化應(yīng)激方面疾病具有良好的前景[22]。本課題旨在研究多刺綠絨蒿中的碎葉紫堇堿,探討其在治療氧化應(yīng)激方面疾病的作用機(jī)制。首先通過HPLC-MS/MS對多刺綠絨蒿中碎葉紫堇堿的含量進(jìn)行測定,然后通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)TLC-Bio證明碎葉紫堇堿的抗氧化能力。 當(dāng)活性氧(reactive oxygen species,ROS)在機(jī)體內(nèi)過多的產(chǎn)生時,會引起氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡,即氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激與許多生理和病理現(xiàn)象有關(guān),當(dāng)過多的產(chǎn)生ROS時,會對細(xì)胞、組織造成損害,從而導(dǎo)致DR的產(chǎn)生[23]。此外,當(dāng)產(chǎn)生的ROS過多時還會產(chǎn)生炎癥。有大量研究表明,IA和COPD的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激在炎癥級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)[12,24]。aSAH患者致殘和死亡的重要原因是由早期腦損傷造成的,而氧化應(yīng)激反應(yīng)影響著早期腦損傷的形成[25]?？偠灾?DM、IA、COPD和aSAH的發(fā)病機(jī)制均與氧化應(yīng)激緊密相關(guān)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探索碎葉紫堇堿對治療DM、IA、COPD和aSAH的作用機(jī)制,經(jīng)篩選獲得碎葉紫堇堿作用于4種疾病的34個潛在作用靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)表明HSP90AA1、SRC、ESR1、HIF1A等可能是碎葉紫堇堿通過抗氧化作用治療DM、IA、COPD和aSAH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中HIF1A是介導(dǎo)對組織氧水平變化的適應(yīng)性反應(yīng)的主要因素,HIF1A在正常氧條件下的細(xì)胞中可被泛素化標(biāo)記實(shí)現(xiàn)快速降解,但在缺氧條件下卻穩(wěn)定[26]。HSP90AAl是熱休克蛋白家族中重要的成員,由HSP90AA1基因編碼的蛋白質(zhì)可作為同型二聚體發(fā)揮作用。ESR1蛋白是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,可與雌激素受體2形成同型二聚體或異型二聚體,并影響靶組織中的細(xì)胞增殖和分化。有研究表明ESR1和HSP90AA1可以共同調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路。經(jīng)KEGG通路富集結(jié)果分析,Pathways in cancer、Prostate cancer、PI3K-Akt等通路直接或者間接參與DM、IA、COPD和aSAH的形成。PI3K-Akt信號通路是一種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,響應(yīng)細(xì)胞外信號,促進(jìn)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成?？梢酝ㄟ^P13K/Akt通路激活Nrf2/HO-1途徑,從而使MC3T3-E1和IPEC-J2細(xì)胞不受氧化損傷,降低細(xì)胞的凋亡率和ROS[27]。分子對接結(jié)果顯示關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)間具有較好的結(jié)合活性,進(jìn)一步驗(yàn)證了該研究的預(yù)測較為可靠。

通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接分析了多刺綠絨蒿中碎葉紫堇堿治療氧化應(yīng)激性疾病潛在的作用機(jī)制,本研究發(fā)現(xiàn)多刺綠絨蒿中碎葉紫堇堿的含量較高且具有良好的抗氧化能力。經(jīng)分析碎葉紫堇堿通過多個靶點(diǎn)、多條通路協(xié)同作用發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,其可能通過調(diào)控PI3K-Akt、Pathways in cancer和Prostate cancer等信號通路中的HIF1A、HSP90AA1和ESR1等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。