支氣管哮喘(bronchial asthma)簡稱哮喘,是一種以慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特征的異質(zhì)性疾病[1]。其中,氣道重塑是哮喘最主要的病理特征之一[2]。哮喘患者反復(fù)發(fā)生的氣道炎癥,引起肺組織損傷以及不正常修復(fù),最終導(dǎo)致氣道壁結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,這一過程被稱為氣道重塑。氣道重塑是引起哮喘患者不可逆性氣流受限、肺功能下降和治療效果不佳的主要原因[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)/Smad3信號通路在哮喘氣道重塑過程中起著重要作用[4]。NLRP3炎性小體是一種由NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor protein3,NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和半胱天冬氨酸蛋白酶1前體(pro-caspase-1)組成的多蛋白復(fù)合物,對微生物感染、內(nèi)源性危險信號和環(huán)境刺激等作出反應(yīng)。組裝的NLRP3炎性小體可激活蛋白酶1(Caspase-1)誘導(dǎo)消皮素D(gasdermin D, GSDMD)依賴性細(xì)胞焦亡,促進(jìn)IL-1β和IL-18的釋放,有助于先天性免疫防御和穩(wěn)態(tài)維持[5]。最新的研究表明,通過NLRP3炎性小體的激活和GSDMD切割,引起支氣管上皮細(xì)胞焦亡,可加劇過敏原誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。NLRP3炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是哮喘治療的潛在靶點[6]。但NLRP3炎性小體在哮喘氣道重塑中的具體作用和機(jī)制尚不清楚。本研究通過雞卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)誘導(dǎo)制備哮喘小鼠模型,使用NLRP3特異性抑制劑MCC950進(jìn)行干預(yù),觀察NLRP3炎性小體對TGF-β1/Smad3信號通路的調(diào)控作用及對哮喘氣道重塑影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗試劑 雞卵清白蛋白(A5503,V級,美國Sigma公司);氫氧化鋁凝膠(vac-alu-250,美國invivogen公司);MCC950(HY-12815A,美國MedchemExpess公司);AB-PAS 染色試劑盒(G1285,北京索萊寶生物技術(shù)有限公司);IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒(JL18442、JL20253,上海江萊生物技術(shù)有限公司);兔抗小鼠Anti-NLRP3 抗體(GTX00763,美國GeneTex 公司);兔抗小鼠重組Anti-TGF-β1抗體、兔抗小鼠Anti-Smad3抗體、山羊抗兔IgG HRP(ab215715、ab84177、ab6721,英國abcam公司);RNAiso Reagent、qRT-PCR試劑盒(RR820A、RR037A,大連TaKaRa公司);NLRP3和β-actin引物(北京擎科生物有限公司);Anti-Beta Actin抗體、二抗HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG Goat Polyclonal Antibody(EM21002、HA1001,華安生物);高效RIPA組織裂解液、PMSF、10%PAGE 凝膠快速制備試劑盒、Omni-Easy 即用型BCA 蛋白定量試劑盒(PC101、P0100-1mL、PG112-10、ZJ102,上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);4×蛋白上樣緩沖液(P1015-10mL,北京索萊寶生物技術(shù)有限公司);預(yù)染蛋白Marker、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(WJ102、SQ201,上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);脫脂奶粉(A600669-0250,上海生工生物工程有限公司);PVDF膜(美國Milipore公司)。

1.1.2 主要實驗儀器 壓縮空氣式霧化器(403H,中國魚躍醫(yī)療);核酸蛋白測量儀(Nanodrop 1000,美國Thermo scientific公司);熒光定量PCR儀(CFX96,BIO-RAD 公司);酶標(biāo)儀(Multiskan FC,美國Thermo scientific公司);三維冷凍研磨儀(KZ-5F-3D, 武漢賽維爾生物科技有限公司);電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)(PowerPac Basic、ChemiDocTMMP,美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司購買的SPF級BALB/c小鼠[許可證號:SCXK-(湘) 2019-0004)], 24只,6～8周齡,雌性,體重(18.22±0.61) g。動物飼養(yǎng)及實驗環(huán)節(jié)均嚴(yán)格遵照遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會《實驗動物管理條例》進(jìn)行(倫理審查編號:KLL-2021-352)。將24只小鼠按照完全隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(NC組,n=8)、哮喘組(AS組,n=8)和哮喘組+MCC950干預(yù)組(AS+MCC950干預(yù)組,n=8)。在Kim等[7]和Casaro等[8]制作哮喘小鼠模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步改進(jìn)方法建立本研究中的哮喘小鼠模型。AS組和AS+MCC950干預(yù)組小鼠均在第1 天和第13天,通過腹腔、頸部皮下及雙側(cè)大腿根部皮下注射OVA和氫氧化鋁混懸液進(jìn)行致敏,第19 天開始予10% OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā),每天1次,每次 30 min,共激發(fā)5次。AS+MCC950干預(yù)組于第19、21、23 天霧化激發(fā)前30 min,通過腹腔注射NLRP3特異性抑制劑MCC950(10 mg/kg)進(jìn)行干預(yù),共3次。NC組致敏和激發(fā)時以PBS代替OVA,其余處理條件同AS組。

1.2.2 肺組織和BALF標(biāo)本采集 各組小鼠于末次激發(fā)24 h,充分麻醉后經(jīng)腹主動脈處放血處死,暴露胸腔,在結(jié)扎右肺肺門后剪取右肺組織,用于提取肺組織RNA、蛋白和制作石蠟塊。充分暴露頸部氣管,行氣管插管后予PBS液共灌洗3次肺,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),離心,取上清液用于炎癥因子的測定。

1.2.3 HE染色和AB-PAS染色觀察肺組織病理形態(tài) 肺組織標(biāo)本制作成石蠟塊后切片,進(jìn)行HE染色和AB-PAS染色,按試劑盒說明書方法進(jìn)行染色。光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)、氣道上皮杯狀細(xì)胞增生及氣道黏液物質(zhì)分泌情況。

1.2.4 qRT-PCR檢測肺組織NLRP3 mRNA水平 提取小鼠肺組織中的RNA,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。計算出每一樣本定量結(jié)果Ct(threshold cycle)值,采用2-△△Ct法計算NLRP3 mRNA的相對表達(dá)量。β-actin和NLRP3引物序列(表1)。

表1 β-actin和NLRP3引物序列

1.2.5 IHC染色檢測肺組織中NLRP3、TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá) 將肺組織切片常規(guī)脫蠟至水后置于PH 9.0 EDTA 緩沖液中,微波抗原修復(fù)15 min,其余步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。一抗兔抗小鼠Anti-NLRP3 抗體、兔抗小鼠重組Anti-TGF-β1抗體和兔抗小鼠Anti-Smad3抗體稀釋濃度均為1∶500,二抗山羊抗兔IgG HRP抗體稀釋濃度為1∶500。進(jìn)行圖像采集和分析,陽性蛋白的表達(dá)量使用平均積分光密度(Mean IOD)來表示。

1.2.6 Western blot檢測各組小鼠肺組織中NLRP3蛋白表達(dá) 使用組織研磨儀提取各組小鼠肺組織中蛋白,根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明書對樣品進(jìn)行蛋白定量,加入相應(yīng)體積的4×loading buffer 和RIPA 組織裂解液使每個樣品蛋白濃度為2 μg/μL,混勻后煮5 min使蛋白變性。SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)PVDF膜(300 mA電流,轉(zhuǎn)膜120 min),5%脫脂奶粉封閉2 h,加入NLRP3一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜,次日加入二抗HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG Goat Polyclonal Antibody(1∶10 000稀釋),室溫孵育2 h,洗膜后使用ECL發(fā)光液在曝光機(jī)下曝光。Image J進(jìn)行灰度掃描分析結(jié)果,目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.2.7 ELISA法檢測BALF中IL-1β和IL-18炎癥因子水平 根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法檢測BALF上清液中炎癥因子IL-1β和IL-18的含量,在酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度值,再計算其濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理改變 HE和AB-PAS染色結(jié)果顯示,NC組小鼠氣道管壁及肺泡壁結(jié)構(gòu)完整、氣道上皮未見明顯杯狀細(xì)胞增生、管腔未見狹窄、管腔內(nèi)未見黏液分泌,AS組小鼠氣道管壁增厚、氣道上皮大量杯狀細(xì)胞增生、氣道周圍見大量炎癥細(xì)胞浸潤、管腔狹窄,部分管腔內(nèi)見黏液栓,AS+MCC950干預(yù)組小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞和黏液物質(zhì)分泌、氣道周圍炎癥細(xì)胞表達(dá)較AS組減少,管壁稍有增厚,管腔未見明顯狹窄(圖1)。

×200。

2.2 各組小鼠肺組織中NLRP3 mRNA含量的比較 AS 組肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量較 NC 組增高(P<0.01);AS+MCC950干預(yù)組肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量較 AS 組減少(P<0.05,表2)。

表2 各組小鼠肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量

2.3 各組小鼠肺組織中NLRP3、TGF-β1和Smad3蛋白含量的比較 IHC染色結(jié)果顯示,與NC組比較,AS 組肺組織中NLRP3、TGF-β1和Smad3 蛋白表達(dá)量增高(P<0.01),使用MCC950干預(yù)后,AS+MCC950干預(yù)組 NLRP3、TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)量較 AS 組明顯減少(P<0.01,表3、圖2)。Western blot檢測結(jié)果顯示,AS組與NC組、AS+MCC950干預(yù)組相比,肺組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平升高,提示使用MCC950干預(yù)后,可以抑制哮喘小鼠NLRP3蛋白表達(dá)(P<0.05,圖3)。

IHC×200。

1:AS組;2:NC組;3:AS+MCC950干預(yù)組;*:與NC組比較,P <0.05;#:與AS組比較,P <0.05。

表3 IHC染色檢測各組小鼠肺組織NLRP3、TGF-β1和Smad3蛋白含量的比較

2.4 各組小鼠BALF中炎癥因子IL-1β和IL-18表達(dá)水平 與NC組比較,AS組BALF中IL-1β和IL-18濃度明顯增高(P<0.01),AS+MCC950干預(yù)組BALF中IL-1β和IL-18濃度與AS組比較明顯下降(P<0.01,表4)。

表4 各組小鼠BALF中 IL-1β和IL-18表達(dá)比較

3 討論

人體的氣道上皮是接觸變應(yīng)原、病原體等有害物質(zhì)的第一道天然屏障,在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用,以抵抗進(jìn)入呼吸道的各種有害物質(zhì)的入侵[9]。氣道上皮損傷是哮喘發(fā)病的重要標(biāo)志,反復(fù)有害刺激會導(dǎo)致氣道上皮的重復(fù)損傷、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和氣道重塑,引起氣流受限[10]。TGF-β是一個具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞生長因子家族,其中TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3這3個亞型存在于哺乳動物中,而TGF-β1是發(fā)揮生物學(xué)功能的主要因子[11],通過其受體發(fā)出信號,激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器Smad家族成員發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、死亡和遷移[12]。近年來的研究表明,激活TGF-β1/Smad3信號通路可加重哮喘氣道炎癥和氣道重塑,抑制該信號通路可以減輕氣道重塑及氣道炎癥反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果表明,在AS組小鼠氣道管壁明顯增厚、氣道上皮有大量杯狀細(xì)胞增生、管腔狹窄、氣道周圍見大量炎癥細(xì)胞浸潤等氣道重塑表現(xiàn),肺組織中TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)水平較NC組小鼠明顯增高。說明 TGF-β1/Smad3信號通路參與哮喘小鼠氣道重塑過程。

NLRP3是目前研究最多的Nod樣受體家族成員之一,主要表達(dá)在上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞膜[14]。正常狀態(tài)下胞內(nèi)NLRP3的表達(dá)量極低,不能用于組裝或活化NLRP3炎性小體,只能保持不活躍但有應(yīng)答的泛素化狀態(tài)。在一定條件下被激活后,可以誘發(fā)下游通路中炎性因子釋放來調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)[15]。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎性小體被激活后,通過活化蛋白酶Caspase-1及下游GSDMD而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡,導(dǎo)致炎癥因子IL-1β和IL-18大量釋放從而引起炎癥反應(yīng)[16]。Zhuang等[17]研究表明,哮喘小鼠體內(nèi)NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)量增加,炎性因子IL-1β分泌增多。Ma等[18]研究發(fā)現(xiàn),在吸入屋塵螨誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠中,肺部NLRP3炎性小體被激活,并特異性誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞Caspase-1和IL-1β的成熟,NLRP3抑制劑治療顯著減少了氣道炎癥細(xì)胞浸潤和粘液分泌。經(jīng)OVA誘導(dǎo)的野生型和NLRP3(-/-)小鼠,野生型小鼠NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)增強(qiáng),NLRP3(-/-)小鼠表現(xiàn)為BALF中嗜酸性粒細(xì)胞減少、氣道IL-1β表達(dá)水平降低、氣道高反應(yīng)性下降[19]。在哮喘模型中使用NLRP3抑制劑可抑制氣道高反應(yīng)性和肺部炎癥[20],MCC950是一種含二芳基磺酰脲的化合物,被認(rèn)為是一種特異性的小分子抑制劑,可以選擇性地阻斷NLRP3炎性體的激活,進(jìn)一步阻礙IL-1β的成熟和釋放[21 ]。Chen等[ 22]研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950降低了OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織中IL-1β和IL-18的產(chǎn)生,可以顯著減輕哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥。本研究結(jié)果顯示,AS組小鼠肺組織中NLRP3蛋白和mRNA、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平較NC組明顯升高,使用NLRP3特異性抑制劑MCC950干預(yù)后,AS+MCC950干預(yù)組小鼠肺組織中NLRP3蛋白和mRNA、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均較AS組下降,說明MCC950干預(yù)可以抑制哮喘小鼠NLRP3、炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)。通過阻斷NLRP3炎性小體激活對哮喘具有治療作用,但其作用的確切機(jī)制仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn),去泛素化酶OTUB1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3, TRAF3)相互作用介導(dǎo)NLRP3炎性小體激活,促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)的炎癥和重塑發(fā)生,在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要調(diào)控作用[23]。炎性因子IL-1β增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),并與中性粒細(xì)胞性哮喘患者肺功能改善不佳有關(guān)[24]。NLRP3炎性小體在肺泡上皮細(xì)胞中被激活,NLRP3可能通過TGF-β1調(diào)控EMT而參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展,其中,EMT在氣道重塑過程中具有重要作用[25]。NLRP3可能通過調(diào)控TGF-β信號通路來參與氣道重塑過程,但在哮喘氣道重塑中的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,AS組小鼠肺組織中TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)水平較NC組明顯升高,使用NLRP3特異性抑制劑MCC950干預(yù)后,AS+MCC950干預(yù)組小鼠肺組織中TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)水平均較AS組下降,說明MCC950干預(yù)可以抑制哮喘小鼠NLRP3激活,抑制炎癥因子IL-1β的表達(dá),進(jìn)一步下調(diào)TGF-β1、Smad3的生成,從而抑制哮喘小鼠氣道重塑。

綜上所述,NLRP3炎性小體可能通過介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞焦亡產(chǎn)生大量炎癥因子IL-1β和IL-18,上調(diào)肺組織中TGF-β1的生成,進(jìn)一步調(diào)控TGF-β1/Smad3信號通路來促進(jìn)哮喘氣道重塑發(fā)生。MCC950可以抑制哮喘小鼠NLRP3炎性小體的活化和炎癥因子IL-1β和IL-18分泌,下調(diào)TGF-β1和Smad3的表達(dá),其可能機(jī)制是通過干預(yù)NLRP3/IL-1β/TGF-β1/Smad3信號通路來抑制哮喘小鼠氣道重塑。