蘆江會 陳躍文 付晶晶 隆勇杰

(1. 寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗研究院〔寧波市纖維檢驗所〕,浙江 寧波 315000;2. 浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江 杭州 310018)

龍頭魚(Harpodonnehereus)又稱豆腐魚,是合齒魚科、龍頭魚屬的一種魚類,地方名蝦潺、狗母魚、豆腐魚等[1]。在中國,龍頭魚在東海和南海漁業(yè)占有一定的分量,浙江沿海漁民捕撈龍頭魚已有悠久的歷史,因其資源穩(wěn)定,在當?shù)匮睾Ｖ饕~汛期,可占漁獲量的20%～40%,近年來,漁獲量有所增加,分布范圍明顯擴大,東海北部近海龍頭魚資源量最為豐富[2]。龍頭魚含有多種呈味氨基酸,味道鮮美,營養(yǎng)價值高,蛋白質(zhì)含量約占其干重的70%,鈣、磷含量遠高于其他海洋魚類,是名副其實的高蛋白、高鈣、富磷的經(jīng)濟魚類食物[1]。然而,龍頭魚的水分含量在90%以上,肌肉蛋白不穩(wěn)定,難以長期保存,造成龍頭魚資源的嚴重浪費[3]。此外,龍頭魚通常被加工成干制品、魚粉等低附加值產(chǎn)品或直接通過傳統(tǒng)工藝加工,深加工、精加工途徑較少[1]。

蛋白質(zhì)酶解技術(shù)因條件溫和、無有害物質(zhì)產(chǎn)生等優(yōu)點,是提高水產(chǎn)魚類附加值的有效方法。蛋白肽因其高營養(yǎng)價值、抗氧化和抗菌特性而被廣泛應(yīng)用于多種行業(yè)[4]。此外,酶解技術(shù)對蛋白質(zhì)的風味特征發(fā)揮著重要的作用。通過對酶解技術(shù)的控制可以使蛋白質(zhì)獲得較高的氨基酸、小肽和多肽含量,且具有良好的風味。然而,傳統(tǒng)的酶解仍然受到許多條件的限制,例如底物轉(zhuǎn)化率低、酶利用率低和酶水解效率低等[3]。研究[4-5]表明,酶解前采用適當?shù)念A(yù)處理技術(shù),如超聲波、微波、高壓和脈沖電場等現(xiàn)代新興技術(shù),具有改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),提高蛋白酶解效率,改善酶解液功能性質(zhì)等作用。超聲波技術(shù)是一種新型的綠色環(huán)保加工技術(shù),其可以通過機械、熱和空化效應(yīng)增加底物與酶接觸的機會,從而提高酶水解速率[6]。此外,超聲預(yù)處理可以通過破壞底物來增加揮發(fā)性化合物類型對蛋白質(zhì)酶解物的風味產(chǎn)生影響。Wang等[3]發(fā)現(xiàn)不同功率超聲預(yù)處理會對鱈魚頭酶解物風味特性產(chǎn)生影響。然而,關(guān)于超聲預(yù)處理對龍頭魚蛋白肽結(jié)構(gòu)及其風味特性的影響尚未見報道。

研究利用超聲輔助酶解法制備龍頭魚蛋白肽,以木瓜蛋白酶為催化劑,研究不同超聲功率條件下龍頭魚蛋白肽粒徑、水解度、可溶性多肽含量、相對分子質(zhì)量分布等的變化,探究不同超聲強度對制備龍頭魚蛋白肽風味的影響,以期為低值化水產(chǎn)魚類的高值化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍頭魚:浙江碧洋優(yōu)鮮食品股份有限公司;

木瓜蛋白酶:>200 U/mg,上海麥克林生化科技有限公司;

氫氧化鈉、無水乙醇、五水硫酸銅、硫酸、硼酸、鹽酸、無水碳酸鈉:分析純,上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

低溫冷凍箱:DW-380型,杭州科瑞爾制冷科技有限公司;

斬拌機:CM-14型,西班牙Mainca公司;

超聲水浴鍋:BKE-1010HT型,杭州博可超聲波設(shè)備有限公司;

恒溫水浴鍋:HH-2型,陜西鑫昌實驗儀器有限公司;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-3000型,上海亞榮生化儀器廠;

真空冷凍干燥機:SCIENTZ-100FG/A型,寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;

馬爾文激光粒度分析儀:Zetasizer型,英國馬爾文儀器有限公司;

冷凍離心機:TGL-16M型,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;

酶標儀:INFINITE M NANO型,瑞士TECAN公司;

高效液相色譜儀:Easy nLC型,丹麥Proxeon Biosystems公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料及預(yù)處理 捕撈的龍頭魚經(jīng)過冷庫冷凍后置于冰盒中在24 h內(nèi)運送至實驗室。選擇體長15～20 cm、體重40～60 g的龍頭魚作為試驗對象。將冷凍龍頭魚置于4 ℃流水解凍,去除頭部、尾部、魚鰭和內(nèi)臟,利用斬拌機在15 ℃環(huán)境中將其打成勻漿裝入自封袋內(nèi),真空冷凍干燥后制成龍頭魚凍干粉,于-20 ℃冰箱中貯藏備用。

1.3.2 超聲輔助酶解工藝 參照康永鋒等[7]的方法。將龍頭魚凍干粉按m龍頭魚凍干粉∶V水=1∶100 (g/mL)溶解于蒸餾水中,并在溶液中添加木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶添加量6 g/100 g龍頭魚凍干粉),利用超聲波水浴鍋在55 ℃下以不同功率(0,120,240,480,600 W)超聲處理1 h后繼續(xù)置于55 ℃恒溫水浴鍋中酶解4 h。反應(yīng)結(jié)束后將酶解液放置于95 ℃水浴中加熱15 min使木瓜蛋白酶失活。在酶解液中加入無水乙醇至乙醇占總體積的80%,過夜醇沉后抽濾并旋蒸,冷凍干燥(-40 ℃,48 h)制得龍頭魚蛋白肽凍干粉。

1.3.3 粒徑測定 參照Ding等[8]的方法,采用馬爾文激光粒度分析儀對不同超聲功率預(yù)處理制備的龍頭魚蛋白肽凍干粉進行粒徑分布分析。用蒸餾水將各組樣品溶解,得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液,將溶液緩慢加入石英比色皿中,設(shè)置參數(shù)進行掃描測定。

1.3.4 水解度測定 根據(jù)Sereda等[9]的方法稍作修改,使用甲醛滴定法測定α-氨基氮(AN)含量,通過凱氏定氮法測定原料總蛋白氮(TPN)含量。將1 mL樣品溶液溶于60 mL蒸餾水中,混合均勻后用0.05 mol/L NaOH滴定至溶液pH為8.2。然后加入10 mL 38%中性甲醛,用0.05 mol/L NaOH滴定至溶液pH至9.2,記錄加入中性甲醛后消耗NaOH的體積V2。用1 mL蒸餾水代替酶解液作為空白試驗,消耗NaOH的體積為V1。α-氨基氮(AN)及樣品液的水解度(DH)計算如下:

(1)

(2)

式中:

AN——α-氨基氮含量,g/mL;

DH——酶解液的水解度,%;

TPN——總蛋白氮含量,g/mL;

V1——1 mL蒸餾水代替酶解液作為空白試驗,消耗NaOH的體積,mL;

V2——中性甲醛后消耗NaOH溶液的體積,mL;

0.05——NaOH溶液濃度,mol/L;

0.014——相當于1 mL 1 mol/L NaOH的氮氣質(zhì)量,g;

1——滴定過程中酶解液的體積,mL。

1.3.5 可溶性多肽含量測定 根據(jù)Kolakowski[10]的方法稍作修改,采用三氯乙酸法測定可溶性多肽含量,將龍頭魚蛋白肽與20% TCA按體積比1∶1混合搖勻后靜置20 min,12 000 r/min離心10 min,取100 μL上清液,加福林酚甲液500 μL,渦旋均勻后靜置10 min,在混合液中加入福林酚乙液50 μL,渦旋均勻后30 ℃水浴靜置30 min,取上述溶液200 μL,測定500 nm處的吸光度。以牛血清蛋白濃度為橫坐標,500 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線(R2>0.99)。

1.3.6 相對分子質(zhì)量分布測定 參照趙鈺等[11]的方法,用配備紫外檢測器的安捷倫高效液相色譜儀測定各組樣品的相對分子質(zhì)量分布。色譜柱為TSK gel G3000SWxl(30 cm×7.8 mm),流動相為100 mmol/L PBS,Na2SO4·10H2O,pH 6.7,流速為0.7 mL/min。柱溫30 ℃,進樣體積10 μL。相對分子質(zhì)量分布的標準蛋白曲線用標準蛋白混合物得到,紫外檢測波長280 nm,其數(shù)據(jù)分析用凝膠滲透色譜軟件處理。

1.3.7 氨基酸組成測定 根據(jù)Sun等[12]的方法,通過L-8900型自動氨基酸分析儀測定樣品中游離氨基酸的組成和含量。將1 mL酶解液與1 mL 5-磺基水楊酸混合,然后以10 000 r/min離心20 min,獲得的上清液用0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。基于標準氨基酸的保留時間和峰面積進行定性和定量分析。

1.3.8 電子舌分析 參照Zhu等[13]的方法,利用Asrree Ⅱ液體和味覺分析儀進行電子舌分析,其與LS16自動采樣單元、參比電極和味覺傳感器連接后,將樣品溶解于鮮味溶液中,鮮味溶液由NaCl(5 mg/mL)和味精(10 mg/mL)組成,將不含龍頭魚蛋白肽的鮮味溶液作為空白對照,每個樣品測定3次。

1.3.9 統(tǒng)計分析 每項數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示,且至少進行3次重復(fù)試驗。使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計整理。使用IBM SPSS Statistics 26進行單因素ANOVA方差分析,通過鄧肯多重極差檢驗,確定每項數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上具有顯著性差異。使用Origin 2022b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑分析

不同超聲強度對龍頭魚蛋白肽粒徑大小的影響如圖1所示,當超聲功率從0 W增大至120 W時,龍頭魚蛋白肽的粒徑顯著下降;當超聲功率從120 W增大至360 W時,龍頭魚蛋白肽的粒徑從176.7 nm降至145.3 nm(P<0.05)。這可能是因為超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的高剪切應(yīng)力破壞了蛋白質(zhì)分子間的相互作用[14];也可能是因為超聲沖擊波增加了蛋白質(zhì)顆粒之間的碰撞機會,使得蛋白質(zhì)聚集體因碰撞裂解成粒徑更小的蛋白質(zhì)碎片[15]。當超聲功率>360 W時,蛋白肽粒徑開始增大,可能是因為空化作用過強產(chǎn)生湍流力,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重新聚集形成大顆粒[16]。此外,Tang等[17]指出,超聲強度過高會引起非共價相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。

字母不同表示不同超聲功率之間差異顯著(P<0.05)

2.2 水解度分析

超聲處理改善水解度歸因于超聲波空化作用產(chǎn)生氣泡破裂、沖擊波和剪切力等,從而使得底物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,暴露出更多的酶切割位點[18]。不同超聲強度對酶解反應(yīng)水解度的影響如圖2所示,隨著超聲功率的增加,水解度呈先上升后下降的趨勢,并在360 W時達到19.29%。在超聲輔助酶解過程中,超聲空化效應(yīng)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性釋放親水基團,使酶更容易與底物蛋白結(jié)合,提高蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率[18]。此外,超聲空化效應(yīng)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)底物結(jié)構(gòu)損傷和變性,減小底物的粒徑,從而暴露出更多的蛋白質(zhì)用于酶切割位點[15]。Zhou等[19]有類似的研究結(jié)果:超聲預(yù)處理可以顯著提高玉米蛋白粉的水解度。然而,當超聲功率超過360 W時,水解度開始下降,可能是因為高強度超聲使得蛋白質(zhì)分子聚集(粒徑增大),減少了其與蛋白酶的接觸機會[20]。此外,秦倩倩[21]指出,酶在適當?shù)某晱姸认卤憩F(xiàn)出較高的催化活性,但功率過高時,超聲產(chǎn)生的瞬態(tài)空化作用釋放出高溫高壓氣流會破壞蛋白酶的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶催化活性顯著降低。研究[22]表明,蛋白酶解物水解度的差異可能對蛋白肽的風味產(chǎn)生影響。

字母不同表示不同超聲功率之間差異顯著(P<0.05)

2.3 可溶性肽含量分析

可溶性肽比由相同氨基酸組成的蛋白質(zhì)具有更高的消化率,并且比單個氨基酸具有更好的風味,其被認為是重要的風味化合物,對調(diào)味劑的開發(fā)起著至關(guān)重要的作用[22]。由圖3可知,水解后可溶性多肽含量隨超聲功率的增加先上升后下降,并在360 W超聲功率條件下水溶性肽含量達到了最高值(0.57 mg/mL)。這可能是超聲強度過低時,不能夠提供足夠的空化能量使蛋白質(zhì)與酶接觸,從而不利于可溶性肽的釋放;但超聲強度過大,游離出的蛋白質(zhì)顆粒肽更易重新形成聚集體,蛋白的酶切位點可能被包埋起來,降低了與酶的接觸機會,導(dǎo)致可溶性肽含量降低[23]。

字母不同表示不同超聲功率之間差異顯著(P<0.05)

2.4 相對分子質(zhì)量分布分析

由圖4可知,不同超聲強度制備龍頭魚蛋白肽的相對分子質(zhì)量分布存在一定的差異。隨著超聲功率的增加,龍頭魚蛋白肽的相對分子質(zhì)量向小相對分子質(zhì)量的范圍偏移,當超聲功率為360 W時,<3 000的組分占比從67%增加至81%,其中<1 000的組分占比增加了10%,1 000～3 000的組分占比增加了5%。這可能是由于超聲空化作用提高了酶解效率,水解度的增加使得相對分子質(zhì)量小的蛋白肽含量增加。這與Wang等[3]的研究結(jié)果有相似之處,表明了適當?shù)某暪β视兄趯⒌鞍踪|(zhì)降解成風味較好的小肽。表1為龍頭魚蛋白肽相對分子質(zhì)量統(tǒng)計結(jié)果,與圖4的結(jié)果一致,均表明適度的超聲能夠顯著降低龍頭魚蛋白肽的相對分子質(zhì)量。此外,當超聲功率為480 W時,由于蛋白質(zhì)聚集導(dǎo)致的水解度降低使得<3 000龍頭魚蛋白質(zhì)肽組分占比輕微降低[20]。

表1 超聲強度制備龍頭魚蛋白肽相對分子質(zhì)量統(tǒng)計結(jié)果?

圖4 超聲強度對龍頭魚蛋白肽相對分子質(zhì)量分布的影響

2.5 氨基酸組成分析

如表2所示,游離氨基酸總含量隨超聲強度的升高先增加后減少,并在360 W超聲強度下達到847.53 mg/g,該趨勢與圖2中水解度變化趨勢一致,是因為深度水解會釋放出更多的游離氨基酸。然而當超聲強度高于360 W后,游離氨基酸總含量開始下降,可能是因為高強度超聲產(chǎn)生的熱量造成了木瓜蛋白酶的變性,導(dǎo)致酶解效率降低;也可能是因為超聲功率過高時,體系中產(chǎn)生的熱量使超聲處理過程中釋放的游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)導(dǎo)致酶水解液中游離氨基酸含量降低[24]。此外,超聲波功率過高會引起局部高溫高壓和風味物質(zhì)的破壞,從而降低蛋白肽中風味物質(zhì)含量。同時,不同的氨基酸表達的風味不同,天冬氨酸和谷氨酸主要表達鮮味,蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸主要表達甜味,纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和組氨酸主要表達苦味[25]。由表2可知,在龍頭魚蛋白肽中,苦味氨基酸占主要地位,其次是甜味和鮮味氨基酸。隨著制備過程中超聲強度的增加,鮮味氨基酸含量的增幅最大,表明超聲輔助酶解在一定程度上可以改善龍頭魚蛋白肽的整體風味。

表2 不同超聲強度制備的龍頭魚蛋白肽游離氨基酸組成?

2.6 電子舌分析

不同超聲強度制備的龍頭魚蛋白肽電子舌分析結(jié)果如表3所示,其中酸味信號低于-20或其他味覺信號低于0被認為是不可感知的[26]。在各組超聲酶解制備的龍頭魚蛋白肽電子舌分析中,苦味占主導(dǎo),其次是鮮味和澀味,經(jīng)超聲輔助酶解處理后,苦味信號略微降低且苦味回味消失;同時澀味和鮮味信號略微增強,表明超聲輔助酶解有助于減少蛋白肽的苦味而增強其鮮味,可能與超聲輔助酶解可以獲得更多相對分子質(zhì)量小的肽有關(guān)。這與Zheng等[27]的研究結(jié)果一致,后者認為超聲波和微波聯(lián)合處理可以改善牛骨酶解液的風味。

表3 不同超聲強度制備的龍頭魚蛋白肽電子舌分析?

3 結(jié)論

通過研究超聲強度對龍頭魚蛋白肽結(jié)構(gòu)及風味特性的影響,發(fā)現(xiàn)在超聲強度為360 W時,龍頭魚蛋白水解度以及可溶性肽含量達到最高。超聲預(yù)處理顯著降低了龍頭魚蛋白肽的粒徑和相對分子質(zhì)量,<3 000的組分占比從67%增加至82%。此外,傳統(tǒng)水浴酶解制備的龍頭魚蛋白肽風味由苦味占主導(dǎo)并有輕微的苦味回味,超聲輔助酶解有助于通過增加鮮味氨基酸的含量而降低其苦味。綜上,適當?shù)某晱姸扔兄谔岣呙附庑?并將蛋白質(zhì)降解成生物活性更高的小分子蛋白肽,改善蛋白肽的風味,但超聲波輔助酶解改善龍頭魚蛋白肽風味的機理還有待進一步研究。