張林# 吳康# 褚鳳成 唐子牛 劉慧玲 林瀟* 楊磊，2*

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種慢性退行性疾病[1]。目前，研究認(rèn)為關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA）可在短期內(nèi)恢復(fù)關(guān)節(jié)滑液的流變學(xué)性能，減輕患者的疼痛癥狀[2]。然而炎癥使得HA快速降解，改變了滑液固有的流變學(xué)特性，增加了關(guān)節(jié)軟骨磨損的發(fā)生幾率[3]。研究發(fā)現(xiàn)，高分子量HA表現(xiàn)出比中/低分子量更有效的治療效果，可能是由于高分子量HA 具有更適宜的流變學(xué)性能和抗降解特性[4]。然而，HA制劑仍無法適配正常關(guān)節(jié)滑液的流變學(xué)性能，以及存在降解速率較快等臨床應(yīng)用的局限性。因此，亟需開發(fā)一類仿生正常關(guān)節(jié)滑液流變學(xué)性能、降解速率較慢且高生物相容性的可注射材料用于延緩骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變。

前期研究中發(fā)現(xiàn)控制淀粉和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）的分子結(jié)構(gòu)，以及在基體中添加特定的無機(jī)鹽可在大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)凝膠的流變學(xué)特征[5-7]。本研究采用淀粉、PVA和氯化鈉（NaCl）為主要成分制備水凝膠，制備出接近正常關(guān)節(jié)滑液流變學(xué)特征的可注射凝膠材料，進(jìn)而研究改善骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液的流變學(xué)特征對(duì)力學(xué)失穩(wěn)下關(guān)節(jié)退變的抑制作用，以期在未來單獨(dú)或與HA 聯(lián)合應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)軟骨病變的臨床治療。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

聚乙烯醇（PVA，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、蠟質(zhì)玉米淀粉（Waxy，河南建杰實(shí)業(yè)有限公司）、氯化鈉（NaCl，美國Sigma公司）、DMEM/F-12培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS，武漢普諾賽生命科技有限公司）、胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司）、一次性注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司）、流變儀（AR2000，美國TA.Instruments 公司）、紅外光譜儀（VERTEX80，德國布魯克公司）、X射線衍射儀（Empyrean，荷蘭帕納科公司）、Micro-CT（Skyscan，德國布魯克公司）、顯微鏡及成像系統(tǒng)（德國Carl Zeiss公司）、萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（HY1080，上海衡翼精密儀器有限公司）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國Biotek 公司）、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉（HA，日本生化學(xué)株式公社）、CCK-8（日本Dojindo 公司）、活/死細(xì)胞染色試劑盒（日本Dojindo 公司）、番紅快綠染色試劑（美國Sigma公司）。

1.2 水凝膠的制備

在95℃條件下，配置1 wt%的PVA 溶液。待溶液冷卻后加入10 wt%的蠟質(zhì)玉米淀粉（Waxy）和5 wt%的NaCl，攪拌至所有溶質(zhì)完全溶解后，繼續(xù)升溫至95 ℃攪拌30 min。將上述處理后所得透明預(yù)混合凝膠于-80 ℃冷凍10 h，室溫融化2 h，反復(fù)凍融循環(huán)3次，即可得到可注射、組織黏附性水凝膠PWN（PVA/Waxy/NaCl）。

為了研究制備過程中水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)和相組成的變化，同時(shí)制備純PVA 水凝膠及PVA/Waxy（PW）水凝膠。在95 ℃條件下，配置1 wt%的PVA溶液，將所得的PVA溶液按上述步驟凍融循環(huán)3次，得到PVA水凝膠。在95 ℃條件下，將1 wt%的PVA 溶液加入10 wt%的蠟質(zhì)玉米淀粉攪拌至所有溶質(zhì)完全溶解后，繼續(xù)升溫至95 ℃攪拌30 min，得到的透明凝膠按上述操作反復(fù)凍融循環(huán)3 次，得到PW水凝膠。

1.3 PWN的成分表征與材料學(xué)性能測(cè)試

1.3.1 PWN的成分表征和相組成分析

采用紅外光譜儀測(cè)定制備過程中三種水凝膠樣品的傅里葉變換衰減全反射紅外光譜，以分析制得的水凝膠樣品中的主要官能團(tuán)，掃描范圍為500～ 4 000 cm-1，掃描精度為4 cm-1。使用X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）測(cè)定三種水凝膠樣品的晶體衍射譜圖以分析制得的水凝膠樣品的相組成，掃描范圍為10°～ 50°，掃描速度為5°/min。

1.3.2 PWN的流變學(xué)性能測(cè)試

本測(cè)試采用直徑為20 mm、角度為1°的錐板，將水凝膠樣品的直徑和厚度調(diào)整為20 mm和37 μm。流變學(xué)性能測(cè)試選用振蕩模式。在37 ℃、1%應(yīng)變下進(jìn)行頻率掃描測(cè)試，頻率范圍：0.1～ 10 Hz。剪切稀釋性能在37 ℃、0.01～ 1 000（1/s）的剪切速率下測(cè)試。自愈合性能測(cè)試在37 ℃、1 Hz頻率下，1%和500%交替應(yīng)變下進(jìn)行時(shí)間掃描。

1.3.3 PWN的注射性能測(cè)試

將復(fù)合淀粉水凝膠裝到胰島素針（32G）注射器中，固定在力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上，以10 mm/min 的恒定速度推注，直到以恒定的力值將水凝膠推出時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，記錄PWN水凝膠在推注過程中的推注力隨時(shí)間變化曲線。

1.3.4 PWN降解性能體外測(cè)試

采用模擬關(guān)節(jié)滑液[8]（含有3 g/L HA 的PBS 溶液）浸泡的方法測(cè)試PWN水凝膠的體外生物降解性能。分別在第7、14、21、28 d 時(shí)間點(diǎn)，測(cè)試浸泡不同時(shí)間后PWN 水凝膠樣品重量的變化，并計(jì)算其相對(duì)于原始水凝膠樣品重量損失的百分比，將其定義為水凝膠的降解率。

其中，A0是復(fù)合淀粉水凝膠初始重量，Ai是浸泡不同時(shí)間時(shí)所測(cè)得的復(fù)合淀粉水凝膠重量。

1.3.5 PWN組織黏附性能測(cè)試

通過將兩片新鮮豬皮固定于力學(xué)測(cè)試儀的上下夾具中，取0.1 mL 樣品置于下夾具豬皮表面。通過移動(dòng)上夾具，直至上下豬皮與樣品接觸并產(chǎn)生0.1 N的壓力。待壓力松弛至0 N 后，以10 mm/min 的速度分離上下豬皮，記錄數(shù)據(jù)，將分離過程中的最大應(yīng)力定義為界面強(qiáng)度。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.4 PWN的體外細(xì)胞相容性及抗細(xì)菌黏附性能測(cè)試

1.4.1 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

使用Ⅱ型膠原酶對(duì)大鼠軟骨序貫消化獲得大鼠軟骨細(xì)胞[9]。

CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)：取P2 代的大鼠軟骨細(xì)胞接種于96孔板中。培養(yǎng)第1、3 d時(shí)，加入100 μL的CCK-8工作液避光孵育。2 h 后于全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm 處的吸光度值。每組重復(fù)3次，每次5個(gè)復(fù)孔。然后根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率（relative growth rate,RGR）：

其中，P是實(shí)驗(yàn)組吸光度，P0是對(duì)照組吸光度。

活/死細(xì)胞染色：將軟骨細(xì)胞按2×105個(gè)/孔種植在24孔板內(nèi)培養(yǎng)1和3 d。到計(jì)劃時(shí)間點(diǎn)后，加入活/死細(xì)胞染色試劑，避光室溫孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4.2 PWN的抗細(xì)菌黏附性能測(cè)試

在37 ℃恒溫?fù)u床中，將金黃色葡萄球菌（S.aureus）在30 mL LB培養(yǎng)基中孵育過夜。使用LB培養(yǎng)基將過夜孵育的金葡菌菌液稀釋1 000倍，預(yù)先將PWN、HA紫外線處理消毒，并將消毒后0.5 mL的PWN、HA加入無菌24孔板中。取1 mL稀釋后的金葡菌菌液滴加到PWN與HA表面，37 ℃孵育4 h后，使用1 mL細(xì)菌染色試劑避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.5 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.5.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變模型的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過蘇州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SUDA2021121 5A01），所需動(dòng)物從蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買。取12只300 g 的SD 雄性大鼠，2%戊巴比妥鈉溶液（1 mL/kg）麻醉，右下肢局部備皮消毒后，膝外側(cè)髕骨旁切口入路，切除右膝內(nèi)側(cè)部分半月板和前交叉韌帶，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)失穩(wěn)從而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨退變的發(fā)生，以正常左膝關(guān)節(jié)作為對(duì)照處理，視為假手術(shù)組（Sham 組）。逐層縫合膝關(guān)節(jié)，術(shù)后允許動(dòng)物自由活動(dòng)。術(shù)后1 周，將大鼠分為3 組，未治療組（Non-treated 組，n=4），透明質(zhì)酸治療組（HA 組，n=4）和PWN 水凝膠治療組（PWN 組，n=4）。處理后4 周，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠分別進(jìn)行安樂死，并對(duì)大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)取材，加入體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定24 h。

1.5.2 Micro-CT掃描

所有關(guān)節(jié)標(biāo)本采用Skyscan Micro-CT 設(shè)備進(jìn)行掃描分析，具體步驟如下：將固定后的膝關(guān)節(jié)樣本置于Micro-CT的標(biāo)本管中，掃描厚度7 μm，三維重建后分析內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨的骨礦化密度值（bone mineral density,BMD）和骨體積/組織體積比（bone volume/tissue volume,BV/TV）。最后，選取共50層內(nèi)側(cè)脛骨軟骨下骨的矢狀面圖像，進(jìn)行觀察分析。

1.5.3 組織包埋切片及番紅快綠染色

將固定后的組織在10%的EDTA 溶液中浸泡脫鈣。梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋并切成6 μm厚度的薄片。石蠟切片后進(jìn)行番紅快綠染色并用關(guān)節(jié)顯微鏡進(jìn)行觀察記錄，最后參考骨性關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)（OARSI）組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)與相組成

水凝膠的紅外光譜結(jié)果如圖1A 所示，單純的PVA 水凝膠中的O—H 與C—O 分別在3 357.5 cm-1和1 091.5 cm-1處發(fā)生伸縮振動(dòng)；相比之下，由于PVA與淀粉之間可能存在氫鍵的作用，PW 分子結(jié)構(gòu)中O—H 與C—O 的特征吸收峰分別輕微地紅移至3 349.7 cm-1和997.0 cm-1，而PWN 中O—H 與C—O 的特征吸收峰也分別紅移至3 338.1 cm-1和997.0 cm-1。水凝膠的XRD 譜圖結(jié)果如圖1B 所示，PW 水凝膠主要的晶體衍射峰處于16°～ 25°之間，與PVA 水凝膠一致，說明PW水凝膠與PVA水凝膠具有相同的相組成；由于NaCl的加入，PWN水凝膠在16°～ 25°范圍內(nèi)的晶體衍射峰強(qiáng)度較低，而在31°～ 33°與44°～ 47°的范圍內(nèi)表現(xiàn)出了較強(qiáng)的晶體衍射，均屬于NaCl的晶體衍射峰。

圖1 水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)與相組成：A.PVA、PW與PWN水凝膠的紅外光譜圖；B.PVA、PW與PWN水凝膠的XRD譜圖

2.2 水凝膠的流變學(xué)特征

PWN水凝膠與HA的流變學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示（見圖2A），當(dāng)震蕩頻率為0.5 Hz，PWN的G'為12.82 Pa，G''為7.51 Pa；而HA 的G'為4.68 Pa，G''為9.81 Pa。當(dāng)震蕩頻率提高至2.5 Hz，PWN 的G'為21.76 Pa，G''為13.60 Pa；而HA 的G'為34.59 Pa，G''為23.36 Pa。

圖2 PWN的流變學(xué)性能：A.PWN和HA在37 ℃、1%應(yīng)變下的G?和G??值隨頻率的變化曲線；B.PWN在37 ℃時(shí)G?和G??值隨應(yīng)變的變化曲線；C.PWN在1%和500%交替應(yīng)變作用下的時(shí)間掃描；D.PWN和HA在剪切速率為0.01～ 1 000 s-1時(shí)的黏度變化曲線

應(yīng)變掃描結(jié)果如圖2B所示，在0.01%～ 300%的應(yīng)變范圍內(nèi)，PWN 的G?大于G??；而在300%至1 000%的應(yīng)變范圍內(nèi)，G??大于G?。PWN 在1%和500%交替應(yīng)變作用下的時(shí)間掃描結(jié)果顯示（見圖2C），當(dāng)PWN 處于1%的應(yīng)變時(shí)，其G?大于G?；當(dāng)應(yīng)變?cè)黾拥?00%時(shí)，G?急劇下降，且低于G??；當(dāng)應(yīng)變?cè)俅位謴?fù)至1%時(shí)，G?再次大于G?，G?與G?恢復(fù)至接近初始值。

PWN 和HA 在不同剪切速率下的黏度測(cè)試結(jié)果顯示（見圖2D），PWN 和HA 的零剪切速率黏度（剪切速率為0.01 s-1時(shí)的黏度）分別為360.99 Pa?s 和6.05 Pa?s。同時(shí)，隨著剪切速率從0.01 增加至1 000 s-1，PWN 與HA 的黏度均逐漸降低，且分別降低至0.51 Pa?s和0.26 Pa?s。

2.3 水凝膠的可注射性能、組織黏附性能及降解性能

推注力測(cè)試結(jié)果顯示（見圖3A），PWN在通過32G針頭時(shí)的推注力約為9 N。PWN與HA的拉脫界面強(qiáng)度和界面韌性如圖3B所示，PWN沿著分離方向呈現(xiàn)拉絲狀變形；相反，HA在分離過程中幾乎無形變，能量消耗較少。同時(shí)，PWN 的拉脫界面強(qiáng)度為（672.96±229.28）Pa，顯著高于HA 的拉脫界面強(qiáng)度（226.20±51.74）Pa（P＜0.05），且PWN的界面韌性也顯著高于HA，為HA的（3.80±0.94）倍（P＜0.01，見圖3C、3D）。此外，材料在豬關(guān)節(jié)內(nèi)摩擦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PWN 黏附于豬軟骨表面進(jìn)行1 000 次循環(huán)運(yùn)動(dòng)后，仍然可見明顯駐留，而HA幾乎無駐留（見圖3E）。定量分析結(jié)果顯示，PWN在豬軟骨內(nèi)駐留量約為0.038 g/cm2，顯著高于HA的駐留量0.015 g/cm2（P＜0.01，見圖3F）。

圖3 PWN的注射性能、組織黏附性能和降解行為：A.PWN的推注力—位移曲線；B.HA和PWN與豬皮分離過程；C、D.HA、PWN與豬皮分離過程中的界面強(qiáng)度和界面韌性；E.循環(huán)運(yùn)動(dòng)后，豬膝關(guān)節(jié)表面HA與PWN的駐留量圖片；F.單位面積豬膝關(guān)節(jié)表面HA與PWN的定量分析；G.PWN在模擬關(guān)節(jié)滑液中浸泡28 d后質(zhì)量損失率隨時(shí)間的變化

PWN的體外降解測(cè)試結(jié)果顯示（見圖3G），水凝膠的降解速度呈現(xiàn)近似勻速的降解行為，在第28 d時(shí)PWN的質(zhì)量損失率為76.5 wt%。

2.4 PWN的細(xì)胞相容性及抗細(xì)菌黏附性能

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PWN 和HA 的浸提液均能支持軟骨細(xì)胞的存活，且兩組均表現(xiàn)出與對(duì)照組相當(dāng)?shù)南鄬?duì)增殖率（見圖4A）?；?死細(xì)胞染色結(jié)果顯示，在培養(yǎng)1 d與3 d 時(shí)，PWN 和HA 組均未見明顯死細(xì)胞（見圖4B）。細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，材料與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)4 h 后，PWN 表面黏附的細(xì)菌明顯少于HA 和PW（見圖4C）。

圖4 PWN的細(xì)胞相容性和抑菌性能：A.軟骨細(xì)胞在HA與PWN浸提液中培養(yǎng)1 d和3 d的相對(duì)增殖率；B.軟骨細(xì)胞在HA與PWN浸提液中培養(yǎng)1 d和3 d的活/死細(xì)胞染色照片；C.HA、PW與PWN表面黏附金黃色葡萄球菌的熒光染色照片

2.5 大鼠膝關(guān)節(jié)力學(xué)失穩(wěn)模型中關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PWN對(duì)軟骨及軟骨下骨退變的影響

在PWN 和HA 進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療4 周后，Micro-CT三維重建結(jié)果顯示（見圖5A），PWN組軟骨下骨空腔的大小和骨贅均顯著小于OA 組和HA 組。大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨Micro-CT統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示（見圖5B），未治療組大鼠膝關(guān)節(jié)的軟骨下骨的BMD和BV/TV均顯著低于正常組（P＜0.01）；同時(shí)，HA 組軟骨下骨的BMD和BV/TV相比于OA組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相比之下，PWN組軟骨下骨的BMD和BV/TV均顯著高于未治療組和HA組（P＜0.05）。

圖5 大鼠軟骨下骨的影像學(xué)分析結(jié)果。A.4周時(shí)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的Micro-CT三維重建圖像（紅色箭頭指示為骨贅）；B.4周時(shí)大鼠膝關(guān)節(jié)的BMD和BV/TV結(jié)果

番紅快綠染色結(jié)果顯示（見圖6A），正常組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨表面光滑完整，軟骨表面蛋白聚糖分布范圍較廣；相比之下，未治療組軟骨表面連續(xù)性較差，軟骨表面破損、侵蝕嚴(yán)重，軟骨細(xì)胞數(shù)量較少，蛋白聚糖分布范圍較窄；HA 組軟骨蛋白聚糖分布與正常組相當(dāng)，但軟骨表面凹凸不平、連續(xù)性差；相比之下，PWN組軟骨表面連續(xù)性較好，未見明顯破損、侵蝕，蛋白聚糖分布豐度接近正常組。此外，骨性關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)（OARSI）評(píng)分結(jié)果顯示（見圖6B），未治療組評(píng)分最高，顯著高于正常組（P＜0.01）；HA組評(píng)分盡管顯著低于未治療組，但仍顯著高于正常組（P＜0.01）；而PWN組評(píng)分顯著低于未治療組和HA 組（P＜0.05），且接近正常組。

圖6 治療4周后大鼠膝關(guān)節(jié)的組織學(xué)形貌與OARSI評(píng)分：A.大鼠OA模型治療4周后組織的番紅O-快綠染色；B.大鼠OA模型治療4周后組織修復(fù)的OARSI組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

3 討論

3.1 骨關(guān)節(jié)炎時(shí)關(guān)節(jié)滑液力學(xué)性能變化及其對(duì)力學(xué)環(huán)境影響、潛在修復(fù)策略

由于骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)內(nèi)HA酶對(duì)HA的降解作用，使得關(guān)節(jié)滑液的流變學(xué)性能改變，可能是HA 臨床治療效果不明確的一個(gè)重要原因[11]。Calvet 等[12]通過對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者注射具有不同流變學(xué)特征的HA，研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)注射高分子量（高剪切模量）HA 能更有效地減輕骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛，表明關(guān)節(jié)內(nèi)注射水凝膠的流變學(xué)特征可影響其抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的效果。為了解決HA 快速降解的問題，Cai 等[13]合成了一種流變學(xué)特征和降解速率可控的可注射HA-聚乙二醇水凝膠，相較于HA 注射治療，其表現(xiàn)出抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的能力。因此，開發(fā)一類仿生正常關(guān)節(jié)滑液流變學(xué)特征、降解速率較慢且具有高生物相容性的可注射材料有望用于關(guān)節(jié)腔注射治療，延緩骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變。

3.2 淀粉和離子對(duì)PVA水凝膠流變學(xué)特征的調(diào)控作用

PVA 水凝膠具有良好的生物相容性及生物可降解性，Wu 等[14]通過在PVA 水凝膠中引入各種離子，實(shí)現(xiàn)了其廣泛的力學(xué)動(dòng)態(tài)調(diào)控特性。此外，淀粉作為一種高分子多糖，可作為增稠劑影響水凝膠的流變學(xué)特征[15]。因此，將離子與淀粉引入PVA水凝膠中有望調(diào)控其流變學(xué)特征。此外，HA 分子的減少，導(dǎo)致關(guān)節(jié)高負(fù)荷區(qū)域磨損增加，促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨的退變[11]。已有研究顯示PVA溶液可吸附在物體表面上形成潤(rùn)滑層[16]。Chen等[17]通過對(duì)PVA改性得到了在水合潤(rùn)滑條件下低磨損的潤(rùn)滑水凝膠。Li 等[18]利用NaCl 提升了PVA 溶液的黏度，通過減少表面間的直接接觸，進(jìn)一步減少摩擦。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射仿生正常關(guān)節(jié)滑液流變學(xué)特征的水凝膠材料，有望減少關(guān)節(jié)磨損，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

3.3 離子對(duì)發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎時(shí)關(guān)節(jié)退變的抑制作用

生物活性離子在骨軟骨組織的多個(gè)生理過程中扮演著重要角色，對(duì)于維持組織代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。研究表明，鎂離子能抑制軟骨組織中MMP-13 和IL-6 的表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)注射氯化鎂溶液可顯著抑制大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)軟骨的退變進(jìn)展[19]。硅離子在骨軟骨的發(fā)育過程中也起著至關(guān)重要的作用，口服硅離子有望減緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，離子不僅可以調(diào)控水凝膠材料的流變學(xué)特征，同時(shí)還有望通過提升凝膠滲透壓增強(qiáng)水凝膠抑制細(xì)菌黏附的能力。此外，水凝膠作為一種離子控釋載體，有望在未來負(fù)載不同的生物活性離子應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)軟骨的退變。

3.4 PWN 水凝膠與透明質(zhì)酸的材料學(xué)性能比較及其臨床意義

針對(duì)HA 類制劑在骨關(guān)節(jié)炎臨床治療中的不足之處，本研究以PVA、淀粉及NaCl為原料，合成一種新型可注射組織黏附性水凝膠PWN。在骨關(guān)節(jié)炎的病程進(jìn)展過程中，關(guān)節(jié)滑液的黏彈性特征會(huì)發(fā)生變化，相比于正常成人的關(guān)節(jié)滑液，骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液的黏彈性特征顯著降低[21]。因此，本研究通過對(duì)比PWN水凝膠與HA的流變學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，相比于臨床使用的HA產(chǎn)品，PWN具有與正常關(guān)節(jié)滑液相仿的黏彈性特征[21]，有望恢復(fù)病理環(huán)境下關(guān)節(jié)內(nèi)滑液的流變學(xué)特征。

在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中，關(guān)節(jié)滑液黏度逐漸降低以及剪切稀釋行為的喪失，使得關(guān)節(jié)面的接觸面積增大，從而加劇了關(guān)節(jié)面的磨損[22]。不同剪切速率下的黏度測(cè)試結(jié)果顯示，水凝膠在低剪切速率下的高黏度能延長(zhǎng)可注射生物材料在關(guān)節(jié)中的停留時(shí)間，而高剪切速率下的低黏度有利于臨床注射和人體關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)[23]。此外，PWN具有快速自愈合的能力，其自修復(fù)能力主要?dú)w因于PVA與淀粉之間氫鍵的解離與重塑作用[7]。這表明其在低剪切應(yīng)力下可迅速恢復(fù)水凝膠的結(jié)構(gòu)，維持水凝膠的功能。

PWN具有良好的細(xì)胞相容性和組織黏附性，有望黏附于軟骨表面，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。此外，相比于HA，PWN 具有緩慢的降解速率，有望實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期治療，減少關(guān)節(jié)腔注射頻率，更有益于對(duì)依從性差的患者使用[24]。

HA 和PW 無抑制細(xì)菌黏附的作用，而PWN 具有抑制細(xì)菌黏附的作用，推測(cè)關(guān)節(jié)內(nèi)注射PWN可能會(huì)降低關(guān)節(jié)腔感染幾率。PWN抑制細(xì)菌黏附的能力可能與其表面高滲環(huán)境抑制細(xì)菌生物膜的形成[25]，以及與水凝膠表面形成的水合潤(rùn)滑層有關(guān)[26]。上述機(jī)制減少了細(xì)菌與PWN表面的直接接觸和細(xì)菌生物膜的形成，從而抑制細(xì)菌在PWN表面的黏附。

3.5 PWN水凝膠與透明質(zhì)酸對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)力學(xué)失穩(wěn)模型的療效比較與可能機(jī)制

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)力學(xué)失穩(wěn)治療4 周后PWN 水凝膠能更有效地抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)退變。PWN 水凝膠未添加具有高生物活性的化學(xué)組分，因此PWN水凝膠對(duì)大鼠早期骨關(guān)節(jié)炎的治療效果可能與PWN的物理特性有關(guān)。首先，PWN 具有與天然關(guān)節(jié)滑液相匹配的黏彈性特征，有望恢復(fù)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液的流變學(xué)特性，減少關(guān)節(jié)面的磨損和組織內(nèi)軟骨細(xì)胞的應(yīng)變，進(jìn)而抑制關(guān)節(jié)軟骨的退變。其次，PWN水凝膠的降解速率較慢且具有一定的組織黏附性，可以為骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)表面提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的保護(hù)作用。相較于HA，在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PWN水凝膠后，能黏附于軟骨表面，更持久地改善關(guān)節(jié)腔的生物力學(xué)環(huán)境，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變及軟骨下骨的重構(gòu)。因此，本研究開發(fā)的凝膠材料在未來有望作為關(guān)節(jié)腔內(nèi)可注射制劑用于保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。

綜上，本研究開發(fā)了一種流變學(xué)特征、組織黏附性、降解性能、抑制細(xì)菌黏附性能均優(yōu)于臨床使用的HA 產(chǎn)品且可抑制早期骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)骨軟骨退變的可注射水凝膠，其同時(shí)具有原材料來源廣泛、成本低、制備簡(jiǎn)單的臨床轉(zhuǎn)化優(yōu)勢(shì)，未來有望單獨(dú)或與HA 聯(lián)合應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療。