董曉柳,董 偉,陳玉娟,張 于,張 利,張 歡

(唐山市人民醫(yī)院:1.神經(jīng)康復(fù)科;2.神經(jīng)外科;3.神經(jīng)內(nèi)科;4.重癥醫(yī)學(xué)科,河北唐山 063000)

垂體腺瘤是起源于垂體前葉的腫瘤,約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的第二位,按照臨床癥狀和血清激素水平,可以分為功能性腺瘤和無功能腺瘤。第5版世界衛(wèi)生組織內(nèi)分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分類指南提供了基于腫瘤細(xì)胞譜系、垂體激素類型和相關(guān)特征的詳細(xì)組織學(xué)分類[1]。雖然該指南有利于患者的個(gè)性化診療,但是這種高度復(fù)雜的分類方式也給臨床工作帶來巨大的壓力和困惑。碳水化合物硫轉(zhuǎn)移酶(carbohydrate sulfotransferase,CHST)家族與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[2-3],參與細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過程[4-5]。文獻(xiàn)報(bào)道CHST家族參與胰腺癌進(jìn)展,CHST7啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與垂體腺瘤的增殖和分化有關(guān)[6-7]。本研究擬在90例臨床無功能腺瘤患者中檢測(cè)CHST家族成員的基因表達(dá)水平,明確其表達(dá)水平與臨床特征、腫瘤譜系分化的關(guān)系,以期為臨床無功能腺瘤未來的分類及治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本來源于2019年1月至2022年10月唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的90例臨床無功能腺瘤患者,用于檢測(cè)患者腫瘤組織的CHST1、CHST2、CHST7和CHST8基因水平及開展臨床特征相關(guān)性分析。其中男59例(65.6%),女31例(34.4%);年齡21～75歲,平均(51.34±1.16)歲;腫瘤體積1.09～35.88 cm3,平均(8.12±0.79)cm3。本研究將Knosp分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)定義為侵襲,Knosp分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)及Ki-67指數(shù)<3%定義為非侵襲,其中侵襲組35例,非侵襲組55例;將Ki-67指數(shù)≥3%定義為高增殖,<3%定義為低增殖,其中高增殖組23例,低增殖組67例。本研究獲得唐山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):RMYY-LLKS-2022-021),患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑與材料

RNA抽提試劑盒購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自美國Thermo公司;引物由北京合生基因科技有限公司合成;DAB購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)腫瘤標(biāo)本中CHST1、CHST2、CHST7、CHST8和TBX19、POU1F1、SF-1的基因水平

每個(gè)標(biāo)本取10 mg左右的組織,利用一步法提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件為50 ℃ 20 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。引物序列如下:CHST1正向引物為5′-CCT CTT TGA CCT CAC CCC TT-3′,反向引物為5′-CAG GTG TGA AAG GAC TTG GC-3′;CHST2 正向引物為5′-AGA CCT GAT TCC CTG TGG TG-3′,反向引物為5′-GCA AAG AAG AAG AGG GGC AC-3′;CHST7 正向引物為5′-GAT TTC TTC CTG ACC GGT GC-3′,反向引物為5′-GAG TCA TGT TGA GCG CGA AG-3′;CHST8 正向引物為5′-CAG CAC CTA CAC CAA GAT GC-3′,反向引物為5′-TCC CAG TGA ATG TCC ATC CC-3′;TBX19正向引物為5′-GTA TCT TCT CTC CGC TCC CC-3′,反向引物為5′-CTG AAG CTC ACT CTC CAC CA-3′;POU1F1 正向引物為5′-TCC TGA CCA CAC CTT GAG TC-3′,反向引物為5′-GCC TCC CCA ACA TTT GTC TG-3′;SF-1 正向引物為5′-TCT GAG TAC CCG GAG CCT TA-3′,反向引物為5′-TGG AGA TGA AGG TCT GGT CG-3′;內(nèi)參基因GAPDH正向引物為5′-CCA AGG AGT AAG ACC CCT GG-3′,反向引物為5′-TGG TTG AGC ACA GGG TAC TT-3′。以2-ΔΔCt表示標(biāo)本中受檢基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤標(biāo)本中POU1F1編碼蛋白PIT1、SF-1和TBX19編碼蛋白TPIT的染色水平

腫瘤組織以10%中性甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋,5 μm厚度連續(xù)切片?？鞠?0 ℃烤片1 h,梯度脫蠟,抗原修復(fù)后以羊血清封閉30 min,滴加PIT1、SF-1和TPIT一抗,4 ℃孵育過夜,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS)沖洗3次,二抗室溫孵育1 h,PBS沖洗3次,DAB顯色后自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,顯微鏡下拍照觀察封片。(1)陰性:陽性細(xì)胞數(shù)≤1%;(2)弱陽性:陽性細(xì)胞數(shù)>1%～5%;(3)陽性:陽性細(xì)胞數(shù)>5%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 垂體腺瘤的CHST家族的表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示,CHST1基因表達(dá)水平是(8.700±1.300)×10-3,CHST2基因表達(dá)水平是(0.060±0.010)×10-3,CHST7基因表達(dá)水平是(0.026±0.004)×10-3,CHST8基因表達(dá)水平是(0.320±0.028)×10-3。體積大的腫瘤CHST1基因和CHST7基因表達(dá)水平高于體積小的腫瘤(P=0.014,P=0.044),女性患者CHST2基因表達(dá)水平高于男性患者,侵襲性腫瘤的CHST8基因表達(dá)水平低于非侵襲腫瘤(P=0.044),見表1。

表1 90例臨床無功能腺瘤中的CHST家族基因表達(dá)水平

相關(guān)性分析顯示,CHST1基因表達(dá)水平與腫瘤體積的相關(guān)系數(shù)(r)是0.321(P=0.002),CHST7基因表達(dá)水平與腫瘤體積的相關(guān)系數(shù)是0.426(P<0.001);CHST家族基因水平與患者年齡無關(guān),見表2。

表2 CHST家族基因表達(dá)水平與腫瘤體積的相關(guān)性分析

2.2 CHST家族表達(dá)水平與垂體腺瘤譜系分化有關(guān)

按照轉(zhuǎn)錄因子染色強(qiáng)弱分為3組;與SF-1陰性相比,SF-1陽性或弱陽性患者具有較高的CHST1和CHST8基因表達(dá)水平,具有較低的CHST7基因表達(dá)水平(P<0.05);與PIT1陰性相比,PIT1陽性或弱陽性患者具有較高的CHST1基因表達(dá)水平,具有較低的CHST2基因表達(dá)水平(P<0.01),見表3。

表3 不同PIT1和SF-1染色強(qiáng)度的CHST家族基因表達(dá)水平

相關(guān)性分析顯示,CHST1水平與POU1F1水平呈正相關(guān)(r=0.686,P<0.001),與NR5A1水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.227,P=0.032);CHST7水平與POU1F1水平呈正相關(guān)(r=0.774,P<0.001);CHST8與FSHb、NR5A1水平呈正相關(guān)(r=0.485,P<0.001;r=0.725,P<0.001)。CHST家族的基因表達(dá)水平均與轉(zhuǎn)錄因子TBX19的水平無關(guān)(P>0.05),見表4。

表4 CHST家族基因表達(dá)水平與譜系分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性分析

2.3 CHST家族在預(yù)測(cè)無功能腺瘤譜系分化中的診斷價(jià)值

在受試者工作特征(ROC)曲線分析中,預(yù)測(cè)未成熟POU1F1譜系,POU1F1、CHST1和NR5A1的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.945(P<0.001)、0.750(P=0.023)和0.270(P=0.036);預(yù)測(cè)SF-1譜系,NR5A1、FSHb和CHST8的AUC分別為0.861(P=0.001)、0.823(P=0.002)和0.776(P=0.008)。CHST1和CHST8聯(lián)合預(yù)測(cè)SF-1譜系的AUC為0.823(P=0.002),見圖1和表5。

表5 CHST家族在預(yù)測(cè)無功能腺瘤譜系分化中的診斷價(jià)值

A:POU1F1譜系;B:SF-1譜系。

3 討 論

垂體腺瘤是一種慢性、復(fù)雜的全身性疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[8],主要影響下丘腦-垂體-靶器官軸[9],居顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的第二位,占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的17%[10],約35%的垂體腺瘤呈侵襲性生長[11]。多數(shù)垂體腺瘤具有較強(qiáng)的分泌功能,能使血液中激素水平升高,并產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。但也有一些垂體腺瘤并不升高血液中的激素水平,也無激素過多癥狀,稱為臨床無功能垂體腺瘤,該類腺癌易導(dǎo)致診斷和治療延誤。2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布了新的垂體腫瘤分型指南[12],其中垂體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況被作為新的分型指標(biāo),為垂體腺瘤的診治提供新依據(jù)、新方法[13]。

按照第5版世界衛(wèi)生組織分類指南,正常腺垂體共由3個(gè)譜系共計(jì)6種腺細(xì)胞組成?；谵D(zhuǎn)錄因子PIT1、TPIT和SF1譜系定義的PitNETs分類和亞型具有明顯的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和臨床表型差異[14]。按照新版分類,臨床無功能腺瘤包括未成熟PIT1譜系腫瘤、未成熟TPIT譜系腫瘤和SF-1譜系腫瘤,并且未成熟PIT1和TPIT譜系具有較高的侵襲性、無病生存時(shí)間短和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)CHST家族與垂體腺瘤的增殖和侵襲有關(guān),相關(guān)性分析明確CHST1、CHST7、CHST8與臨床無功能腺瘤未成熟PIT1和SF-1譜系分化方向有關(guān),初步確定CHST1和CHST8聯(lián)合具有預(yù)測(cè)譜系分化的診斷價(jià)值。

臨床無功能腺瘤占垂體腺瘤患者的15%～37%,發(fā)病率為(13.4～25.2)/10萬人[15],通常表現(xiàn)為腫瘤壓迫引起的繼發(fā)癥狀,包括頭痛、視力下降、視野缺損及垂體功能低下引起的一系列癥狀[16-17]。手術(shù)是無功能腺瘤首選的治療方法,手術(shù)全切率為60%～73%[18]。大多數(shù)垂體腺瘤為良性,通過手術(shù)、藥物治療及放療可治愈,但仍有約10%的垂體腺瘤表現(xiàn)有極高的侵襲性,且傳統(tǒng)治療方式無效,因此針對(duì)垂體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的干預(yù)或許能成為一種新的治療方式[19]。

硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)通過驅(qū)動(dòng)癌基因表達(dá),在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20-21]。CSPGs可能通過細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重構(gòu)中參與了下丘腦-神經(jīng)垂體系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)可塑性[22]。CHST家族負(fù)責(zé)將糖蛋白中的硫酸鹽轉(zhuǎn)移到碳水化合物上,并通過控制CSPGs的生物合成參與致癌性[23-25]。既往研究表明,CHST7高甲基化與垂體腺瘤SF-1譜系分化有關(guān),CHST7低甲基化與垂體腺瘤PIT1譜系和TPIT譜系分化有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,CHST1和CHST7促進(jìn)腫瘤增殖,CHST8與腫瘤侵襲有關(guān)。這一結(jié)果與未成熟PIT1譜系腫瘤具有較高侵襲性這一結(jié)論一致。

新版指南建議病理科對(duì)所有的垂體腫瘤患者至少進(jìn)行3類12個(gè)指標(biāo)的檢測(cè):(1)3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子染色;(2)7種垂體激素染色;(3)雌激素受體α和GATA結(jié)合蛋白3。根據(jù)病理結(jié)果,新版指南將垂體腫瘤分為12種亞型,這種高度復(fù)雜的分類方式也給臨床工作帶來巨大的壓力。本研究發(fā)現(xiàn)CHST1具有預(yù)測(cè)未成熟PIT1譜系的診斷價(jià)值,CHST8具有預(yù)測(cè)SF-1的診斷價(jià)值。CHST1和CHST8聯(lián)合診斷價(jià)值與指南推薦的促卵泡激素β亞基相似。

綜上所述,CHST家族與臨床無功能腺瘤的譜系分化有關(guān),單獨(dú)檢測(cè)CHST1、CHST1和CHST8聯(lián)合檢測(cè)是診斷未成熟PIT1和SF-1譜系分化的有效方法。遺憾的是,本研究入組的病例未包含未成熟TPIT譜系,僅數(shù)例散在的TPIT陽性病例,未能完全證實(shí)CHST家族與TPIT譜系腫瘤分化無關(guān)。