沙 聰 張一心 袁愛(ài)軍 吳仁極

南通瑞慈醫(yī)院普外科,江蘇省南通市 226009

microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的小RNA分子,且不能為蛋白編碼。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用已被眾多研究所證實(shí)[1-2]。通過(guò)mRNA堿基對(duì)特定基因3’-未翻譯區(qū)(3’-UTR)中的特定靶位點(diǎn)的識(shí)別,miRNAs在生理或病理?xiàng)l件下能有效地降低靶基因的mRNA水平,從而抑制該基因的翻譯。由于mRNA靶基因非常廣泛,通過(guò)影響這些靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化、血管生成等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程[3]。因而,miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用,根據(jù)不同的癌癥類型或腫瘤細(xì)胞,同一個(gè)miRNA可能具有相反的生物學(xué)功能,或作為癌基因或作為腫瘤抑制因子發(fā)揮生物學(xué)功能。

miR-139-5p是從miR-139前體加工而來(lái)的成熟miRNA形式。雖然miR-139-5p在人宮頸癌中的腫瘤抑制作用已被證實(shí)[4],而其在胃癌中的研究較少,其生物學(xué)功能及分子機(jī)制并不十分清楚。在本研究中,筆者采用Real-time PCR、免疫組化等多種生物實(shí)驗(yàn)方法及生物信息分析技術(shù),探討miR-139-5p在胃癌中的生物學(xué)功能及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 胃癌患者及組織標(biāo)本留取 選取我院2018年8月—2022年7月收治的38例老年(年齡>65歲)胃癌患者為研究對(duì)象,術(shù)中留取患者腫瘤組織、癌旁正常胃組織和區(qū)域淋巴結(jié)?；颊呓M織手術(shù)切除后,立即置于液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。術(shù)后根據(jù)患者病理報(bào)告將淋巴結(jié)區(qū)分為轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。38例患者中男27例,女11例,中位年齡72歲(65～78歲)。

1.2 miR-139-5p靶基因預(yù)測(cè) 采用生物信息學(xué)分析方法,通過(guò)microRNA與mRNA相互作用預(yù)測(cè)軟件Targetscan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)檢索miR-139-5p的靶基因。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)miR-139-5p和TCF4表達(dá) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明,使用TRIzol試劑(Life Technology,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)從細(xì)胞中提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase H-)(TaKaRa,Tokyo,Japan)將總RNA反向轉(zhuǎn)錄成microRNA-cDNAs,使用特定的引物(中國(guó)廣州,Ribonobio)及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)合成了該基因的cDNA。隨后使用SYBREx-Taq(Takara Bio,Inc.,日本)qRT-PCR反應(yīng)。miR-139-5p、TCF4相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 免疫組化檢測(cè)TCF4蛋白表達(dá) 采用免疫組化二步法對(duì)TCF4進(jìn)行測(cè)定:首先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行切片脫蠟等處理,然后進(jìn)行抗原修復(fù),消除過(guò)氧化物酶活性加入一抗,37℃孵育1h;然后用PBS沖洗。將試劑(Polymer helper)滴入其中,于37℃條件下孵育20min;滴入二抗,于37℃條件下孵育0.5h; PBS沖洗厚DAB顯色5min。顯色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察,判斷TCF4的表達(dá)情況。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TCF4陽(yáng)性者光鏡下胃癌細(xì)胞核及細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色。

2 結(jié)果

2.1 miR-139-5p在胃癌中的表達(dá) 正常胃組織和胃癌組織中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量分別為-3.06±1.43和-4.09±2.13,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.46,P=0.016)。未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量分別為0.25±1.64和-1.59±1.67,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.51,P=0.001)。癌旁正常胃組織和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量顯著高于胃癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌患者癌組織、癌旁組織、未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量散點(diǎn)圖

2.2 miR-139-5p靶基因預(yù)測(cè) 采用生物信息學(xué)分析方法,通過(guò)microRNA與mRNA相互作用預(yù)測(cè)軟件Targetscan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)檢索miR-139-5p的靶基因,結(jié)果顯示TCF4基因3’-UTR區(qū)域ACUGUAC序列與miR-139-5p 5’-UTR區(qū)域UGACAUC結(jié)合緊密。提示TCF4可能為miR-139-5p的靶基因,見(jiàn)圖2a。Real-time PCR結(jié)果顯示,TCF4基因在胃癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(t=2.14,P=0.036)和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織(t=2.68,P=0.027),見(jiàn)圖2b、2c。且癌組織中TCF4的表達(dá)水平與miR-139-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rpearson=-0.42,P=0.03)。

2.3 TCF4蛋白表達(dá)水平 TCF4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿,陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色顆粒均勻分布。38例患者癌組織中TCF4蛋白陽(yáng)性26例(68.4%),陰性12例(31.6%)。

2.4 miR-139-5p、TCF4基因表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系 miR-139-5p表達(dá)水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和腫瘤病理分級(jí)(P<0.05)有關(guān),低表達(dá)組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例和低分化比例較高。TCF4表達(dá)水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和腫瘤浸潤(rùn)深度(P<0.05)有關(guān),TCF4陽(yáng)性表達(dá)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤(rùn)漿膜層比例較高,見(jiàn)表1。

表1 miR-139-5p、TCF4基因表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系

2.5 TCF4基因表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中,根據(jù)TCF4基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平分為高表達(dá)(≥TCF4表達(dá)中位數(shù))和低表達(dá)患者。Log-rank檢驗(yàn)顯示,TCF4高表達(dá)組患者總生存(OS)顯著低于TCF4低表達(dá)患者(HR=1.4,P=0.032),而高低表達(dá)患者無(wú)疾病進(jìn)展生存(DFS)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.4,P=0.094),見(jiàn)圖3。

圖3 TCF4基因表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系

3 討論

新近的腫瘤流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,2018年全球胃癌新發(fā)病例超過(guò)100萬(wàn)例,成為第五大常見(jiàn)癌癥[5]。據(jù)估計(jì),2018年全世界死于胃癌的人數(shù)約為78.3萬(wàn),是第三大致死惡性腫瘤[6]。飲食因素,如亞硝酸鹽和鹽漬食品、幽門(mén)螺桿菌感染是已知的胃癌的主要危險(xiǎn)因素。隨著食品保存技術(shù)的改進(jìn)和幽門(mén)螺桿菌的治療,胃癌的發(fā)病率已呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[7]。然而,近年來(lái)近端胃癌的發(fā)生率上升,且預(yù)后較差。我國(guó)、日本等東亞國(guó)家胃癌發(fā)病率較高,占全世界胃癌患者的50%左右[8-9]。整體上,我國(guó)胃癌患者的預(yù)后較差,晚期胃癌比例較高,早期診斷水平低于歐美及日本等發(fā)達(dá)國(guó)家[10]。盡管胃癌的發(fā)病率和死亡率較高,但其發(fā)生的確切分子機(jī)制并未完全闡明[11-12]。癌基因和抑癌基因的時(shí)空異常表達(dá),是胃癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)。近年來(lái),隨著高通量測(cè)序技術(shù)、芯片技術(shù)的不斷發(fā)展,大量新的基因被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)其相關(guān)生物學(xué)功能。miRNAs已被廣泛證實(shí)在人體多種惡性腫瘤中存在差異表達(dá),并扮演抑癌或促癌基因的角色[13-14]。

miR-139-3p和miR-139-5p是同一miR-139前體的成熟miRNA產(chǎn)物。miR-139-3p已被廣發(fā)研究,證實(shí)其在多種人體腫瘤中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[15-16]。抑制miR-139-3p表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出增殖水平降低,而凋亡比例增高,提示miR-139-3p為一經(jīng)典的癌基因,具有促癌作用[17]。而miR-139-5p相關(guān)研究報(bào)道較少,Ji等[4]在宮頸癌中的研究發(fā)現(xiàn),miR-139-5p具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用,認(rèn)為其分子機(jī)制可能與其靶向調(diào)控TCF4表達(dá),從而抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。

在本研究中,筆者采用Real-time PCR法檢測(cè)了38例胃癌患者癌組織、癌旁正常胃組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p的表達(dá)情況。miR-139-5p在正常組織表達(dá)水平顯著高于癌組織,同時(shí)在未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。提示miR-139-5p可能在胃癌的發(fā)生及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要抑制作用。筆者同時(shí)采用miRNA靶基因在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)該基因的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),提示轉(zhuǎn)錄因子4(TCF4)基因3’-UTR區(qū)域ACUGUAC序列與miR-139-5p 5’-UTR區(qū)域UGACAUC結(jié)合緊密。TCF4可能為miR-139-5p的靶基因。為進(jìn)一步證實(shí)TCF4為miR-139-5p靶基因的關(guān)系,筆者同時(shí)檢查了胃癌患者TCF4的表達(dá)水平,結(jié)果提示TCF4在癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)水平高于癌旁組織,且癌組織中TCF4與miR-139-5p表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。證實(shí)了生物信息分析結(jié)果,TCF4為miR-139-5p的靶基因。同時(shí)進(jìn)一步分析TCF4和miR-139-5p高低表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系發(fā)現(xiàn),miR-139-5p低表達(dá)組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例和低分化比例較高。而TCF4高表達(dá)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤(rùn)漿膜層比例較高,二者臨床特征也呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步分析TCF4表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系,筆者對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的胃癌患者進(jìn)行了總生存和無(wú)疾病進(jìn)展生存分析,結(jié)果認(rèn)為T(mén)CF4高表達(dá)組患者總生存(OS)顯著低于TCF4低表達(dá)患者,而高低表達(dá)組患者無(wú)疾病進(jìn)展生存(DFS)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

TCF4基因編碼蛋白為轉(zhuǎn)錄因子4,該蛋白為一種堿性螺旋—環(huán)—螺旋轉(zhuǎn)錄因子。編碼的蛋白質(zhì)識(shí)別Ephrussi盒(“-box”)結(jié)合位點(diǎn)(“CANNTG”),這是免疫球蛋白增強(qiáng)子中首次發(fā)現(xiàn)的基序。該基因廣泛表達(dá),已證實(shí)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。該基因的缺陷是導(dǎo)致皮特—霍普金斯綜合征的原因之一。此外,通常編號(hào)為10～37個(gè)重復(fù)單元的內(nèi)含子CTG重復(fù)可以擴(kuò)展到>50個(gè)重復(fù)單元,并導(dǎo)致Fuchs內(nèi)皮性角膜營(yíng)養(yǎng)不良。近年來(lái)陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道,該基因的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)。Bi 等[18]研究顯示miR-137通過(guò)靶向TCF4抑制結(jié)腸癌癌癥細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲,證實(shí)TCF4表達(dá)水平降低后能夠抑制腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移生物活性。He等[19]通過(guò)miR-133a-5p下調(diào)TCF4表達(dá),從而抑制腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,也證實(shí)TCF4在腸癌中發(fā)揮重要作用。TCF4下調(diào)表達(dá)后,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力減低的分子機(jī)制并不十分明確。相關(guān)研究認(rèn)為,可能與一下機(jī)制有關(guān):(1)TCF-4表達(dá)下調(diào)后,beta-catenin信號(hào)通路被抑制,而beta-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞增殖的重要通路,因此腫瘤細(xì)胞增殖能力減低[20]。(2)TCF4表達(dá)減低后,Wnt/β-catenin/TCF4信號(hào)通路被抑制,導(dǎo)致細(xì)胞遷移增殖能力減低[21]。

綜上所述,miR-139-5p在老年胃癌患者中低表達(dá),并可能通過(guò)靶向調(diào)控TCF4抑制腫瘤的進(jìn)展。TCF4高表達(dá)與胃癌患者總生存期減低有關(guān),并有望成為胃癌預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。體內(nèi)轉(zhuǎn)染或上調(diào)miR-139-5p表達(dá),為開(kāi)發(fā)胃癌靶向藥物提供了新的思路。但miR-139-5p靶向調(diào)控TCF4后導(dǎo)致老年胃癌患者腫瘤細(xì)胞增殖遷移能力減低的確切分子機(jī)制仍不十分明顯,應(yīng)進(jìn)一步采用基因測(cè)序、免疫共沉淀等新技術(shù),探討明確其調(diào)控信號(hào)通路的分子機(jī)制。