曹昀珅，楊 義，方 琦，汪 芳，葉恭銀

（浙江大學(xué)昆蟲(chóng)科學(xué)研究所/水稻生物育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部作物病蟲(chóng)害分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

寄生蜂是膜翅目寄生性昆蟲(chóng)，其物種豐富，寄主廣泛[1]，被廣泛用于農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)控制，在生物防治領(lǐng)域作用顯著[2,3]。寄生蜂在害蟲(chóng)生防應(yīng)用中還具有安全性高的特點(diǎn)，幾乎不會(huì)攻擊寄主外的生物，更不蟄刺人畜，是重要的害蟲(chóng)天敵資源[2,4]。目前寄生蜂的應(yīng)用以活體田間釋放為主，但其高效大面積應(yīng)用仍受到工廠化繁育及田間釋放的規(guī)模限制[5]。寄生蜂毒液和唾液中蛋白種類(lèi)豐富，可以作為天然的新型殺蟲(chóng)蛋白資源庫(kù)[5-7]。已有成功案例表明利用基因工程技術(shù)可將毒液基因資源用于提高植物抗蟲(chóng)性或改良蟲(chóng)生真菌的殺蟲(chóng)效果[8,9]，這為寄生蜂的應(yīng)用提供了新的思路。

目前，有關(guān)寄生蜂的生理生化研究多集中于其寄生因子以及殺蟲(chóng)肽類(lèi)[5]。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的寄生蜂毒液或唾液蛋白組分被解析，其中存在有過(guò)敏原同源基因，如透明質(zhì)酸酶、allergen 3、allergen 5、icarapin 等[10-12]，具有潛在的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)。

Icarapin 是一類(lèi)重要的致敏蛋白，最早于西方蜜蜂Apismellifera的毒液中分離得到[13]。與蜂毒過(guò)敏患者的血清雜交試驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白有人畜致敏活性[14]，癥狀表現(xiàn)為惡心、嘔吐、哮喘、水腫等，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)l(fā)休克反應(yīng)[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期從蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum和麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asonia vitripennis唾液腺轉(zhuǎn)錄組及基因組中鑒定到icarapin 的同源基因[16,17]，但其是否具有致敏性仍有待評(píng)估。蝶蛹金小蜂是蔬菜害蟲(chóng)菜粉蝶Pierisrapae、果樹(shù)害蟲(chóng)柑橘鳳蝶Papilioxuthus、玉帶鳳蝶P.xuthus等鱗翅目蝶類(lèi)的蛹期優(yōu)勢(shì)寄生蜂[16]；麗蠅蛹集金小蜂是多種衛(wèi)生害蟲(chóng)的天敵，是重要的衛(wèi)生害蟲(chóng)天敵資源[17]；兩種寄生蜂具有良好的應(yīng)用潛力。為此，本研究在克隆、表達(dá)與純化獲得兩種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白的基礎(chǔ)上，利用小鼠致敏模型對(duì)其進(jìn)行了致敏性的初步評(píng)價(jià)，為有關(guān)寄生蜂毒液或唾液源殺蟲(chóng)活性蛋白的安全評(píng)價(jià)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

試驗(yàn)所用的蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂均為野外采集后在室內(nèi)經(jīng)多代馴化后的實(shí)驗(yàn)室種群。2 種蜂的寄主分別是菜粉蝶蛹和家蠅Muscadomestica蛹。室內(nèi)飼養(yǎng)的條件如下：溫度（25±1）℃，光周期10L∶14D，相對(duì)濕度70%。羽化后的成蜂以無(wú)菌水配制的10%蜂蜜水飼喂，以延長(zhǎng)壽命。2 種蜂及其寄主的飼養(yǎng)方法與張倩倩[18]和錢(qián)岑等[19]報(bào)道一致。

1.2 菌種與表達(dá)載體

DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物科技有限公司。pET-28a(+)質(zhì)粒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑

TRizol 試劑購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司。ClonExpress? II One Step Cloning Kit 購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司。特異性引物由尚亞生物技術(shù)有限公司合成。BugBuster? Master Mix 裂解液和cOmplete? His-Tag 純化樹(shù)脂購(gòu)自Merck 醫(yī)藥生物科技公司。Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder、SurePAGETM預(yù)制膠購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。IPTG、NaH2PO4、NaCl 和咪唑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。小鼠的6×His-Tag 抗體和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。西方蜜蜂icarapin 蛋白準(zhǔn)備以及小鼠的致敏注射和取血由杭州華安生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。小鼠組胺酶聯(lián)免疫分析試劑盒以及小鼠IgE 酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 全蟲(chóng)總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

分別取蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂寄生后第5 d 的幼蟲(chóng)6 頭，使用PBS 緩沖液清洗后，加入鋼珠和TRizol 試劑后，以25 Hz 的頻率勻漿破碎2.5 min。按照TRizol 試劑使用說(shuō)明書(shū)上的操作提取兩種金小蜂的全蟲(chóng)總RNA，以此為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂的cDNA。

1.5 編碼基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

選擇pET-28a(+)質(zhì)粒為表達(dá)載體，采用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切。按照表1 的序列合成兩組特異性引物，以蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用DNA 凝膠回收試劑盒純化回收PCR 擴(kuò)增得到的目的片段和酶切后的線性化載體，并分別將蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂的片段和載體相互連接，構(gòu)建得到重組載體pET-28a(+)-icarapin-Pp 和pET-28a(+)-icarapin-Nv。然后將重組載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以卡那霉素濃度50 μg/mL 的LB 培養(yǎng)基篩選，挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行PCR 鑒定和測(cè)序。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

蛋白的分子量、等電點(diǎn)和親水系數(shù)等特征由Expasy-ProtParam 在線預(yù)測(cè)得到，信號(hào)肽由signal P 5.0 在線預(yù)測(cè)。使用NCBI 的在線Blastp 將2 種金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白與NR 庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，挑選具有較高相似性的同源序列使用Clustal W 進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA 5 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.7 qRT-PCR

分別取2 種寄生蜂不同發(fā)育階段及幼蟲(chóng)組織進(jìn)行qRT-PCR 分析，以探究類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因在2種金小蜂中的表達(dá)模式。取樣時(shí)期與組織分別為：初孵幼蟲(chóng)（寄生結(jié)束后第2 d）、老熟幼蟲(chóng)（寄生結(jié)束后第5 d）、白蛹、白眼黃蛹、紅眼黃蛹、黑蛹、初羽化成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)唾液腺和幼蟲(chóng)殘?bào)w（去除唾液腺），每個(gè)時(shí)期取4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算，并進(jìn)行歸一化處理。以金小蜂科內(nèi)高度保守的18S 作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)熱3 min；95 ℃復(fù)性10 s 以及60 ℃退火30 s，后兩步重復(fù)40 個(gè)循環(huán)；PCR 結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析引物效果。

1.8 重組類(lèi)icarapin 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

選取插入片段序列正確的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，以卡那霉素濃度50 μg/mL的LB 固體培養(yǎng)基篩選。取陽(yáng)性菌落接種于含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，以37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜。次日按過(guò)夜菌液∶LB 液體培養(yǎng)基＝1∶100 比例稀釋?zhuān)?7 ℃、200 r/min 搖菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段（菌液OD600在0.6～0.8）。向菌液中加入終濃度1 mmol/L 的IPTG（同時(shí)取少量菌液作為對(duì)照組，不進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)），在16 ℃的搖床中120 r/min 誘導(dǎo)過(guò)夜。搖菌完畢的菌液，以4 ℃、12000 r/min 離心收集菌體沉淀。用BugBuster? Master Mix 裂解液重懸浮沉淀，菌液體積為所用裂解液體積的40 倍。以4 ℃、14000 r/min條件離心取上清液，通過(guò)SDS-PAGE 電泳和Western blot 檢測(cè)鑒定蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂類(lèi)icarapin蛋白的表達(dá)情況。

1.9 重組類(lèi)icarapin 蛋白的純化

重組蛋白的純化根據(jù)Ni-NTA Reagent Kit 進(jìn)行（Merck 醫(yī)藥生物科技公司），具體步驟如下：（1）將裂解后的上清液加入經(jīng)結(jié)合緩沖液充分潤(rùn)洗的His-Tag 純化樹(shù)脂；（2）4 ℃的搖床上慢速輕柔混勻，結(jié)合過(guò)夜；（3）用漂洗緩沖液洗凈雜蛋白；（4）加入洗脫緩沖液收集目標(biāo)蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE 電泳鑒定蛋白純度。

1.10 小鼠致敏模型的建立

取24 只6 周大的BALB/c 小鼠，體重在18～22 g 范圍內(nèi)，隨機(jī)分成4 組，每組雌鼠和雄鼠各3 只，計(jì)6 只。陰性對(duì)照組注射PBS 緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照組注射明確有致敏性的西方蜜蜂icarapin 蛋白[14]。其余兩組為試驗(yàn)組，分別注射蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白。在試驗(yàn)的第0 d、第7 d 和第14 d對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行注射處理，其中陽(yáng)性組和試驗(yàn)組每次每只小鼠皮下注射含有0.04 mg/mL 的icarapin 蛋白或類(lèi)icarapin 蛋白的PBS 溶液0.25 mL，陰性對(duì)照注射僅0.25 mL PBS 溶液。試驗(yàn)第21 d 時(shí)，對(duì)各組小鼠分別靜脈取血，供后續(xù)試驗(yàn)。

1.11 類(lèi)icarapin 蛋白致敏性評(píng)價(jià)

在哺乳動(dòng)物中，血液中免疫球蛋白E（IgE）以及組胺（Histamin）的增加是接觸或攝入致敏原后的重要生理特征。本試驗(yàn)以末次注射一周后小鼠血清中總IgE 以及組胺濃度的差異為考察致敏能力強(qiáng)弱的生理指標(biāo)。分別采用酶免實(shí)業(yè)有限公司的小鼠組氨酶聯(lián)免疫分析試劑盒以及小鼠IgE 酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作參照試劑盒使用說(shuō)明。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆及序列分析

分別使用2 種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因的引物對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序后得到2 種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因的序列信息（圖1)，與基因組中的序列一致[18,19]。蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因開(kāi)放閱讀框分別為645 bp 和714 bp，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量分別為24.94 kDa 和24.90 kDa，等電點(diǎn)分別為4.09 和4.11，平均親水系數(shù)分別為-0.607 和-0.602。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明麗蠅蛹集金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白具有信號(hào)肽，而蝶蛹金小蜂的類(lèi)icarapin 不具有信號(hào)肽。

圖1 兩種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白與西方蜜蜂icarapin 的序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of icarapin-like proteins in two pteromalid wasps and icarapin in Western honey bee

根據(jù)FAO/WHO 的致敏性預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[20]，潛在蛋白符合：（1）在80 個(gè)氨基酸窗口與已知過(guò)敏原的序列相似性高于35%；（2）連續(xù)6 個(gè)以上的氨基酸與已知致敏原一致，則可能具有潛在的致敏性。為了預(yù)測(cè)兩種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白的潛在致敏性，對(duì)其與已知過(guò)敏原西方蜜蜂icarapin 蛋白進(jìn)行了序列比對(duì)。結(jié)果表明，蝶蛹金小蜂與麗蠅蛹集金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白與西方蜜蜂icarapin 蛋白的相似性分別為41%和33%，在80 個(gè)氨基酸窗口內(nèi)分別具有53%和49%的序列相似性，且均具有13 個(gè)連續(xù)一致的氨基酸殘基（圖1），表明2 種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白具有潛在的致敏性。

使用NCBI 中在線搜索了2 種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白的同源序列，使用Clustal W 進(jìn)行多序列比對(duì)后使用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，4 種金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白聚為一支，與榕小蜂Ceratosolensolmsi和短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum的類(lèi)icarapin 較為相似（圖2）。

圖2 代表性昆蟲(chóng)類(lèi)icarapin 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analyses of the icarapin-like protein coding genes in representative insects

2.2 類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因表達(dá)模式

使用qRT-PCR 的方法分析了2 種金小蜂類(lèi)icarapin 基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，類(lèi)icarapin 基因在2種金小蜂雌、雄蟲(chóng)的各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)。在蝶蛹金小蜂的白蛹及成蟲(chóng)期具有最高的表達(dá)量，而在麗蠅蛹集金小蜂的黃蛹期表達(dá)量最高（圖3）。類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因在2 種金小蜂幼蟲(chóng)唾液腺和殘?bào)w中均有一定表達(dá)（圖4）。

圖3 類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因在兩種金小蜂不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況Fig.3 The expression profiles of icarapin-like protein coding genes in different development stages of the two pteromalid wasps

圖4 類(lèi)icarapin 蛋白編碼基因在兩種金小蜂唾液腺和殘?bào)w中的表達(dá)情況Fig.4 The expression profiles of icarapin-like protein coding genes in saliary glands and carcass of larva of the two pteromalid wasps

2.3 重組類(lèi)icarapin 蛋白的表達(dá)和純化

使用pET-28a(+)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，成功構(gòu)建兩種金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)載體后，以未誘導(dǎo)的pET-28a(+)-icarapin-Pp 和pET-28a(+)-icarapin-Nv 為陰性對(duì)照，SDS-PAGE 和Western blot 結(jié)果表明，在大腸桿菌BL21（DE3）裂解后的上清具有大小約為30 kDa 的條帶（圖5），符合兩種金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白的理論大小。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解，取上清液與His-Tag 純化樹(shù)脂結(jié)合，成功獲得了蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂較高純度的重組類(lèi)icarapin 蛋白（圖5）。

圖5 兩種金小蜂icarapin 蛋白的表達(dá)與純化Fig.5 SDS-PAGE result of expressed and purified recombinant icarapin proteins of two pteromalid wasps

2.4 重組類(lèi)icarapin 蛋白的潛在致敏性評(píng)價(jià)

采用小鼠致敏模型對(duì)2 種金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白的潛在致敏性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖6 所示。陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、蝶蛹金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白組和麗蠅蛹集金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白組的小鼠血中總IgE平均濃度分別為206.2（±17.59）ng/mL、252.7（±19.19）ng/mL、345.8（±28.23）ng/mL、306.9（±21.57）ng/mL；組胺平均濃度分別為18.64（±1.98）ng/mL、22.74（±2.53）ng/mL、27.42（±3.87）ng/mL、24.96（±1.53）ng/mL。注射了蝶蛹金小蜂和麗蠅蛹集金小蜂類(lèi)icarapin 蛋白的2 個(gè)試驗(yàn)組以及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中總IgE 含量以及組胺濃度均高于陰性對(duì)照組（IgE：PAmelvsPBS＝1.39e-3，PPpvsPBS＝1.22e-06，PNvvsPBS＝4.73e-06；組氨：PAmelvsPBS＝0.01，PPpvsPBS＝5.81e-4，PNvvsPBS＝1.05e-4；圖6），表明2 種寄生蜂的類(lèi)icarapin 蛋白具有潛在的致敏性。

圖6 小鼠血清中組胺和總IgE 濃度Fig.6 Concentrations of histamine and total IgE in BALB/c mice serum

3 討論

寄生蜂活性物質(zhì)作為備受重視的殺蟲(chóng)蛋白候選資源庫(kù)，其殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入昆蟲(chóng)病原物或作物中，可能會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物有一定的影響[2,21]。同時(shí)昆蟲(chóng)含有豐富的蛋白質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近幾十年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)昆蟲(chóng)作為食物或飼料的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究[22,23]。因此有必要對(duì)這些基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

Icarapin 是西方蜜蜂中一種常見(jiàn)的過(guò)敏原，保守存在于多種昆蟲(chóng)中[24-26]。本研究在2 種重要的金小蜂中克隆得到了icarapin 的同源基因。發(fā)育動(dòng)態(tài)的結(jié)果顯示，該蛋白的編碼基因在2 種金小蜂的整個(gè)發(fā)育歷期中均有表達(dá)，即無(wú)論哪一時(shí)期皆有與類(lèi)icarapin 蛋白接觸的可能性。根據(jù)FAO/WHO 的致敏性預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)2 種金小蜂中類(lèi)icarapin 蛋白均具有潛在的致敏性，需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

BALB/c 小鼠模型是鑒定候選蛋白潛在致敏性的有效模型，已有多種致敏原的BALB/c 小鼠模型報(bào)道[28]，動(dòng)物血清中IgE 和組胺水平是評(píng)價(jià)致敏反應(yīng)的重要指標(biāo)[29]。本研究通過(guò)pET-28a(+)體系成功對(duì)2 種金小蜂的類(lèi)icarapin 蛋白進(jìn)行表達(dá)。在此基礎(chǔ)上建立了小鼠致敏模型，以血清組胺和IgE 濃度為測(cè)定指標(biāo)，與西方蜜蜂icarapin 蛋白相比，初步明確了2 種金小蜂的icarapin 蛋白均具有潛在的致敏風(fēng)險(xiǎn)。但該蛋白真正的生理功能尚未知，是否能夠有效作用于靶標(biāo)害蟲(chóng)仍需進(jìn)一步探究。

Rauber 等[29]利用40 例icarapin 陽(yáng)性的蜂毒過(guò)敏病人血清與icarapin 中15-mer 的多肽進(jìn)行特異性IgE的檢測(cè)并鑒定到一個(gè)主要的IgE 表位（Api m 10160-174；氨基酸序列：ADSDVTTLPTLIGKN）。但是，西方蜜蜂icarapin 的該區(qū)域與2 種寄生蜂并不保守，相似性?xún)H為13%。就2 種金小蜂與西方蜜蜂icarapin 連續(xù)一致的13 個(gè)氨基酸區(qū)域組成的多肽，Rauber 等[29]在西方蜜蜂的研究中表明該肽與蜜蜂毒液過(guò)敏病人血清的IgE 反應(yīng)并不高?？梢?jiàn)，2 種寄生蜂icarapin 蛋白可能具有新的IgE 表位，且對(duì)人致敏的風(fēng)險(xiǎn)不大。但是，本研究?jī)H是基于小鼠模型的評(píng)價(jià)，這2 種蛋白對(duì)人是否具有真正的致敏性仍需要進(jìn)一步確認(rèn)。即在利用基于小鼠模型進(jìn)一步測(cè)定其特異性IgE 濃度和基于RBL-2H3 細(xì)胞系進(jìn)行致敏性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，尚需要開(kāi)展基于蜂毒過(guò)敏病人血清對(duì)其交叉致敏性的測(cè)定。此外，考慮到寄生蜂在自然界不會(huì)主動(dòng)蟄刺人畜，直接接觸人的風(fēng)險(xiǎn)較低，應(yīng)用寄生蜂活體在自然界控制害蟲(chóng)的致敏風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)該相對(duì)較低。但未來(lái)在具體應(yīng)用到寄生蜂毒液、唾液等殺蟲(chóng)活性蛋白時(shí)，在應(yīng)用前建議需要對(duì)其致敏風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。