林慧琳,葉玲清,葉海梅,黃智瑜,陳偉偉,,鄭奎城,

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)為革蘭陽(yáng)性、兼性厭氧、G+C 含量低的無(wú)芽胞桿菌,是一種重要的人獸共患病原菌[1]。該菌廣泛存在于自然環(huán)境、各類食品中,對(duì)惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)抵抗力,具有嗜冷、嗜鹽性,可污染食品加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等多個(gè)環(huán)節(jié)[2-3]。Lm致病力與其攜帶的毒力基因密切相關(guān),在Lm感染人體的一系列過(guò)程中均涉及毒力基因的調(diào)控,這些毒力基因主要分布在毒力島 1(LIPI-1:prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB)、毒力島 2 (LIPI-2:inlA、inlB、inlC到inlH)及調(diào)控基因iap;少量分布在毒力島 3(LIPI-3:llsA、llsG、llsH、llsX等)、及毒力島 4(LIPI-4:ptsA等)[4]。此外,Lm致病力還與抗生素的敏感性有關(guān),雖耐藥情況不像其他食源性病原菌(如金黃色葡萄球菌)那樣嚴(yán)重,但近年有加重趨勢(shì),有必要不斷監(jiān)測(cè)Lm藥物敏感性[5]。

當(dāng)人體食入被Lm污染的食物時(shí)可能會(huì)引起李斯特菌病,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、腦膜炎及敗血癥,病死率高達(dá)20%～30%;易感人群主要為新生兒、孕婦、65 歲以上的老年人等免疫力低下的人[6-8]。研究表明李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)病例主要與即食食品有關(guān)[9]:如2017年1月到2018年7月[10],南非暴發(fā)了世界上最大的李斯特菌病事件,共確診 1 060 例、216 人死亡,食品污染源為即食加工熟肉制品。盡管我國(guó)GB29921-2021、GB31607-2021等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求熟肉制品、乳制品等不得檢出Lm,但從各地開展的食品監(jiān)測(cè)來(lái)看,即食食品中存在Lm污染的現(xiàn)象仍不乏存在。隨著即食產(chǎn)品多樣化、規(guī)模化生產(chǎn)及人們生活方式、飲食習(xí)慣的改變,即食食品帶來(lái)的Lm感染風(fēng)險(xiǎn)日趨嚴(yán)峻,因此對(duì)該菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本文對(duì)2011—2021年福建省即食食品中Lm污染監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)及其分離株特征進(jìn)行分析,旨在了解污染狀況、菌株毒力基因攜帶情況、耐藥及分子特征,并為相關(guān)部門采取防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集 綜合考慮福建省地域分布、國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃要求等因素,2011—2021年在福建省9 個(gè)監(jiān)測(cè)地區(qū)的區(qū)縣、農(nóng)村及城市,按照多級(jí)分層隨機(jī)抽樣方法,在多類地點(diǎn)均無(wú)菌采集16類,共計(jì)8 166 份即食食品,其中福州市、莆田市、泉州市、廈門市、漳州市、三明市、南平市、龍巖市、寧德市分別采集1 350、1 010、736、739、635、917、947、984、848份,并及時(shí)送檢。

1.1.2 菌株來(lái)源 2011—2021年福建省采集的8 166份即食食品中檢測(cè)出、并經(jīng)保存、增菌復(fù)活成功的83株Lm,其中26株分離自壽司、19株分離自中式?jīng)霭璨恕?株分離自熟制米面制品、3株分離自盒飯及熱菜、21株分離自熟肉制品、6株分離自生食水產(chǎn)品、1株分離自非發(fā)酵豆制品、及1株分離自其他類別。Lm參考菌株(ATCC 19115)作為陽(yáng)性對(duì)照菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制。

1.1.3 主要儀器與試劑 李氏增菌肉湯LB(LB1,LB2)、血瓊脂平板和鼠李糖、木糖生化管(北京陸橋);李斯特菌顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉); VITEK生物鑒定板(法國(guó)生物梅里埃);DNA 提取試劑盒(北京天根);PCR引物(上海生工生物工程合成);PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI);水平電泳槽(美國(guó)Bio-Rad);Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad);革蘭陽(yáng)性菌96孔藥敏檢測(cè)板(珠海美華),所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.2 方 法

1.2.1 單增李斯特菌檢驗(yàn) 所采集樣品按GB 4789. 30《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》中的方法進(jìn)行檢測(cè)Lm。

1.2.2 DNA模板提取 將-80 ℃保存的Lm與參考菌株接種于腦心浸液肉湯中,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),培養(yǎng)物按照DNA提取試劑盒要求進(jìn)行模板提取。

1.2.3 毒力基因檢測(cè) 選擇Lm的13個(gè)毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別為prfA、mpl、plcA、hly、plcB、iap、actA、inlA、inlB、inlC、inlJ、llsX、ptsA,引物合成參照文獻(xiàn)[11-16], PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,100V 30 min,Gel red染色后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 藥物敏感性檢測(cè) 采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法,結(jié)合臨床用藥和研究需要,共選擇15種抗生素,使用商品化藥敏板進(jìn)行藥敏檢測(cè),每次試驗(yàn)均采用 ATCC29213作為質(zhì)控菌株,藥敏結(jié)果參照CLSI 相關(guān)解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.2.5 血清學(xué)分型 根據(jù)Doumith M等[17]建立的多重PCR方法,對(duì)活化成功的83株Lm分離株進(jìn)行血清學(xué)分型。

1.2.6 多位點(diǎn)序列分型(MLST) 根據(jù)法國(guó)巴斯德研究所提供的用于Lm的MLST方法(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/primers-used/),將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行雙向測(cè)序,將測(cè)序序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),確定每個(gè)管家基因的等位基因號(hào),abcZ-bglA-cat-dapE-dat-ldh-lhkA7 個(gè)等位基因號(hào)的組合即為該菌株的ST型,并按照abcZ-bglA-cat-dapE-dat-ldh-lhkA順序拼接好每株菌的序列,利用MEGA軟件進(jìn)行聚類,構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法,P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 即食食品中Lm檢出情況 2011—2021年共采集16類即食食品,以壽司的檢出率最高為6.26%,其次是中式?jīng)霭璨?、熟肉制?分別為5.6%、1.87%。16類即食食品的Lm檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=217.68,P<0.01),見表1。

表1 不同類別即食食品中單增李斯特菌檢出情況Tab.1 Detection of Listeria monocytogenes in various categories of ready-to-eat foods

2.2 毒力基因檢出情況 對(duì)83株菌株進(jìn)行13種毒力基因檢測(cè),毒力基因prfA、mpl、plcA、hly、iap、actA、inlA、inlB、inlC、inlJ的檢出率均為100%,plcB、llsX、ptsA檢出率分別為55.42%、16.87%、22.89%。83株Lm菌株中攜帶10種(缺失plcB-llsX-ptsA)、11種(缺失llsX-ptsA)、12種(僅缺失ptsA)毒力基因的比例分別為100%(83/83)、55.42%(46/83)、1.20%(1/83),見表2。

表2 83株單增李斯特菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果信息Tab.2 Experimental results for 83 Listeria monocytogenes isolates

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 總體耐藥特征 對(duì)83株菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),菌株頭孢西丁(FOX)的耐藥率最高為100%,其次是苯唑西林(OXA)、四環(huán)素(TET)、紅霉素(ERY),分別為15.66%、13.25%、10.84%;對(duì)克林霉素(CLI)、環(huán)丙沙星(CIP)、達(dá)托霉素(DAP)耐藥的菌株也均有出現(xiàn),此外,還出現(xiàn)對(duì)克林霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氯霉素(CHL)中介的菌株,其中對(duì)克林霉素的中介率達(dá)67.47%。但所有菌株均對(duì)氨芐西林(AMP)、青霉素(PEN)、萬(wàn)古霉素(VAN)、復(fù)方新諾明(T/SUL)、慶大霉素(GEN)、亞胺培南(IPM)、紅霉素/克林霉素(ERY/CLI)敏感,見表3。

表3 83株單增李斯特菌總體耐藥情況Tab.3 Overall resistance of 83 Listeria monocytogenes isolates

2.3.2 總體耐藥譜 對(duì)2種及以上抗菌藥物耐藥的菌株有28株,耐藥率為33.73%(28/83),其中多重耐藥率為13.25%(11/83);耐藥譜以耐2種且以耐OXA-FOX最常見;此外,在1份熟肉制品、1份熟制米面制品、2份壽司樣品中檢出四重耐藥株,耐藥譜均為OXA-ERY-TET-FOX,見表2。

2.4 血清學(xué)分型結(jié)果 83株Lm分離株被分為4種血清型,分別為1/2a(40株,48%)、1/2b(33株,40%)、1/2c(6株,7%)、4b(4株,5%)型,其中以1/2a 和1/2b型為優(yōu)勢(shì)血清型,見表2。

2.5 MLST基因分型結(jié)果 對(duì)83株Lm進(jìn)行MLST基因分型,共鑒定出16種序列型(ST)。以ST87為優(yōu)勢(shì)型別,其次是ST8,ST101,分別占比24.10%(20/83)、15.66%(13/83)、12.05%(10/83),并發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的ST型待提交數(shù)據(jù)庫(kù)審核。ST型與血清型之間對(duì)應(yīng)關(guān)系密切,除ST9對(duì)應(yīng)1/2c、1/2b型外,其余ST型均只對(duì)應(yīng)一種血清型。

7個(gè)管家基因中,不超過(guò) 1 個(gè)等位基因編號(hào)不同的2株Lm被認(rèn)為屬于同一個(gè)克隆群(clonal complexes,CCs)[18]。此次分型將菌株分為14個(gè)CC群,大部分CC群與ST型一一對(duì)應(yīng),以CC87、CC8、CC101分布廣泛,分別對(duì)應(yīng)ST87、ST8,ST101(表4),83株Lm聚類結(jié)果見圖1。

注:從左到右依次為菌株編號(hào)、樣品類別、菌株分離地區(qū)(FZ:福州;PT:莆田;QZ:泉州;XM:廈門;ZZ:漳州;NP:南平;LY:龍巖;SM:三明;ND:寧德)、分離年份、血清型、ST型、CC群 ▲:新ST型。圖1 83株單增李斯特菌最小進(jìn)化樹圈Fig.1 Minimal evolutionary circle of 83 Listeria monocytogenes isolates

表4 83株單增李斯特菌血清型、ST型和CC群分布Tab.4 Distribution of 83 Listeria monocytogenes serotypes, ST and CC groups

3 討 論

Lm是一種重要的食源性病原體,目前仍對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重要威脅。本研究合計(jì)采集8 166份即食食品,共檢出102株Lm,污染率為1.25%,與河南省[19]的結(jié)果接近(1.34%),低于Chen Y等[20]對(duì)我國(guó)21個(gè)省份部分即食食品的采樣報(bào)道(10.8%);也低于國(guó)外Koskar J等[21]對(duì)愛沙尼亞即食食品的監(jiān)測(cè)結(jié)果(3.6%),這可能與本次監(jiān)測(cè)的即食食品類別較多有關(guān),其中焙烤及油炸類食品、乳與乳制品、生食果蔬及制品等類別未檢出Lm,故整體檢出率較上述地區(qū)低,也可能與每個(gè)地區(qū)衛(wèi)生條件或地理位置的差異有關(guān)。此次研究表明,福建省部分市售即食食品存在較嚴(yán)重的Lm污染,尤其以壽司(6.26%),涼拌菜(5.26%)污染率高,主要因?yàn)檫@類冷加工即食食品一般不經(jīng)過(guò)高溫處理,而Lm的生長(zhǎng)溫度范圍寬,對(duì)低溫有較強(qiáng)的耐受性,即使在冷藏條件下也能生長(zhǎng);其次熟肉制品的污染率也較高,這與盛放熟肉的器具多為開放或半開放式,極易造成加工后二次污染有關(guān)[22],提示日后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)上述食品的監(jiān)管力度,從源頭上進(jìn)行污染控制,同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)健康教育,使消費(fèi)者,尤其是高危人群,盡可能食用加熱過(guò)的食物。

Lm為一種胞內(nèi)寄生菌,其所致的感染涵蓋4個(gè)過(guò)程:黏附與侵襲、逃離吞噬體、宿主細(xì)胞內(nèi)增殖、細(xì)胞間傳播。在這一系列過(guò)程中,毒力基因的存在、表達(dá)起到重要的調(diào)控作用,缺失將導(dǎo)致其致病性的消失或下降[23]。其中hly、plcA、plcB毒力基因共同作用使液泡膜裂解,Lm得以逃離吞噬體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì);llsX(LIPI-3) 則能夠增強(qiáng)Lm溶血與細(xì)胞毒活性,并在感染過(guò)程中改變宿主微生物群;LIPI-4增強(qiáng)Lm的神經(jīng)和胎盤向性[20],通過(guò)檢測(cè)llsX和LIPI-4基因片段(ptsA)可用來(lái)識(shí)別具有潛在高毒性的Lm分離株[16]。本次研究顯示福建省即食食品中Lm分離株的LIPI-1、LIPI-2攜帶率較高,毒力基因缺失現(xiàn)象并不嚴(yán)重,僅有部分分離株缺失plcB,而有研究[24]表明缺失plcB基因不影響Lm的體外生長(zhǎng),可認(rèn)為此次分離株具有潛在致病性。此外,在中式?jīng)霭璨?、壽司、熟肉制品中檢出llsX、ptsA基因,提示上述即食食品會(huì)對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成威脅,食用會(huì)增加李斯特菌病的感染風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)引起相關(guān)部門關(guān)注。

目前,臨床上治療人類李斯特菌病的首選方案為氨芐西林或青霉素單獨(dú)使用或與慶大霉素等氨基糖苷類藥物聯(lián)合使用。本研究對(duì)即食食品中的83株Lm進(jìn)行藥敏試驗(yàn),所有分離株均對(duì)頭孢西丁天然耐藥,這一結(jié)果與劉洋等[25]報(bào)道江西熟肉制品的耐藥情況一致。除頭孢西丁外,仍有28株Lm對(duì)其他抗菌藥物存在耐藥,耐藥率為33.73%,高于閆韶飛等[5]報(bào)道的中國(guó)23個(gè)省市的即食食品Lm分離株藥敏結(jié)果(11.53%)、也高于鄭雅雯等[26]的結(jié)果(21.7%)。耐藥株主要對(duì)苯唑西林、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星耐藥,這與涂文君等[27]報(bào)道重慶市雞肉中Lm分離株對(duì)四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性較高相反,與趙悅等[28]報(bào)道的較為一致。其中,對(duì)四環(huán)素耐藥(13.25%,僅次于苯唑西林)的菌株中約一半是熟肉制品,可能與近年來(lái)動(dòng)物飼料中出現(xiàn)四環(huán)素添加使用有關(guān)[29]。但未出現(xiàn)對(duì)李斯特菌病一線治療藥物耐藥的現(xiàn)象,故暫不影響臨床的首選治療。盡管如此,仍在4份熟肉制品、3份壽司、3份中式?jīng)霭璨恕?份熟制米面制品檢出包含多種耐藥譜的多重耐藥株與1株達(dá)托霉素耐藥株,這印證了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外食品分離株耐藥譜逐漸變寬[30],也表明上述類別食品中的Lm分離株耐藥情況不容樂(lè)觀。

多重PCR將Lm的血清型分為1/2a群(1/2a,3a)、1/2b群(1/2b,3b,7)、1/2c群(1/2c,3c)、4b群(4b,4d,e),其中3a、3b、7、3c、4d、e較為罕見,因此Lm的血清型可分為1/2a、1/2b、1/2c及4b型。本次Lm分離株包含上述4種血清型,以1/2a(40株)、1/2b型(33株)為主,此外還檢測(cè)到 4株4b型,而這3種正是散發(fā)及暴發(fā)李斯特菌病的常見血清型,尤其在歐洲和北美,1/2a 血清型與李斯特菌病的暴發(fā)更頻繁地聯(lián)系在一起[31]。但血清學(xué)分型對(duì)Lm分辨能力過(guò)低,MLST 是在測(cè)序的基礎(chǔ)上為研究菌群基因結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的一種高分辨率分型技術(shù),其結(jié)果能夠用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株間的關(guān)系,且可在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比較,因此一定程度上滿足了Lm流行病學(xué)研究發(fā)展的要求[32]。本次研究首次在福建省使用MLST分型對(duì)Lm進(jìn)行研究,83株Lm分為14個(gè)CC群、16個(gè)ST型,其中包含一個(gè)新的ST型。Wang Y等[33]對(duì)2000—2008年分離自中國(guó)12個(gè)省市的各類食品來(lái)源212株Lm進(jìn)行分析,得到優(yōu)勢(shì)型ST9、ST8和ST87;章樂(lè)怡等[23]對(duì)溫州市2007—2017年97株各類食品與病例Lm分離株進(jìn)行分析,得到優(yōu)勢(shì)型別ST87、ST121和ST9;Wu S等[34]在2012—2014年對(duì)24個(gè)城市采集并分離到的80份即食食品進(jìn)行分型,得到ST8、ST1、ST87為優(yōu)勢(shì)型別;成夢(mèng)雅等[35]對(duì)上海市2013-2014年86株食源性Lm分型,得到優(yōu)勢(shì)型別ST8、ST155、ST87,優(yōu)勢(shì)CC群CC8、CC155和CC87;李薇薇等[36]對(duì)2017年中國(guó)239株即食食品Lm分離株進(jìn)行分析,得到CC8、CC101和CC87為優(yōu)勢(shì)CC群,對(duì)應(yīng)ST8、ST101和ST87;康立超等[30]對(duì)2013—2019 年新疆各類食品63株Lm進(jìn)行分型,得到ST8、ST9、ST121、ST87 為優(yōu)勢(shì)型,CC8、CC9、CC1和CC121為優(yōu)勢(shì)CC群;可見本研究得到的優(yōu)勢(shì)CC群CC87、CC8、CC101,優(yōu)勢(shì)型別ST87、ST8,ST101與全國(guó)范圍流行的相符,并與李薇薇等[36]的結(jié)果一致。本研究聚類結(jié)果顯示,相同采樣點(diǎn)不同年份、相同年份不同采樣點(diǎn)來(lái)源的菌株聚在一起、出現(xiàn)相同型別菌株,如本次福州2014—2017年均檢出ST87;此外,相同時(shí)間、同一采樣點(diǎn)、相同或者不同類別食品也出現(xiàn)相同型別菌株。提示上述型別在不同年份持續(xù)存在,加之食品的流通,使得同一型別流行不同地區(qū),但是否存在持續(xù)污染、交叉污染有待進(jìn)一步結(jié)合生產(chǎn)環(huán)節(jié)、加工環(huán)節(jié)、零售市場(chǎng)等各個(gè)環(huán)節(jié)的流行病學(xué)資料進(jìn)行研究[37]。值得注意的是毒力基因ptsA陽(yáng)性的菌株均為ST87,2重及以上耐藥株也以ST87、ST8、ST121、ST101為優(yōu)勢(shì)型別,而Lu B等[38]對(duì)大陸2008—2019年29個(gè)醫(yī)院的李斯特菌病病例分析,發(fā)現(xiàn)ST87最常見,其次是ST1、ST8;Tsai YH等[39]對(duì)臺(tái)灣2014—2019年收集的411例李斯特菌病病例分析,也發(fā)現(xiàn)ST87最常見;此外,ST8對(duì)應(yīng)的CC8是2011—2013年瑞士李斯特菌病病人分離株的主要克隆群[40]?？梢姼＝ㄊ〖词呈称分蠰m對(duì)應(yīng)ST型分離株具有潛在的暴發(fā)流行風(fēng)險(xiǎn), 尤其應(yīng)加強(qiáng)ST87的監(jiān)測(cè),而ST87菌株大多分布在本次研究的高風(fēng)險(xiǎn)食品類別壽司、中式?jīng)霭璨思笆烊庵破分?更進(jìn)一步表明應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這3類食品的管控。

綜上所述,壽司、中式?jīng)霭璨思笆烊庵破分械腖m檢出率較高,分離株具有潛在致病性、感染風(fēng)險(xiǎn),且耐藥情況不容樂(lè)觀,相關(guān)部門應(yīng)切實(shí)加強(qiáng)對(duì)即食食品中Lm的監(jiān)管,尤其是上述高風(fēng)險(xiǎn)類別食品,加大監(jiān)管力度及規(guī)范抗生素的合理使用。

利益沖突：無(wú)