魯弘毅，田海峰，胡喬木，李 忠

1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070

黃鱔 (Monopterusalbus) 屬于硬骨魚綱、合鰓魚目、合鰓魚科，為淡水肉食性魚類[1]，主要分布于中國(guó)、日本、印度，以及泰國(guó)、印度尼西亞、緬甸等一些東南亞國(guó)家[2]。在我國(guó)，黃鱔分布在除青藏高原以外的廣泛區(qū)域，是我國(guó)重要的名特優(yōu)淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一，其肉質(zhì)鮮美，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。根據(jù)《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)，湖北、江西、安徽、湖南、四川是我國(guó)黃鱔養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)，在2016—2020 年間年均產(chǎn)量超30 萬(wàn)噸，其中湖北省的產(chǎn)量最高，其年產(chǎn)量占全國(guó)的40%以上[4-8]。黃鱔通常在完成第一次產(chǎn)卵后會(huì)由雌性轉(zhuǎn)為雄性，導(dǎo)致適齡繁育的雌性親本數(shù)量稀缺，極大限制了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展[9]。目前，我國(guó)黃鱔養(yǎng)殖主要依賴于野生苗種捕撈，質(zhì)量參差不齊，這種高強(qiáng)度捕撈對(duì)黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性及種質(zhì)資源造成了極大破壞。在育種方面，目前尚無(wú)國(guó)家認(rèn)定的黃鱔養(yǎng)殖品種，因此開展黃鱔品種選育、篩選優(yōu)良品系、進(jìn)行家系管理，是當(dāng)下黃鱔育種工作中的迫切需求。筆者課題組已實(shí)現(xiàn)黃鱔全人工繁育技術(shù)的突破，已應(yīng)用于規(guī)?；纾㈤_展了家系選育工作，為下一步黃鱔良種的選育奠定了基礎(chǔ)。

在黃鱔后續(xù)良種選育工作中，親子鑒定及系譜管理技術(shù)是避免其近交衰退的關(guān)鍵技術(shù)。傳統(tǒng)家系選育工作存在繁瑣及環(huán)境差異等問(wèn)題，傳統(tǒng)標(biāo)記手段也存在幼體標(biāo)記困難及造成應(yīng)激、損傷、脫落等問(wèn)題。開發(fā)高效親子鑒定技術(shù)可為黃鱔良種選育和種質(zhì)資源保護(hù)及利用提供技術(shù)支持。親子鑒定又稱親權(quán)鑒定，可以通過(guò)遺傳特征相互驗(yàn)證親本和子代之間是否存在親緣關(guān)系。在育種生產(chǎn)中開展親子鑒定可有效避免近交導(dǎo)致的種質(zhì)退化問(wèn)題。微衛(wèi)星序列 (Simple sequence repeats,SSR) 具有高度的多態(tài)性、穩(wěn)定性、呈共顯性遺傳、數(shù)量豐富且遵循孟德爾遺傳定律的優(yōu)點(diǎn)，在水生動(dòng)物親子鑒定中應(yīng)用廣泛。文萍等[10]使用2 組微衛(wèi)星多重PCR 體系對(duì)黃喉擬水龜 (Mauremysmutica) 進(jìn)行親子鑒定，在父本信息未知時(shí)，母本的鑒定準(zhǔn)確率為87%；苗貴東等[11]通過(guò)2 組微衛(wèi)星多重PCR 體系對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus) 7 個(gè)家系開展了親子鑒定，準(zhǔn)確率達(dá)到98.26%；謝敏敏等[12]通過(guò)建立2 組微衛(wèi)星多重PCR 體系，對(duì)黿 (Pelochelyscantorii)家系進(jìn)行親子鑒定分析，得到10 個(gè)位點(diǎn)的雙親排除率為98%；Dong 等[13]為了評(píng)估中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis) 養(yǎng)殖群體親緣鑒定的可行性，使用5 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，獲得了92.9%的鑒定成功率；辛苗苗等[14]使用7 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)多倍體中華鱘 (Acipensersinensis) 進(jìn)行親子鑒定分析，得到雙親累計(jì)排除率為99.99%；Yang 等[15]利用10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)鱖 (Sinipercachuatsi) 5 個(gè)全同胞家系進(jìn)行了親子鑒定，得到的實(shí)際鑒定率為95%，且隨機(jī)選擇了69 個(gè)后代進(jìn)行雙盲試驗(yàn)，結(jié)果表明95% 的子代可以正確聚類；Zhu 等[16]篩選出了14 個(gè)用于評(píng)價(jià)斑節(jié)對(duì)蝦 (Penaeusmonodon) 親子關(guān)系的微衛(wèi)星標(biāo)記，并用其中多態(tài)性最高的6 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記獲得了99%的鑒定準(zhǔn)確率。

目前，黃鱔已開發(fā)出較多的微衛(wèi)星標(biāo)記，如劉臻等[17]通過(guò)富集文庫(kù)法開發(fā)了20 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，設(shè)計(jì)了8 對(duì)4 堿基重復(fù)高度多態(tài)性的微衛(wèi)星引物，分析了3 種不同性別表型黃鱔群體的遺傳多樣性；Li 等[18]使用富集文庫(kù)法分離了16 對(duì)微衛(wèi)星引物，分析了兩個(gè)黃鱔自然群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)；Zhang 等[19]通過(guò)RAD (Restriction-site associated DNA tags，簡(jiǎn)化基因組) 測(cè)序在基因組中鑒定出了9 897 個(gè)微衛(wèi)星，并篩選出28 對(duì)多態(tài)性引物。但上述研究開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記僅用于遺傳多樣性分析，目前尚未見利用微衛(wèi)星多重PCR 體系對(duì)黃鱔進(jìn)行親子鑒定的相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用筆者課題組前期發(fā)表的高度多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記[20]和基于黃鱔基因組數(shù)據(jù)開發(fā)的新的微衛(wèi)星標(biāo)記[21]，結(jié)合繁育的黃鱔全同胞家系，建立了基于微衛(wèi)星多重PCR 的親子鑒定技術(shù)，為后續(xù)黃鱔育種以及種質(zhì)資源保護(hù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃鱔樣本取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣基地。雌、雄親本按照1∶1 比例得到11 個(gè)全同胞家系，雌、雄親本完成繁殖后取背部肌肉于-80 ℃保存，每個(gè)家系在孵化出膜至30 日齡隨機(jī)選取10 尾于-80 ℃保存。隨機(jī)挑選4 個(gè)黃鱔家系子代各10 尾和隨機(jī)候選親本4 尾，同樣-80 ℃保存。

1.2 基因組DNA 的提取

基因組DNA 采用苯酚-氯仿法[22]提取，用1%(w) 瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度及完整性。將合格的DNA 用雙蒸水 (ddH2O) 稀釋至100 ng·μL-1，于-20 ℃保存。

1.3 多態(tài)性微衛(wèi)星引物的篩選

黃鱔全基因組數(shù)據(jù)來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院國(guó)家基因研究中心數(shù)據(jù)庫(kù) (CRA003062)。使用MISA 對(duì)黃鱔全基因組序列中的完美型SSR 進(jìn)行檢索[23]，檢索標(biāo)準(zhǔn)與課題組前期篩選微衛(wèi)星的標(biāo)準(zhǔn)一致。挑取了148 個(gè)SSR 位點(diǎn)，同時(shí)提取SSR 位點(diǎn)前后200 bp的序列，使用Primer premier 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物。隨機(jī)選取6 尾黃鱔的混合DNA 為模板，進(jìn)行微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增效果及初步的多態(tài)性驗(yàn)證，共獲得35 對(duì)擴(kuò)增效果理想的引物。另挑選課題組前期發(fā)表的具有高度多態(tài)性的15 對(duì)微衛(wèi)星引物，共50 對(duì)微衛(wèi)星引物，以參與繁殖的22 尾黃鱔親本DNA為模板進(jìn)行篩選，選擇擴(kuò)增等位基因數(shù)較多、出峰質(zhì)量較好的位點(diǎn)。

1.4 多重PCR 體系的構(gòu)建及優(yōu)化

對(duì)篩選獲得的16 對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行熒光修飾(FAM、HEX、ROX、TAMRA) ，由武漢天一輝遠(yuǎn)科技有限公司合成，以親本DNA 為模板進(jìn)行多重PCR 構(gòu)建。構(gòu)建過(guò)程中避免產(chǎn)生引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和錯(cuò)配等現(xiàn)象，優(yōu)化模板DNA 濃度、退火溫度、延伸時(shí)間等反應(yīng)條件。根據(jù)片段大小將引物分為兩組，兩組引物等比混合開展預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)出峰結(jié)果調(diào)整引物濃度，最終確定最佳的多重PCR 體系。

PCR 反應(yīng)體系10 μL，包含2×PCR Mix 5 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各0.5 μL，基因組DNA 1 μL 以及滅菌超純水3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62～53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共10 個(gè)循環(huán)，其中退火溫度每次循環(huán)下降1 ℃；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸20 min。使用1% (w) 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性，然后由ABI3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè) (由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成)，使用GeneMarker[24]讀取各位點(diǎn)等位基因大小。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

將整理的親本與子代基因型結(jié)果導(dǎo)入Cervus 3.0[25]進(jìn)行等位基因頻率分析、模擬分析和親子鑒定分析。模擬分析設(shè)置模擬子代數(shù)為10 000 個(gè)，候選親本數(shù)為父母本各11 對(duì)，對(duì)100%的候選親本進(jìn)行抽樣模擬分析，允許1%的分型錯(cuò)誤，置信度為95%。在性別已知和未知的情況下，基于16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)模擬分析不同候選親本數(shù)情況下的鑒定率，設(shè)置模擬子代數(shù)目為10 000 個(gè)，候選親本數(shù)分別為20、50、100、150 和200 對(duì)，抽樣比例為100%，允許1% 的分型錯(cuò)誤，置信度為95%。根據(jù)多態(tài)信息含量大小將16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)排序，分析微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)與鑒定率之間的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)所有子代樣本在某一位點(diǎn)出現(xiàn)的所有基因型，單個(gè)樣本在該位點(diǎn)存在對(duì)應(yīng)基因型則記為1，否則記為0，構(gòu)建基因型0/1 矩陣，并根據(jù)該矩陣?yán)肗TSYS軟件[26]對(duì)110 尾家系子代進(jìn)行聚類分析。利用NTSYS 軟件對(duì)4 個(gè)家系共40 尾子代進(jìn)行聚類分析，驗(yàn)證微衛(wèi)星多重PCR 體系的準(zhǔn)確率。

其中單個(gè)位點(diǎn)的非親排除率 (NEP) 由Cervus 3.0 軟件計(jì)算得到，累積非親排除率 (CEP) 計(jì)算公式如下：

式中：RCEP為累積非親排除率；RNEP,i為第i個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的NEP 值；n為微衛(wèi)星位點(diǎn)排除概率的數(shù)目。CE-1P 對(duì)應(yīng)用NE-1P 計(jì)算，CE-2P 對(duì)應(yīng)用NE-2P 計(jì)算，CE-PP 對(duì)應(yīng)用NE-PP 計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星的篩選與多重PCR 建立

從黃鱔基因組預(yù)測(cè)的148 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，篩選獲得了擴(kuò)增效果較好的微衛(wèi)星引物35 對(duì)。進(jìn)而以30 尾親本為模板，從50 對(duì)微衛(wèi)星引物中篩選得到16 對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增效果好的微衛(wèi)星引物。

將篩選的16 對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行不同組合并優(yōu)化反應(yīng)程序、調(diào)整引物濃度比例，最終確定2 組多重PCR (表1)。2 組多重PCR 的擴(kuò)增效率都較好，分型結(jié)果符合預(yù)期。A 組多重PCR 體系各位點(diǎn)如見圖1。

圖1 A 組多重 PCR 的等位基因Fig.1 Alleles of multiplex PCR of Group A

表1 黃鱔 2 組微衛(wèi)星多重PCR 的引物信息Table 1 Primer information of two multiplex PCR sets of microsatellites in M.albus

2.2 親子鑒定分析

16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在黃鱔22 尾親本和110 尾子代中的遺傳參數(shù)如表2 所示。等位基因數(shù) (Na) 為3～9，平均等位基因數(shù)為5.562；觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.421～0.771 和0.382～0.797，平均觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.627 和0.619；多態(tài)信息含量 (PIC) 為0.347～0.766，平均多態(tài)信息含量為0.564，其中Ma71、Ma78、Mta021、Mta027和Mta033 表現(xiàn)為中度多態(tài)性，其余11 個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為高度多態(tài)性。16 個(gè)位點(diǎn)均未偏離Hardy-Weinberg 平衡。

表2 16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Table 2 Genetic parameters of 16 SSR loci

將16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)根據(jù)多態(tài)信息含量由大到小排序探究微衛(wèi)星數(shù)量與鑒定率之間的關(guān)系。結(jié)果如圖2 所示，隨著微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)的增加，親子鑒定的模擬鑒定率和實(shí)際鑒定率逐漸上升。當(dāng)位點(diǎn)數(shù)為8 時(shí)，親子鑒定的模擬鑒定率和實(shí)際鑒定率均達(dá)到95%。當(dāng)位點(diǎn)數(shù)繼續(xù)增加，模擬鑒定率無(wú)限接近100%，實(shí)際鑒定率則保持在95%左右。實(shí)際親子鑒定結(jié)果顯示，110 尾子代中僅有6 尾子代的三聯(lián)LOD≤0，無(wú)法準(zhǔn)確匹配到真實(shí)的父母本，運(yùn)用16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的實(shí)際鑒定成功率為95%。

圖2 微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)與鑒定率Fig.2 Number and identification rate of SSR loci

利用構(gòu)建的2 組多重PCR 體系計(jì)算黃鱔11 個(gè)家系單個(gè)位點(diǎn)的排除概率和累計(jì)排除概率，結(jié)果見表2。NE-1P、NE-2P、NE-PP 分別為0.570～0.928、0.393～0.803、0.143～0.675，CE-1P、CE-2P、CE-PP 分別為0.999 999 99、0.999 999 91、0.999 964 76，模擬親本已知的情況準(zhǔn)確率為99.96%，置信度為95%。說(shuō)明在理想情況下，使用這16 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行黃鱔的親子鑒定可以在置信度95%的情況下達(dá)到99.96%的準(zhǔn)確率。

此外，分別開展了在候選親本性別已知和未知的情況下進(jìn)行不同候選親本數(shù) (20、50、100、150、200 對(duì)) 的模擬分析。結(jié)果如圖3 所示，當(dāng)候選親本數(shù)為20 對(duì)，在候選親本性別已知或未知的情況下，父本、母本和父母本聯(lián)合都能夠得到99%以上的鑒定率。當(dāng)候選親本數(shù)為50 對(duì)時(shí)，無(wú)論父母本性別是否已知，父母本聯(lián)合的鑒定率也都在95%左右，單親本的鑒定率也在93%左右。當(dāng)候選親本數(shù)為100 對(duì)時(shí)，無(wú)論父母本性別是否已知，父母本聯(lián)合的鑒定率保持在95%以上，但單親本的鑒定率下降到了90%以下。當(dāng)候選親本數(shù)為150 對(duì)時(shí)，在候選親本性別已知和未知的情況下，父母本聯(lián)合仍然能夠得到95% 以上的鑒定率。當(dāng)候選親本數(shù)繼續(xù)增加至200 對(duì)時(shí)，鑒定率在父母本聯(lián)合且性別已知的情況下依然有較高的鑒定率 (94.88%)，而在性別未知的情況下，鑒定率明顯下降 (89.56%)。單親本的鑒定率在親本數(shù)為200 對(duì)時(shí)下降至80%左右。

圖3 黃鱔16 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記基于不同親本數(shù)的模擬分析Fig.3 Simulation analysis of 16 pairs microsatellite markers of M.albus based on different candidate parent

2.3 家系聚類分析

NTSYS 聚類分析的結(jié)果如圖4 所示，結(jié)果表明11 個(gè)家系的子代僅有2 尾無(wú)法正確聚類，分別為個(gè)體1-07 和101-07，其余子代個(gè)體均可以正確聚類，鑒定準(zhǔn)確率為98.18%。

圖4 110 個(gè)黃鱔家系聚類分析圖注：右側(cè)數(shù)字代表家系，其中1-07 和101-07 為聚類錯(cuò)誤的子代編號(hào)。Fig.4 Cluster analysis diagram of 110 families of M.albusNote: The numbers on the right represent families,and 1-07 and 101-07 are clustered incorrectly.

2.4 群體遺傳多樣性分析

利用兩組多重PCR 體系對(duì)黃鱔11 個(gè)子代家系群體和全部候選親本群體獨(dú)立進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表3。11 個(gè)子代家系群體的平均等位基因數(shù)為0.489，平均觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.632 和0.489，平均多態(tài)信息含量為0.394。比較候選親本群體和11 個(gè)子代家系群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)候選親本群體的平均等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度和多態(tài)信息含量均要高于11 個(gè)子代家系群體。

表3 黃鱔子代和親本群體的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversities of offsprings and parents of M.albus

2.5 親子鑒定的應(yīng)用

利用另外4 個(gè)家系的子代和候選親本44 尾個(gè)體進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖5，表明僅有個(gè)體10-04 和23-08 無(wú)法正確聚類，子代聚類準(zhǔn)確率為95%，并且所有4 個(gè)候選親本均能正確聚類，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的微衛(wèi)星多重PCR 體系可以用于黃鱔家系的親子鑒定。

圖5 親子鑒定應(yīng)用聚類分析注：“-”前的數(shù)字代表家系、后面的數(shù)字代表子代標(biāo)號(hào)，M 代表家系對(duì)應(yīng)的母本，F(xiàn) 代表家系對(duì)應(yīng)的父本，其中10-04 為聚類錯(cuò)誤的子代編號(hào)。Fig.5 Cluster analysis of parentage test applicationNote: The number before "-" represents the family; the number after "-" represents the offspring label; M represents the female parent corresponding to the family; F represents the male parent corresponding to the family,and 10-04 was clustered incorrectly.

3 討論

3.1 微衛(wèi)星多重PCR 體系

自20 世紀(jì)80 年代Chamberlain 等[27]成功建立多重PCR (Multiplex polymerase chain reaction,MPCR) 體系以來(lái)，以其高效、敏感、大幅降低成本、提高檢測(cè)效率的優(yōu)勢(shì)，在基因分型、遺傳分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[28-31]。建立多重PCR 反應(yīng)體系，需要保證同種熒光標(biāo)記引物的擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)重疊，以避免基因型誤讀，從而實(shí)現(xiàn)多重優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)篩選獲得16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均He、平均Ho和平均PIC 分別為0.627、0.619 和0.564。根據(jù)Botstein 的標(biāo)準(zhǔn)[32]，11 個(gè)位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)，5 個(gè)位點(diǎn)為中度多態(tài)性位點(diǎn)，這一結(jié)果與在蘭州鲇(Siluruslanzhouensis)[33]和圓口銅魚 (Coreius guichenoti)[34]中用于親子鑒定的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性水平相近，表明這16 個(gè)位點(diǎn)具有豐富的遺傳多樣性，能夠用于后續(xù)的親子鑒定。張毅等[35]提出影響多重PCR 的關(guān)鍵因素是體系中引物之間是否兼容以及引物濃度的比例。本實(shí)驗(yàn)將16 對(duì)微衛(wèi)星引物依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小及初步實(shí)驗(yàn)，在退火溫度確定的情況下根據(jù)電泳結(jié)果不斷地調(diào)整引物濃度的比例來(lái)保證每對(duì)引物的擴(kuò)增效果，最終構(gòu)建了2 組多重PCR 體系，包括A 組的十二重PCR 體系和B 組的四重PCR 體系。其中本實(shí)驗(yàn)A 組十二重PCR 體系經(jīng)過(guò)不斷調(diào)整最終確定了各引物濃度的比例，而B 組四重PCR 體系僅實(shí)驗(yàn)一次就獲得了良好的擴(kuò)增效果，說(shuō)明當(dāng)多重PCR 體系中引物數(shù)量多的時(shí)候，引物濃度的比例尤為重要。

3.2 微衛(wèi)星標(biāo)記在黃鱔親子鑒定中的應(yīng)用

近年來(lái)，微衛(wèi)星親子鑒定被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源保護(hù)、新品種選育及種群遺傳管理等方面，尤其在品種選育工作中能避免近親交配并指導(dǎo)生產(chǎn)[36-38]。在微衛(wèi)星親子鑒定中，主要根據(jù)累計(jì)排除概率(CE-PP) 判定。趙桐茂[39]研究表明，如果CE-PP<80%，則不能確定存在親子關(guān)系；如果95%

在親子鑒定中出現(xiàn)實(shí)際鑒定率低于模擬鑒定率的情形，原因可能是基因型誤讀及無(wú)效等位基因的存在[42]。根據(jù)O'reilly 等[43]的研究，在基因分型過(guò)程中存在2%～3%的分型錯(cuò)誤；此外，二、三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記在讀取基因型大小時(shí)可能會(huì)因?yàn)閴A基重復(fù)單元較短而出現(xiàn)基因型的誤讀，使得基因分型的結(jié)果存在一定誤差。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)際鑒定率(95%) 略低于模擬鑒定率 (99.96%) ，篩選的16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有且僅有一個(gè)位點(diǎn) (Ma85) 的無(wú)效等位基因頻率大于10%，這可能是造成實(shí)際鑒定率略低的原因。

3.3 群體的遺傳多樣性分析

群體的遺傳多樣性主要通過(guò)有效等位基因數(shù)、雜合度 (Ho/He) 和多態(tài)信息含量表示，遺傳參數(shù)越高，多態(tài)性越高，說(shuō)明群體的遺傳多樣性越高。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)位點(diǎn)的PIC 與NE-PP 大致呈反比關(guān)系，與韓葉等[44]對(duì)大麻哈魚 (Oncorhynchus keta) 的研究結(jié)果一致。比較各子代家系與親本群體之間的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)親本群體的平均期望雜合度和平均PIC 均高于子代各群體，說(shuō)明親本群體的遺傳多樣性高于各子代家系群體的遺傳多樣性，在各子代家系群體中，子代家系81 的雜合度最高，子代家系101 和子代家系77 次之。比較各子代家系群體之間的多態(tài)信息含量，發(fā)現(xiàn)子代家系101 的多態(tài)信息含量最高，子代家系81 和41 次之。綜合雜合度和多態(tài)信息含量的比較，得出子代家系81 和101 具有較高的遺傳多樣性，說(shuō)明其具有較高的育種潛力，可以作為家系選育的基礎(chǔ)群體。11 個(gè)子代家系群體觀測(cè)雜合度為0.631，期望雜合度為0.618，多態(tài)信息含量為0.562，整體而言雜合度和多態(tài)信息含量均低于我國(guó)長(zhǎng)江中下游湖北、安徽、江蘇、浙江4 省的野生黃鱔群體[45-46]和江西1個(gè)野生黃鱔群體，但高于天津3個(gè)野生黃鱔群體[47]，說(shuō)明選育家系子代群體的遺傳多樣性相比野生群體有所下降。

4 結(jié)論

本研究篩選得到了16 個(gè)高度多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，建立了2 組可用于黃鱔親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR 體系，在黃鱔110 尾子代及22 尾親本中達(dá)到了95%的鑒定率，研究結(jié)果有助于黃鱔的家系選育與管理，并可為其種質(zhì)資源保護(hù)和良種選育提供理論依據(jù)和技術(shù)手段。