吳曉鵬，黃敏偉，陳曉瑛，彭 凱，趙吉臣，鐘 平，劉鳳坤，張業(yè)輝，黃 文

1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088

2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640

3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510640

4.暨南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510632

5.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510640

玉足海參 (Holothurialeucoisplota) 隸屬于楯手目、海參科、海參屬[1]，是一種具有較高經(jīng)濟價值的熱帶海參。在我國主要分布于海南、廣東等南部沿海海域的巖礁、珊瑚礁、泥沙質(zhì)淺海。其體形呈圓筒狀，后部比前端粗大，成參可以長到20 cm 以上，口偏于腹面，居維氏器很發(fā)達，腹面散生有大量呈乳狀突起的管足且排列不規(guī)則[2]。玉足海參具有環(huán)境適應(yīng)能力強、耐應(yīng)激的特點[3]，在維持近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定中扮演了關(guān)鍵角色，是進行放流移植及島礁生態(tài)環(huán)境修復(fù)工程的理想種類[3-4]。此外，海參自古以來便被視為滋補珍品，在東亞地區(qū)被廣泛食用以及用作制藥原料[5-6]。國內(nèi)外學(xué)者對海參進行營養(yǎng)組成測定和營養(yǎng)評價，發(fā)現(xiàn)其富含膠原蛋白、多糖、皂苷、維生素、多肽、腦苷酸等多種活性物質(zhì)。此外，對這些活性因子的研究也在逐步深入，目前已經(jīng)證實其具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗病毒和提高機體免疫力等多種生理功效[7-9]。

隨著人們對海參營養(yǎng)價值認知的提高，對其需求也日益增大，導(dǎo)致熱帶海參的過度捕撈，使其自然資源急劇減少[10]。目前，全球超過一半的海參資源被過度開發(fā)，約30%的海參漁業(yè)已經(jīng)崩潰[11]。市場需求的劇增以及資源的枯竭使得熱帶海參人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的研發(fā)顯得尤為迫切[12]。目前，已有幾種熱帶海參成功實現(xiàn)了人工繁殖[3,13-16]，但這些人工繁育技術(shù)尚處于探索階段，其繁育規(guī)模小、幼苗數(shù)量少，與應(yīng)用于人工養(yǎng)殖及增殖放流仍有一定距離。玉足海參的繁育和養(yǎng)殖研究尚處于起步階段，目前可實現(xiàn)人工催產(chǎn)和孵化[3-4,17]。玉足海參幼蟲在耳狀幼體期間體積逐漸膨大，而在受精約15 d 后 (水溫為29～33 ℃)，體積開始明顯縮小形成樽形幼體，生活狀態(tài)也由浮游變?yōu)榈讞玔4]。而這一變態(tài)過程的高死亡率是熱帶海參繁育過程中的共性問題，其背后的機制至今不明。本研究基于全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)[18-20]，使用Illumina 測序平臺對4 個不同發(fā)育時期的海參幼體 (小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體和樽形幼體) 進行了高通量測序分析。通過研究其幼體不同時期的基因表達差異，探究與海參生長發(fā)育相關(guān)的重要信號通路并發(fā)掘關(guān)聯(lián)基因，旨在提高對該物種生長發(fā)育機制的認識，為其育苗和養(yǎng)殖提供分子層面的育種研究借鑒，并為熱帶海參增養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展及科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗海參捕撈于深圳大鵬灣海域，并于廣東省茂名市電白區(qū)金陽生物技術(shù)有限公司養(yǎng)殖基地暫養(yǎng)。玉足海參親本的性腺成熟時期一般在6—8 月，此時是其最佳的繁育時期。因此，本實驗在2022 年7 月進行海參親本的采集、人工繁育及不同發(fā)育時期幼體樣品的收集。首先從池中撈出親本進行陰干處理，然后放入桶中待產(chǎn)卵排精。收集精子和卵子，經(jīng)濕法受精后轉(zhuǎn)入孵化池進行孵化。其后對其幼體發(fā)育過程進行監(jiān)測，并分別收集小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體和樽形幼體4 個生長發(fā)育時期的個體 (圖1) ，其中每個時期采集3 份樣品，每份樣品包含3 個同一時期的個體。將收集的樣品立即放入液氮罐中冷凍，運至實驗室于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 玉足海參幼體 4 個發(fā)育時期的形態(tài)注: a.小耳幼體 (A 期)； b.中耳幼體 (B 期)；c.大耳幼體 (C 期)；d.樽形幼體 (D 期)。Fig.1 Morphology of H.leucospilota larva at four developmental stagesNote: a.Early auricularia (Stage A); b.Mid auricularia (Stage B); c.Late auricularia (Stage C); d.Doliolaria (Stage D).

1.2 RNA 提取與轉(zhuǎn)錄組測序

按常規(guī)Trizol 法提取玉足海參幼體樣品的總RNA，并標記如下：小耳幼體 (A 期)、中耳狀幼體(B 期)、大耳狀幼體 (C 期)、樽形幼體 (D 期)，每個時期的3 個重復(fù)樣品用1、2 和3 區(qū)別?？俁NA 的質(zhì)量濃度大于100 ng·μL-1，OD260與OD280比值介于 1.8～2.2，OD260與OD230比值大于 2.0，確保實驗室中所提取的RNA 無污染、無降解。將提取的RNA 樣品送至上海美吉生物有限公司，經(jīng)文庫構(gòu)建后采用Illumina HiSeqTM 6000 高通量測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組從頭組裝

測序所獲得的初始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling 處理轉(zhuǎn)成序列數(shù)據(jù)，使用fastp 軟件去掉reads 中的接頭序列和低質(zhì)量的序列，從而得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)(Clean reads)。使用Trinity 軟件在默認程序設(shè)置下對測序數(shù)據(jù)進行組裝，首先將reads 拼接成長的片段contigs，然后去除掉冗余contigs，將contigs 進行分組，連接成兩端不能再延長的轉(zhuǎn)錄片段(Unigenes)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)分析

將該次轉(zhuǎn)錄組測序獲得的所有轉(zhuǎn)錄本與6 大數(shù)據(jù)庫分別進行比對注釋分析。著重對GO 和KEGG 進行分析。GO 注釋包含3 個大分支，即細胞組分 (Cellular component,CC)、生物過程 ((Biological process,BP) 和分子功能 (Molecular function,MF)；所有已知基因序列都會被注釋到其中，隨著分支的展開，基因所具有的功能也越來越詳細的注釋出來。KEGG 通路可分為細胞過程、藥物開發(fā)、代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、生物體系統(tǒng)和人類疾病7 大類別。隨著各類別的展開，對類別所包含的注釋基因描述就越清晰。采用FPKM 方法來測量基因的表達量水平。在比較不同時期的樣本后，使用DEGseq2 軟件包篩選一定條件下的差異表達基因，所設(shè)定的閾值為 |log2(FoldChange)|>1。按照通用默認值設(shè)定Padjust<0.05，則該基因為顯著差異表達基因。采用 Goatools 軟件對差異表達的基因進行GO 功能富集分析，當(dāng)經(jīng)過校正的Padjust<0.05 時，則認為此GO 功能類別存在顯著富集情況。KEGG 通路富集分析計算原理同GO 功能富集分析一致，即經(jīng)過校正的Padjust<0.05 時，則認為此KEGG 通路存在顯著富集情況。

1.5 實時熒光定量PCR

隨機選擇6 個在玉足海參發(fā)育過程中表達量顯著變化的基因進行實時定量PCR 檢測，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性進行驗證。用Trizol 試劑提取玉足海參幼體總RNA (上海百賽生物技術(shù)有限公司)，使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司) 合成cDNA 第一鏈。按照 TB Green?Premix Ex Taq? II(上海百賽生物技術(shù)股份有限公司)說明書進行實時定量 PCR，并使用 SPSS 24.0 軟件 進行獨立樣本t檢驗，P<0.05 為顯著性差異，熒光定量檢測數(shù)據(jù)結(jié)果使用2—ΔΔCt方法計算分析。以β-Actin作為內(nèi)參基因，所用引物見表1，所設(shè)計引物的擴增效率和特異性使用cDNA 樣品的標準曲線確定和依據(jù)熔解曲線分析確定。玉足海參的12 個樣品均進行檢測，每個樣品技術(shù)重復(fù)3 次。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與組裝結(jié)果

采集4 個不同發(fā)育時期的海參幼體樣品進行全長轉(zhuǎn)錄組測序分析。通過高通量測序后獲得了87.38 Gb Raw data。在經(jīng)過原始數(shù)據(jù)過濾處理后，每個樣品的清潔讀數(shù)從42 974 554 到59 419 634 不等，有效讀數(shù)比率為98.9%。詳細統(tǒng)計結(jié)果見表2，包括原始堿基、有效堿基、Q20、Q30、GC 含量等。隨后通過Trinity 軟件進行denovo 組裝，共得到93 528 個Unigenes。

表2 轉(zhuǎn)錄本組裝結(jié)果統(tǒng)計分析Table 2 Statistics analysis of transcript assembly results

2.2 轉(zhuǎn)錄組注釋

將獲得的Unigenes 分別與GO、KEGG、COG、NR、Pfam、Swissprot 數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得玉足海參幼體Unigenes 在各個數(shù)據(jù)庫的注釋信息。結(jié)果有48 087 個Unigenes 得到注釋，占整個組裝轉(zhuǎn)錄本的51.41%，GO、KEGG、COG、NR、Pfam 和Swissprot 數(shù)據(jù)庫中的同源序列注釋條數(shù)分別為36 422 (38.94%)、31 013 (33.16%)、36 608(39.14%)、47 228 (50.49%)、35 775 (38.25%)和35 567 (38.04%)。NR 物種注釋表明(圖2)，玉足海參與仿刺參 (Apostichopusjaponicus) 同源性最高(73%)，其次是綠海膽 (Lytechinusvariegatus)、紫色球海膽 (Strongylocentrotuspurpuratus)、長棘海星(Acanthasterplanci)和蝠海星(Patiriaminiata)。GO 功能注釋顯示基因功能聚類排名前三位的分別是細胞組分類別的細胞部分、分子功能類別的組合和催化活性 (圖3)。KEGG 通路注釋顯示功能基因參與排名前三位的生物學(xué)通路分別是環(huán)境信息處理類別的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、人類疾病類別的癌癥概述和神經(jīng)退行性疾病(圖4)。

圖2 NR 數(shù)據(jù)庫比對統(tǒng)計圖Fig.2 Comparison chart of NR database

圖3 Unigene GO 功能注釋結(jié)果Fig.3 GO annotation results of unigene

圖4 Unigene KEGG 功能注釋結(jié)果Fig.4 KEGG annotation results of unigene

2.3 差異表達轉(zhuǎn)錄組分析

為探究玉足海參幼體變態(tài)發(fā)育過程中的基因表達變化情況，本實驗對海參的4 個不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組測序文庫進行了比較分析，共檢測到43 720個差異表達基因，其中A 期與B、C、D 期比較，表達量差異顯著的基因數(shù)目分別為17 732 個 (上調(diào)9 863 個，下調(diào) 7 869 個)、17 189 個 (上調(diào)10 025個，下調(diào) 7 164 個)、24 081 個 (上調(diào)13 700 個，下調(diào)10 381 個)；B 期與C、D 期比較，表達量差異顯著的基因數(shù)目分別為11 757 個 (上調(diào) 6 229 個，下調(diào) 5 528 個)、20 990 個 (上調(diào)10 877 個，下調(diào)10 113個)； C 期與D 期比較，表達量差異顯著的基因數(shù)目為11 319 個 (上調(diào)6 727 個，下調(diào)4 592 個)。A期與D 期差異基因數(shù)最懸殊，表明玉足海參發(fā)育至樽形幼體后，基因表達數(shù)量發(fā)生顯著變化，使機體得以適應(yīng)變態(tài)發(fā)育過程。相鄰組間 (A_vs_B,B_vs_C,C_vs_D) 上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)量雖然基本均呈下降趨勢 (圖5)，但上調(diào)基因遠多于下調(diào)基因，說明在變態(tài)發(fā)育過程中，更多的基因被釋放表達。同時也表明一些基因只在特定時期的表達發(fā)生顯著變化，這可能與特定的生長發(fā)育表達調(diào)控相關(guān)。

圖5 相鄰組間差異表達基因火山圖注：A_vs_B.B 期以A 期為參照基準比較；B_vs_C.C 期以B 期為參照基準比較；C_vs_D.D 期以C 期為參照基準比較。后圖同此。Fig.5 Volcano map of differentially expressed genes between adjacent groupsNote: A_vs_B.Stage B was compared with Stage A; B_vs_C.Stage C was compared with Stage B; C_vs_D.Stage D was compared with Stage C.The same case in following figures.

2.4 GO 和KEGG 富集分析

為探究玉足海參響應(yīng)變態(tài)發(fā)育的分子機制，對差異表達的基因進行GO 功能富集和KEGG 通路分析。相鄰組間 (A_vs_B,B_vs_C,C_vs_D) 差異基因分別富集于579、371、441 個GO 功能類別。其中，富集頻率排名靠前的主要是分子功能、細胞成分、催化活性等與細胞成長相關(guān)的生物學(xué)功能。KEGG 通路富集分析顯示A_vs_B、B_vs_C 和C_vs_D 的差異基因分別涉及342、340 和339 個通路，而且絕大部分被富集的信號通路與生長發(fā)育密切相關(guān)，包括細胞增殖分化相關(guān)通路 (細胞周期、基因復(fù)制等)、細胞凋亡通路 (癌癥途徑、Wnt等)、糖類代謝及脂類相關(guān)通路等 (圖6)。說明玉足海參變態(tài)發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，受到多個基因的調(diào)控。

圖6 相鄰組間差異表達基因 KEGG 通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes between adjacent groups

2.5 與生長相關(guān)的基因分析

隨著玉足海參幼體的生長發(fā)育，其體型大小在變態(tài)附著階段會發(fā)生轉(zhuǎn)折。首先在耳狀幼體時期幼體體積會不斷膨大成樹突狀幼蟲 (圖1-c)，而后在樽形幼體時期幼體體積逐漸收縮成橢圓狀幼蟲(圖1-d)。對相鄰組間差異基因分析的結(jié)果顯示，與生長性狀調(diào)控相關(guān)的基因在特定發(fā)育時期顯著差異表達。如隨著幼體體積的變化，cox1和tll1基因表達量在A 至C 期逐漸上調(diào)，然后在D 期顯著下調(diào)。ctsl2基因在B 期顯著上調(diào)而在D 期顯著下調(diào)，c-lectin2基因僅在D 期顯著上調(diào)，survivin基因只在D 期顯著下調(diào)。這說明機體依據(jù)變態(tài)階段不同生長發(fā)育時期的反饋任務(wù)去執(zhí)行相應(yīng)的表達程序，控制有效調(diào)節(jié)因子去執(zhí)行細胞增殖、分化和凋亡功能，使其能夠正常渡過變態(tài)附著階段[21-22]。

2.6 實時熒光定量PCR 分析

隨機挑選6 個差異表達顯著的基因，對目標轉(zhuǎn)錄本進行定量分析以驗證玉足海參轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果數(shù)據(jù)和分析的準確性。結(jié)果如圖7 所示，實時熒光定量PCR 分析得到的表達趨勢與Illumina 測序得到的表達趨勢相似，但幾個基因的表達差異幅度存在一定差異。這可能是兩種方法的靈敏度不同所致。據(jù)報道，RNA-Seq 對目的評估基因更為敏感，說明使用測序分析所驗證的差異表達轉(zhuǎn)錄本較為可靠[23]。

圖7 qRT-PCR 驗證 RNA-seq 結(jié)果Fig.7 RNA-Seq results verified by qRT-PCR

3 討論

3.1 注釋信息分析

玉足海參幼蟲發(fā)育需經(jīng)歷浮游生活到附著生活的轉(zhuǎn)變，這個過程受到環(huán)境和遺傳因素的共同影響[24-25]。本研究對組裝得到的Unigenes 進行生物學(xué)功能注釋，共檢測到 43 720 個差異表達基因。通過NR 物種相似度功能注釋分析，有三分之一的Unigenes 與庫中已知基因同源，相似度排名靠前的均為海洋無脊椎動物，玉足海參與這些物種具有較高的親緣性，尤其是以仿刺參、海星等為代表的棘皮動物相似度最高；它們的許多基因是由共同祖先基因分化演變而成。本實驗所獲得的NR 序列比對呈現(xiàn)出注釋率數(shù)值較小，這可能是由于國際公共數(shù)據(jù)庫收錄的相近物種基因信息較為匱乏，并且也受到實驗條件和測序水平等因素的限制。另外有一小部分序列未注釋匹配成功，可能原因是這些序列與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的基因序列匹配度較低，可能為無翻譯能力的RNA 或者無表達功能的結(jié)構(gòu)域序列[26]；它們有可能參與重要的生命活動，并且在生物體內(nèi)發(fā)育功能和過程中起重要作用。對3 個相鄰組間GO 注釋富集分析 (表3)，其中，生物過程最主要的GO 類別聚集是細胞過程、代謝過程，細胞組分最主要的GO 類別聚集是細胞部分、膜部分，分子功能最主要的GO 類別聚集是組合、催化活性。不同比較組間轉(zhuǎn)錄本GO 類別與功能富集多數(shù)與細胞的完整性及其功能相關(guān)，這意味著隨著生長周期的延長，細胞內(nèi)的碳水化合物、脂質(zhì)等活性物質(zhì)含量逐漸積累，細胞數(shù)量和體積也逐漸增長，相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的功能多與細胞周期調(diào)控、細胞組合及催化活性緊密相關(guān)。在大耳到樽形幼體生長模式的轉(zhuǎn)換過程中，細胞黏附類別富集頻率顯著增加，其生物學(xué)功能是通過細胞的識別與黏附使具有相同表面特性的細胞聚集在一起形成組織和器官，這很可能是幼體從浮游期到附著期特定器官生長變化的關(guān)鍵功能。同樣的，對相鄰比較組間轉(zhuǎn)錄本參與的KEGG 注釋通路進行富集分析，發(fā)現(xiàn)其注釋多與神經(jīng)和肌肉發(fā)育代謝過程相關(guān)。這說明在變態(tài)附著發(fā)育期間，很多控制神經(jīng)、肌肉和皮膚等組織表達通路里的轉(zhuǎn)錄因子很可能是影響生物體正常發(fā)育的關(guān)鍵因素，如肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、ECM-受體相互作用、鈣等信號通路，這有待更為深入的研究。

表3 相鄰組間差異表達基因 GO 富集分析 (前 5)Table 3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes between adjacent groups (Top five)

3.2 變態(tài)附著階段差異基因分析

玉足海參在浮游幼體期主要是以海洋藻類等浮游有機質(zhì)為食，大耳幼體后期變態(tài)為樽形幼體附著后轉(zhuǎn)而以淺層沉積物質(zhì)為主要攝食對象。因此，這兩種截然不同的生活方式可能涉及到兩套非常不同的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[27]。對4 個時期幼體觀察研究發(fā)現(xiàn)，樽形幼體時期的死亡率達到54%，這在玉足海參變態(tài)發(fā)育以及整個生長過程中為最高[3]。然而，目前針對這一階段的基因調(diào)控基礎(chǔ)仍不清楚，基因?qū)用娴臋C制受控很可能使變態(tài)延遲或變態(tài)失敗，最終導(dǎo)致幼蟲可能因能量消耗過多和環(huán)境變化而死亡[28]。分析4 個時期的差別，A 和D 期之間的差異基因數(shù)目最多 (24 081 個)，而C 和D 期之間的差異基因數(shù)目最少 (11 319 個)。表明有較多的調(diào)控基因參與了幼體發(fā)育過程，多種機制的協(xié)同與拮抗作用反饋影響幼體發(fā)育的相關(guān)基因的激活與抑制。此外，相鄰時期表達的差異基因數(shù)量逐漸減少且放緩。這表明變態(tài)發(fā)育引起的玉足海參體內(nèi)的反應(yīng)從最開始不穩(wěn)態(tài)到過渡新穩(wěn)態(tài)，至樽形幼體時期達到一個新的平衡。分析比較組間基因表達量差異結(jié)果，有高FPKM 值的基因與能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、催化活性、細胞骨架等基本過程相關(guān)。它們在體內(nèi)干細胞正常發(fā)育、組織維持和血管生成中可能發(fā)揮了重要作用。如在B 期顯著上調(diào)和D 期顯著下調(diào)的ctsl2基因，它是一種重要的半胱氨酸蛋白酶，與溶酶體蛋白酶類似，能夠清除細胞中多余的蛋白質(zhì)[29]；研究發(fā)現(xiàn)，ctsl2可以使仿刺參三倍體的生長速度快于二倍體[30]。此外，也有一些基因雖然并無顯著差異的表達，但在變態(tài)附著階段中可能起到至關(guān)重要的作用。如作為執(zhí)行凋亡程序的caspase-3基因，在很多生物體內(nèi)的細胞凋亡過程中起重要作用，在玻璃海鞘 (Cionaintestinalis)幼體變態(tài)發(fā)育的研究中，capsase-3依賴性細胞凋亡是通過磷酸化 ERK 執(zhí)行了尾部的退化過程[31-33]，其在玉足海參D 期的表達水平較高。還有作為負調(diào)節(jié)動物骨骼肌發(fā)育和生長因子的肌肉生長抑制素(myostatin) 基因，能通過抑制成肌細胞增殖和多核肌管分化來調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量[34-36]，其在玉足海參A 和D 期的表達水平較高。因此，差異顯著基因可能在玉足海參變態(tài)附著的過程中，對機體適應(yīng)新的生長模式起非常重要的作用。它們可以作為玉足海參選育潛在的候選基因，推動整個幼體繁育的生物學(xué)過程研究。

3.3 關(guān)鍵發(fā)育信號通路分析

在本次轉(zhuǎn)錄組測序中，KEGG 注釋顯示玉足海參4 個不同發(fā)育時期幼體的功能基因涉及細胞周期、Wnt、PI3K-Akt、磷酸戊糖、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)消化吸收、膽固醇代謝、MAPK 信號通路等8 個與變態(tài)發(fā)育密切相關(guān)的信號通路。如細胞周期信號通路中的cdk、cyclin基因家族網(wǎng)絡(luò)調(diào)控生長發(fā)育在其他水生動物的研究中已有報道，cdk基因通過與cyclin基因結(jié)合形成復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)細胞增殖和分化。對文蛤 (Meretrixmeretrix)的研究發(fā)現(xiàn)，cdk基因在各實驗組的表達情況與其殼長生長正相關(guān)，推測cdk基因在文蛤早期苗種生長中發(fā)揮了重要作用[37]。與胚胎發(fā)育相關(guān)的Wnt 信號通路也有相關(guān)報道，在對半球美螅水母(Clytiahemisphaerica) 研究中，wnt3基因通過影響受體基因的表達量來維持其胚胎發(fā)育的體軸模式系統(tǒng)中口端和反口端的穩(wěn)定[38]。在對貝螅(Hydractinia) 的研究中，通過分析frizzled和β-catenin這兩個Wnt 信號通路關(guān)鍵基因，以及gsk-3基因的阻斷，證實了經(jīng)典Wnt 信號通路參與了貝螅功能干細胞的調(diào)控過程[39]。而PI3K-Akt、磷酸戊糖等通路的基因?qū)ιL發(fā)育的調(diào)控在其他生物中也有報道[40-42]，它們在細胞的存活、分化、生長、運動和凋亡等多種生理和病理過程中起到重要作用。這些通路中的基因在玉足海參變態(tài)發(fā)育過程中如何調(diào)控關(guān)鍵生物學(xué)過程有待進一步研究。

此外，根據(jù)實驗觀察 (圖1)，玉足海參在大耳幼體變態(tài)成樽形幼體的過程中，顏色逐漸加深、體型逐漸變小，這個過程中的通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要是控制幼體發(fā)生了細胞凋亡、增殖分化等生命活動，最終大耳幼體在這些程序正常執(zhí)行之后變成了樽形幼體。此龐大的運作機制是一個最為復(fù)雜且極為重要的步驟，這可能是導(dǎo)致其高死亡率的主要原因。對這一時期富集通路的分析發(fā)現(xiàn)，癌癥途徑發(fā)揮了關(guān)鍵作用 (圖6)，其富集注釋基因數(shù)量顯著上升，富集頻率在這一時期也居首位。它涉及到很多生長調(diào)控和凋亡基因，正常的細胞凋亡會抑制致癌轉(zhuǎn)化，并控制器官形成和免疫反應(yīng)。如此途經(jīng)的ap-1基因是信號傳導(dǎo)的第三信使，在D 期顯著上調(diào)表達。它的基因產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)D N A 與保守的bZIP 結(jié)構(gòu)結(jié)合，其活性在信號傳導(dǎo)過程中會被MAPK 信號通路的磷酸化調(diào)控[43]。通過影響相關(guān)免疫、生長基因的轉(zhuǎn)錄表達過程，進而參與生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)防御、細胞增殖分化、編程性死亡等過程[44]。該基因在青蛤 (Cyclinasinensis) 受到免疫刺激后顯著上調(diào)，其不僅影響免疫應(yīng)答過程，同時也可能參與了細胞的編程性死亡[43]。該基因也參與了青海湖裸鯉 (Gymnocyprisprzewalskii) 肌肉生長和分化過程，其在肌肉中的表達量顯著上調(diào)[45]。此外，survivin基因作為凋亡蛋白抑制因子也在這時期顯著下調(diào)，survivin基因能抑制fas、bax及caspase3/7基因誘導(dǎo)的細胞凋亡[46]。這說明癌癥途徑參與了細胞凋亡響應(yīng)的重要過程，具體在玉足海參變態(tài)附著階段如何調(diào)控生物學(xué)過程也有待進一步研究。

4 結(jié)論

本實驗通過轉(zhuǎn)錄組分析研究了玉足海參變態(tài)附著階段的分子調(diào)控機理，結(jié)果顯示玉足海參幼體生長發(fā)育和細胞凋亡發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有多樣性，其差異基因和通路彼此間相互促進或制約形成了錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。針對玉足海參附著階段死亡率過高的問題，本研究推測主要與細胞是否正常執(zhí)行凋亡相關(guān)，對這些相關(guān)差異基因和通路進行內(nèi)在機理的探索，有助于揭示玉足海參的生長發(fā)育規(guī)律，為后續(xù)開展玉足海參的規(guī)?；庇夹g(shù)研究奠定基礎(chǔ)，同時也可為其他熱帶海參的人工繁育提供參考。