吳曉鵬，黃敏偉，陳曉瑛，彭 凱，趙吉臣，鐘 平，劉鳳坤，張業(yè)輝，黃 文

1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088

2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640

3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510640

4.暨南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510632

5.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510640

玉足海參 (Holothurialeucoisplota) 隸屬于楯手目、海參科、海參屬[1]，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶海參。在我國(guó)主要分布于海南、廣東等南部沿海海域的巖礁、珊瑚礁、泥沙質(zhì)淺海。其體形呈圓筒狀，后部比前端粗大，成參可以長(zhǎng)到20 cm 以上，口偏于腹面，居維氏器很發(fā)達(dá)，腹面散生有大量呈乳狀突起的管足且排列不規(guī)則[2]。玉足海參具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、耐應(yīng)激的特點(diǎn)[3]，在維持近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定中扮演了關(guān)鍵角色，是進(jìn)行放流移植及島礁生態(tài)環(huán)境修復(fù)工程的理想種類[3-4]。此外，海參自古以來(lái)便被視為滋補(bǔ)珍品，在東亞地區(qū)被廣泛食用以及用作制藥原料[5-6]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)海參進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)組成測(cè)定和營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其富含膠原蛋白、多糖、皂苷、維生素、多肽、腦苷酸等多種活性物質(zhì)。此外，對(duì)這些活性因子的研究也在逐步深入，目前已經(jīng)證實(shí)其具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗病毒和提高機(jī)體免疫力等多種生理功效[7-9]。

隨著人們對(duì)海參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值認(rèn)知的提高，對(duì)其需求也日益增大，導(dǎo)致熱帶海參的過(guò)度捕撈，使其自然資源急劇減少[10]。目前，全球超過(guò)一半的海參資源被過(guò)度開發(fā)，約30%的海參漁業(yè)已經(jīng)崩潰[11]。市場(chǎng)需求的劇增以及資源的枯竭使得熱帶海參人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的研發(fā)顯得尤為迫切[12]。目前，已有幾種熱帶海參成功實(shí)現(xiàn)了人工繁殖[3,13-16]，但這些人工繁育技術(shù)尚處于探索階段，其繁育規(guī)模小、幼苗數(shù)量少，與應(yīng)用于人工養(yǎng)殖及增殖放流仍有一定距離。玉足海參的繁育和養(yǎng)殖研究尚處于起步階段，目前可實(shí)現(xiàn)人工催產(chǎn)和孵化[3-4,17]。玉足海參幼蟲在耳狀幼體期間體積逐漸膨大，而在受精約15 d 后 (水溫為29～33 ℃)，體積開始明顯縮小形成樽形幼體，生活狀態(tài)也由浮游變?yōu)榈讞玔4]。而這一變態(tài)過(guò)程的高死亡率是熱帶海參繁育過(guò)程中的共性問(wèn)題，其背后的機(jī)制至今不明。本研究基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)[18-20]，使用Illumina 測(cè)序平臺(tái)對(duì)4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的海參幼體 (小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體和樽形幼體) 進(jìn)行了高通量測(cè)序分析。通過(guò)研究其幼體不同時(shí)期的基因表達(dá)差異，探究與海參生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要信號(hào)通路并發(fā)掘關(guān)聯(lián)基因，旨在提高對(duì)該物種生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為其育苗和養(yǎng)殖提供分子層面的育種研究借鑒，并為熱帶海參增養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展及科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)海參捕撈于深圳大鵬灣海域，并于廣東省茂名市電白區(qū)金陽(yáng)生物技術(shù)有限公司養(yǎng)殖基地暫養(yǎng)。玉足海參親本的性腺成熟時(shí)期一般在6—8 月，此時(shí)是其最佳的繁育時(shí)期。因此，本實(shí)驗(yàn)在2022 年7 月進(jìn)行海參親本的采集、人工繁育及不同發(fā)育時(shí)期幼體樣品的收集。首先從池中撈出親本進(jìn)行陰干處理，然后放入桶中待產(chǎn)卵排精。收集精子和卵子，經(jīng)濕法受精后轉(zhuǎn)入孵化池進(jìn)行孵化。其后對(duì)其幼體發(fā)育過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并分別收集小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體和樽形幼體4 個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的個(gè)體 (圖1) ，其中每個(gè)時(shí)期采集3 份樣品，每份樣品包含3 個(gè)同一時(shí)期的個(gè)體。將收集的樣品立即放入液氮罐中冷凍，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 玉足海參幼體 4 個(gè)發(fā)育時(shí)期的形態(tài)注: a.小耳幼體 (A 期)； b.中耳幼體 (B 期)；c.大耳幼體 (C 期)；d.樽形幼體 (D 期)。Fig.1 Morphology of H.leucospilota larva at four developmental stagesNote: a.Early auricularia (Stage A); b.Mid auricularia (Stage B); c.Late auricularia (Stage C); d.Doliolaria (Stage D).

1.2 RNA 提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

按常規(guī)Trizol 法提取玉足海參幼體樣品的總RNA，并標(biāo)記如下：小耳幼體 (A 期)、中耳狀幼體(B 期)、大耳狀幼體 (C 期)、樽形幼體 (D 期)，每個(gè)時(shí)期的3 個(gè)重復(fù)樣品用1、2 和3 區(qū)別。總RNA 的質(zhì)量濃度大于100 ng·μL-1，OD260與OD280比值介于 1.8～2.2，OD260與OD230比值大于 2.0，確保實(shí)驗(yàn)室中所提取的RNA 無(wú)污染、無(wú)降解。將提取的RNA 樣品送至上海美吉生物有限公司，經(jīng)文庫(kù)構(gòu)建后采用Illumina HiSeqTM 6000 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組從頭組裝

測(cè)序所獲得的初始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling 處理轉(zhuǎn)成序列數(shù)據(jù)，使用fastp 軟件去掉reads 中的接頭序列和低質(zhì)量的序列，從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean reads)。使用Trinity 軟件在默認(rèn)程序設(shè)置下對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，首先將reads 拼接成長(zhǎng)的片段contigs，然后去除掉冗余contigs，將contigs 進(jìn)行分組，連接成兩端不能再延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄片段(Unigenes)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)分析

將該次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的所有轉(zhuǎn)錄本與6 大數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行比對(duì)注釋分析。著重對(duì)GO 和KEGG 進(jìn)行分析。GO 注釋包含3 個(gè)大分支，即細(xì)胞組分 (Cellular component,CC)、生物過(guò)程 ((Biological process,BP) 和分子功能 (Molecular function,MF)；所有已知基因序列都會(huì)被注釋到其中，隨著分支的展開，基因所具有的功能也越來(lái)越詳細(xì)的注釋出來(lái)。KEGG 通路可分為細(xì)胞過(guò)程、藥物開發(fā)、代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、生物體系統(tǒng)和人類疾病7 大類別。隨著各類別的展開，對(duì)類別所包含的注釋基因描述就越清晰。采用FPKM 方法來(lái)測(cè)量基因的表達(dá)量水平。在比較不同時(shí)期的樣本后，使用DEGseq2 軟件包篩選一定條件下的差異表達(dá)基因，所設(shè)定的閾值為 |log2(FoldChange)|>1。按照通用默認(rèn)值設(shè)定Padjust<0.05，則該基因?yàn)轱@著差異表達(dá)基因。采用 Goatools 軟件對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO 功能富集分析，當(dāng)經(jīng)過(guò)校正的Padjust<0.05 時(shí)，則認(rèn)為此GO 功能類別存在顯著富集情況。KEGG 通路富集分析計(jì)算原理同GO 功能富集分析一致，即經(jīng)過(guò)校正的Padjust<0.05 時(shí)，則認(rèn)為此KEGG 通路存在顯著富集情況。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

隨機(jī)選擇6 個(gè)在玉足海參發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量顯著變化的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。用Trizol 試劑提取玉足海參幼體總RNA (上海百賽生物技術(shù)有限公司)，使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司) 合成cDNA 第一鏈。按照 TB Green?Premix Ex Taq? II(上海百賽生物技術(shù)股份有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR，并使用 SPSS 24.0 軟件 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為顯著性差異，熒光定量檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果使用2—ΔΔCt方法計(jì)算分析。以β-Actin作為內(nèi)參基因，所用引物見表1，所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增效率和特異性使用cDNA 樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定和依據(jù)熔解曲線分析確定。玉足海參的12 個(gè)樣品均進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)3 次。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與組裝結(jié)果

采集4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的海參幼體樣品進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。通過(guò)高通量測(cè)序后獲得了87.38 Gb Raw data。在經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾處理后，每個(gè)樣品的清潔讀數(shù)從42 974 554 到59 419 634 不等，有效讀數(shù)比率為98.9%。詳細(xì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，包括原始?jí)A基、有效堿基、Q20、Q30、GC 含量等。隨后通過(guò)Trinity 軟件進(jìn)行denovo 組裝，共得到93 528 個(gè)Unigenes。

表2 轉(zhuǎn)錄本組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistics analysis of transcript assembly results

2.2 轉(zhuǎn)錄組注釋

將獲得的Unigenes 分別與GO、KEGG、COG、NR、Pfam、Swissprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得玉足海參幼體Unigenes 在各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息。結(jié)果有48 087 個(gè)Unigenes 得到注釋，占整個(gè)組裝轉(zhuǎn)錄本的51.41%，GO、KEGG、COG、NR、Pfam 和Swissprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列注釋條數(shù)分別為36 422 (38.94%)、31 013 (33.16%)、36 608(39.14%)、47 228 (50.49%)、35 775 (38.25%)和35 567 (38.04%)。NR 物種注釋表明(圖2)，玉足海參與仿刺參 (Apostichopusjaponicus) 同源性最高(73%)，其次是綠海膽 (Lytechinusvariegatus)、紫色球海膽 (Strongylocentrotuspurpuratus)、長(zhǎng)棘海星(Acanthasterplanci)和蝠海星(Patiriaminiata)。GO 功能注釋顯示基因功能聚類排名前三位的分別是細(xì)胞組分類別的細(xì)胞部分、分子功能類別的組合和催化活性 (圖3)。KEGG 通路注釋顯示功能基因參與排名前三位的生物學(xué)通路分別是環(huán)境信息處理類別的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、人類疾病類別的癌癥概述和神經(jīng)退行性疾病(圖4)。

圖2 NR 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 Comparison chart of NR database

圖3 Unigene GO 功能注釋結(jié)果Fig.3 GO annotation results of unigene

圖4 Unigene KEGG 功能注釋結(jié)果Fig.4 KEGG annotation results of unigene

2.3 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組分析

為探究玉足海參幼體變態(tài)發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)變化情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)海參的4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行了比較分析，共檢測(cè)到43 720個(gè)差異表達(dá)基因，其中A 期與B、C、D 期比較，表達(dá)量差異顯著的基因數(shù)目分別為17 732 個(gè) (上調(diào)9 863 個(gè)，下調(diào) 7 869 個(gè))、17 189 個(gè) (上調(diào)10 025個(gè)，下調(diào) 7 164 個(gè))、24 081 個(gè) (上調(diào)13 700 個(gè)，下調(diào)10 381 個(gè))；B 期與C、D 期比較，表達(dá)量差異顯著的基因數(shù)目分別為11 757 個(gè) (上調(diào) 6 229 個(gè)，下調(diào) 5 528 個(gè))、20 990 個(gè) (上調(diào)10 877 個(gè)，下調(diào)10 113個(gè))； C 期與D 期比較，表達(dá)量差異顯著的基因數(shù)目為11 319 個(gè) (上調(diào)6 727 個(gè)，下調(diào)4 592 個(gè))。A期與D 期差異基因數(shù)最懸殊，表明玉足海參發(fā)育至樽形幼體后，基因表達(dá)數(shù)量發(fā)生顯著變化，使機(jī)體得以適應(yīng)變態(tài)發(fā)育過(guò)程。相鄰組間 (A_vs_B,B_vs_C,C_vs_D) 上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)量雖然基本均呈下降趨勢(shì) (圖5)，但上調(diào)基因遠(yuǎn)多于下調(diào)基因，說(shuō)明在變態(tài)發(fā)育過(guò)程中，更多的基因被釋放表達(dá)。同時(shí)也表明一些基因只在特定時(shí)期的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這可能與特定的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)調(diào)控相關(guān)。

圖5 相鄰組間差異表達(dá)基因火山圖注：A_vs_B.B 期以A 期為參照基準(zhǔn)比較；B_vs_C.C 期以B 期為參照基準(zhǔn)比較；C_vs_D.D 期以C 期為參照基準(zhǔn)比較。后圖同此。Fig.5 Volcano map of differentially expressed genes between adjacent groupsNote: A_vs_B.Stage B was compared with Stage A; B_vs_C.Stage C was compared with Stage B; C_vs_D.Stage D was compared with Stage C.The same case in following figures.

2.4 GO 和KEGG 富集分析

為探究玉足海參響應(yīng)變態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路分析。相鄰組間 (A_vs_B,B_vs_C,C_vs_D) 差異基因分別富集于579、371、441 個(gè)GO 功能類別。其中，富集頻率排名靠前的主要是分子功能、細(xì)胞成分、催化活性等與細(xì)胞成長(zhǎng)相關(guān)的生物學(xué)功能。KEGG 通路富集分析顯示A_vs_B、B_vs_C 和C_vs_D 的差異基因分別涉及342、340 和339 個(gè)通路，而且絕大部分被富集的信號(hào)通路與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，包括細(xì)胞增殖分化相關(guān)通路 (細(xì)胞周期、基因復(fù)制等)、細(xì)胞凋亡通路 (癌癥途徑、Wnt等)、糖類代謝及脂類相關(guān)通路等 (圖6)。說(shuō)明玉足海參變態(tài)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受到多個(gè)基因的調(diào)控。

圖6 相鄰組間差異表達(dá)基因 KEGG 通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes between adjacent groups

2.5 與生長(zhǎng)相關(guān)的基因分析

隨著玉足海參幼體的生長(zhǎng)發(fā)育，其體型大小在變態(tài)附著階段會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)折。首先在耳狀幼體時(shí)期幼體體積會(huì)不斷膨大成樹突狀幼蟲 (圖1-c)，而后在樽形幼體時(shí)期幼體體積逐漸收縮成橢圓狀幼蟲(圖1-d)。對(duì)相鄰組間差異基因分析的結(jié)果顯示，與生長(zhǎng)性狀調(diào)控相關(guān)的基因在特定發(fā)育時(shí)期顯著差異表達(dá)。如隨著幼體體積的變化，cox1和tll1基因表達(dá)量在A 至C 期逐漸上調(diào)，然后在D 期顯著下調(diào)。ctsl2基因在B 期顯著上調(diào)而在D 期顯著下調(diào)，c-lectin2基因僅在D 期顯著上調(diào)，survivin基因只在D 期顯著下調(diào)。這說(shuō)明機(jī)體依據(jù)變態(tài)階段不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的反饋任務(wù)去執(zhí)行相應(yīng)的表達(dá)程序，控制有效調(diào)節(jié)因子去執(zhí)行細(xì)胞增殖、分化和凋亡功能，使其能夠正常渡過(guò)變態(tài)附著階段[21-22]。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

隨機(jī)挑選6 個(gè)差異表達(dá)顯著的基因，對(duì)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量分析以驗(yàn)證玉足海參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)和分析的準(zhǔn)確性。結(jié)果如圖7 所示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析得到的表達(dá)趨勢(shì)與Illumina 測(cè)序得到的表達(dá)趨勢(shì)相似，但幾個(gè)基因的表達(dá)差異幅度存在一定差異。這可能是兩種方法的靈敏度不同所致。據(jù)報(bào)道，RNA-Seq 對(duì)目的評(píng)估基因更為敏感，說(shuō)明使用測(cè)序分析所驗(yàn)證的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本較為可靠[23]。

圖7 qRT-PCR 驗(yàn)證 RNA-seq 結(jié)果Fig.7 RNA-Seq results verified by qRT-PCR

3 討論

3.1 注釋信息分析

玉足海參幼蟲發(fā)育需經(jīng)歷浮游生活到附著生活的轉(zhuǎn)變，這個(gè)過(guò)程受到環(huán)境和遺傳因素的共同影響[24-25]。本研究對(duì)組裝得到的Unigenes 進(jìn)行生物學(xué)功能注釋，共檢測(cè)到 43 720 個(gè)差異表達(dá)基因。通過(guò)NR 物種相似度功能注釋分析，有三分之一的Unigenes 與庫(kù)中已知基因同源，相似度排名靠前的均為海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，玉足海參與這些物種具有較高的親緣性，尤其是以仿刺參、海星等為代表的棘皮動(dòng)物相似度最高；它們的許多基因是由共同祖先基因分化演變而成。本實(shí)驗(yàn)所獲得的NR 序列比對(duì)呈現(xiàn)出注釋率數(shù)值較小，這可能是由于國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的相近物種基因信息較為匱乏，并且也受到實(shí)驗(yàn)條件和測(cè)序水平等因素的限制。另外有一小部分序列未注釋匹配成功，可能原因是這些序列與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列匹配度較低，可能為無(wú)翻譯能力的RNA 或者無(wú)表達(dá)功能的結(jié)構(gòu)域序列[26]；它們有可能參與重要的生命活動(dòng)，并且在生物體內(nèi)發(fā)育功能和過(guò)程中起重要作用。對(duì)3 個(gè)相鄰組間GO 注釋富集分析 (表3)，其中，生物過(guò)程最主要的GO 類別聚集是細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程，細(xì)胞組分最主要的GO 類別聚集是細(xì)胞部分、膜部分，分子功能最主要的GO 類別聚集是組合、催化活性。不同比較組間轉(zhuǎn)錄本GO 類別與功能富集多數(shù)與細(xì)胞的完整性及其功能相關(guān)，這意味著隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物、脂質(zhì)等活性物質(zhì)含量逐漸積累，細(xì)胞數(shù)量和體積也逐漸增長(zhǎng)，相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的功能多與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞組合及催化活性緊密相關(guān)。在大耳到樽形幼體生長(zhǎng)模式的轉(zhuǎn)換過(guò)程中，細(xì)胞黏附類別富集頻率顯著增加，其生物學(xué)功能是通過(guò)細(xì)胞的識(shí)別與黏附使具有相同表面特性的細(xì)胞聚集在一起形成組織和器官，這很可能是幼體從浮游期到附著期特定器官生長(zhǎng)變化的關(guān)鍵功能。同樣的，對(duì)相鄰比較組間轉(zhuǎn)錄本參與的KEGG 注釋通路進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)其注釋多與神經(jīng)和肌肉發(fā)育代謝過(guò)程相關(guān)。這說(shuō)明在變態(tài)附著發(fā)育期間，很多控制神經(jīng)、肌肉和皮膚等組織表達(dá)通路里的轉(zhuǎn)錄因子很可能是影響生物體正常發(fā)育的關(guān)鍵因素，如肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、ECM-受體相互作用、鈣等信號(hào)通路，這有待更為深入的研究。

表3 相鄰組間差異表達(dá)基因 GO 富集分析 (前 5)Table 3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes between adjacent groups (Top five)

3.2 變態(tài)附著階段差異基因分析

玉足海參在浮游幼體期主要是以海洋藻類等浮游有機(jī)質(zhì)為食，大耳幼體后期變態(tài)為樽形幼體附著后轉(zhuǎn)而以淺層沉積物質(zhì)為主要攝食對(duì)象。因此，這兩種截然不同的生活方式可能涉及到兩套非常不同的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[27]。對(duì)4 個(gè)時(shí)期幼體觀察研究發(fā)現(xiàn)，樽形幼體時(shí)期的死亡率達(dá)到54%，這在玉足海參變態(tài)發(fā)育以及整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中為最高[3]。然而，目前針對(duì)這一階段的基因調(diào)控基礎(chǔ)仍不清楚，基因?qū)用娴臋C(jī)制受控很可能使變態(tài)延遲或變態(tài)失敗，最終導(dǎo)致幼蟲可能因能量消耗過(guò)多和環(huán)境變化而死亡[28]。分析4 個(gè)時(shí)期的差別，A 和D 期之間的差異基因數(shù)目最多 (24 081 個(gè))，而C 和D 期之間的差異基因數(shù)目最少 (11 319 個(gè))。表明有較多的調(diào)控基因參與了幼體發(fā)育過(guò)程，多種機(jī)制的協(xié)同與拮抗作用反饋影響幼體發(fā)育的相關(guān)基因的激活與抑制。此外，相鄰時(shí)期表達(dá)的差異基因數(shù)量逐漸減少且放緩。這表明變態(tài)發(fā)育引起的玉足海參體內(nèi)的反應(yīng)從最開始不穩(wěn)態(tài)到過(guò)渡新穩(wěn)態(tài)，至樽形幼體時(shí)期達(dá)到一個(gè)新的平衡。分析比較組間基因表達(dá)量差異結(jié)果，有高FPKM 值的基因與能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、催化活性、細(xì)胞骨架等基本過(guò)程相關(guān)。它們?cè)隗w內(nèi)干細(xì)胞正常發(fā)育、組織維持和血管生成中可能發(fā)揮了重要作用。如在B 期顯著上調(diào)和D 期顯著下調(diào)的ctsl2基因，它是一種重要的半胱氨酸蛋白酶，與溶酶體蛋白酶類似，能夠清除細(xì)胞中多余的蛋白質(zhì)[29]；研究發(fā)現(xiàn)，ctsl2可以使仿刺參三倍體的生長(zhǎng)速度快于二倍體[30]。此外，也有一些基因雖然并無(wú)顯著差異的表達(dá)，但在變態(tài)附著階段中可能起到至關(guān)重要的作用。如作為執(zhí)行凋亡程序的caspase-3基因，在很多生物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用，在玻璃海鞘 (Cionaintestinalis)幼體變態(tài)發(fā)育的研究中，capsase-3依賴性細(xì)胞凋亡是通過(guò)磷酸化 ERK 執(zhí)行了尾部的退化過(guò)程[31-33]，其在玉足海參D 期的表達(dá)水平較高。還有作為負(fù)調(diào)節(jié)動(dòng)物骨骼肌發(fā)育和生長(zhǎng)因子的肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin) 基因，能通過(guò)抑制成肌細(xì)胞增殖和多核肌管分化來(lái)調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量[34-36]，其在玉足海參A 和D 期的表達(dá)水平較高。因此，差異顯著基因可能在玉足海參變態(tài)附著的過(guò)程中，對(duì)機(jī)體適應(yīng)新的生長(zhǎng)模式起非常重要的作用。它們可以作為玉足海參選育潛在的候選基因，推動(dòng)整個(gè)幼體繁育的生物學(xué)過(guò)程研究。

3.3 關(guān)鍵發(fā)育信號(hào)通路分析

在本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，KEGG 注釋顯示玉足海參4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期幼體的功能基因涉及細(xì)胞周期、Wnt、PI3K-Akt、磷酸戊糖、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)消化吸收、膽固醇代謝、MAPK 信號(hào)通路等8 個(gè)與變態(tài)發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)通路。如細(xì)胞周期信號(hào)通路中的cdk、cyclin基因家族網(wǎng)絡(luò)調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育在其他水生動(dòng)物的研究中已有報(bào)道，cdk基因通過(guò)與cyclin基因結(jié)合形成復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。對(duì)文蛤 (Meretrixmeretrix)的研究發(fā)現(xiàn)，cdk基因在各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況與其殼長(zhǎng)生長(zhǎng)正相關(guān)，推測(cè)cdk基因在文蛤早期苗種生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要作用[37]。與胚胎發(fā)育相關(guān)的Wnt 信號(hào)通路也有相關(guān)報(bào)道，在對(duì)半球美螅水母(Clytiahemisphaerica) 研究中，wnt3基因通過(guò)影響受體基因的表達(dá)量來(lái)維持其胚胎發(fā)育的體軸模式系統(tǒng)中口端和反口端的穩(wěn)定[38]。在對(duì)貝螅(Hydractinia) 的研究中，通過(guò)分析frizzled和β-catenin這兩個(gè)Wnt 信號(hào)通路關(guān)鍵基因，以及gsk-3基因的阻斷，證實(shí)了經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路參與了貝螅功能干細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程[39]。而PI3K-Akt、磷酸戊糖等通路的基因?qū)ιL(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控在其他生物中也有報(bào)道[40-42]，它們?cè)诩?xì)胞的存活、分化、生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和凋亡等多種生理和病理過(guò)程中起到重要作用。這些通路中的基因在玉足海參變態(tài)發(fā)育過(guò)程中如何調(diào)控關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程有待進(jìn)一步研究。

此外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察 (圖1)，玉足海參在大耳幼體變態(tài)成樽形幼體的過(guò)程中，顏色逐漸加深、體型逐漸變小，這個(gè)過(guò)程中的通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要是控制幼體發(fā)生了細(xì)胞凋亡、增殖分化等生命活動(dòng)，最終大耳幼體在這些程序正常執(zhí)行之后變成了樽形幼體。此龐大的運(yùn)作機(jī)制是一個(gè)最為復(fù)雜且極為重要的步驟，這可能是導(dǎo)致其高死亡率的主要原因。對(duì)這一時(shí)期富集通路的分析發(fā)現(xiàn)，癌癥途徑發(fā)揮了關(guān)鍵作用 (圖6)，其富集注釋基因數(shù)量顯著上升，富集頻率在這一時(shí)期也居首位。它涉及到很多生長(zhǎng)調(diào)控和凋亡基因，正常的細(xì)胞凋亡會(huì)抑制致癌轉(zhuǎn)化，并控制器官形成和免疫反應(yīng)。如此途經(jīng)的ap-1基因是信號(hào)傳導(dǎo)的第三信使，在D 期顯著上調(diào)表達(dá)。它的基因產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)D N A 與保守的bZIP 結(jié)構(gòu)結(jié)合，其活性在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中會(huì)被MAPK 信號(hào)通路的磷酸化調(diào)控[43]。通過(guò)影響相關(guān)免疫、生長(zhǎng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程，進(jìn)而參與生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)防御、細(xì)胞增殖分化、編程性死亡等過(guò)程[44]。該基因在青蛤 (Cyclinasinensis) 受到免疫刺激后顯著上調(diào)，其不僅影響免疫應(yīng)答過(guò)程，同時(shí)也可能參與了細(xì)胞的編程性死亡[43]。該基因也參與了青海湖裸鯉 (Gymnocyprisprzewalskii) 肌肉生長(zhǎng)和分化過(guò)程，其在肌肉中的表達(dá)量顯著上調(diào)[45]。此外，survivin基因作為凋亡蛋白抑制因子也在這時(shí)期顯著下調(diào)，survivin基因能抑制fas、bax及caspase3/7基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[46]。這說(shuō)明癌癥途徑參與了細(xì)胞凋亡響應(yīng)的重要過(guò)程，具體在玉足海參變態(tài)附著階段如何調(diào)控生物學(xué)過(guò)程也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析研究了玉足海參變態(tài)附著階段的分子調(diào)控機(jī)理，結(jié)果顯示玉足海參幼體生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞凋亡發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有多樣性，其差異基因和通路彼此間相互促進(jìn)或制約形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。針對(duì)玉足海參附著階段死亡率過(guò)高的問(wèn)題，本研究推測(cè)主要與細(xì)胞是否正常執(zhí)行凋亡相關(guān)，對(duì)這些相關(guān)差異基因和通路進(jìn)行內(nèi)在機(jī)理的探索，有助于揭示玉足海參的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，為后續(xù)開展玉足海參的規(guī)模化繁育技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可為其他熱帶海參的人工繁育提供參考。