田 甜，張建明，朱 欣，張德志，舒婷婷

中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)有限公司中華鱘研究所/三峽工程魚(yú)類(lèi)資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443100

像哺乳動(dòng)物一樣，魚(yú)類(lèi)的微生物主要集中在體表和消化道，并形成了相應(yīng)的菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)宿主的健康發(fā)育和生長(zhǎng)具有重要作用。魚(yú)類(lèi)體表是保護(hù)機(jī)體的一道重要屏障，體表分泌的黏液構(gòu)成了魚(yú)體與水環(huán)境的隔離界面[1]，成為防御入侵的第一道防線，同時(shí)也是魚(yú)體天然免疫的重要組成部分[2]。腸道微生物菌群數(shù)量豐富、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，被稱(chēng)為宿主的額外器官，具有維持宿主營(yíng)養(yǎng)吸收[3]、免疫調(diào)控[4]、生長(zhǎng)發(fā)育[5]等重要作用。魚(yú)類(lèi)的腸道微生物系統(tǒng)是后天形成的，其菌群結(jié)構(gòu)與宿主自身發(fā)育狀態(tài)、養(yǎng)殖環(huán)境和餌料種類(lèi)密切相關(guān)。魚(yú)類(lèi)生活在水中，水中含有復(fù)雜多樣的微生物，其皮膚黏液和腸道更容易受到水環(huán)境的影響。Giatsis 等[6]認(rèn)為水環(huán)境對(duì)孵化后羅非魚(yú) (Oreochromismossambicus) 腸道微生物的最初定殖起到了重要作用。因此，魚(yú)類(lèi)和體表黏液、腸道、水環(huán)境中的微生物互相依賴(lài)、互相制約、動(dòng)態(tài)平衡才能保證宿主的健康生長(zhǎng)。

研究發(fā)現(xiàn)不同生境導(dǎo)致草魚(yú) (Ctenopharyngdon idellus) 前腸微生物組成差異較大：自然生境的優(yōu)勢(shì)菌屬是不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter) 和貪銅菌屬(Cupriavidus)；高密度池塘養(yǎng)殖生境的優(yōu)勢(shì)菌屬是鯨桿菌屬 (Cetobacterium) 和希瓦氏菌屬 (Shewanella)；低密度池塘生境的優(yōu)勢(shì)菌屬是鏈球菌屬(Streptococcus) 和消化鏈球菌屬 (Peptostreptococcus)[7]。樊英等[8]采用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析大瀧六線魚(yú) (Hexagrammosotakii) 表皮黏液和腸道內(nèi)容物的微生物多樣性，結(jié)果顯示表皮黏液和腸道內(nèi)容物的微生物既有相似性又有差異性，二者共有操作分類(lèi)單元 (Operational Taxonomic Unit,OTU) 數(shù)量為33 個(gè)，表皮黏液具有更高的微生物多樣性，而腸道內(nèi)容物具有更高的微生物豐富度。郝佳慧等[9]通過(guò)Illumina MiSeq 擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)分析了小頭裸裂尻魚(yú) (Herzensteiniamicrocephalus) 的皮膚黏液、腸道黏膜和腸道內(nèi)容物間微生物菌群的組成差異，發(fā)現(xiàn)皮膚黏液微生物多樣性最高，腸道黏膜和腸道內(nèi)容物之間微生物多樣性差異較小，3 個(gè)部位的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均以放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和藍(lán)藻門(mén)為主。已有眾多針對(duì)不同魚(yú)類(lèi)體表黏液、腸道和不同養(yǎng)殖環(huán)境開(kāi)展的單一或兩者之間的微生物菌群結(jié)構(gòu)研究[10-12]，但鮮見(jiàn)對(duì)魚(yú)類(lèi)體表黏液、腸道以及養(yǎng)殖水環(huán)境三者之間聯(lián)合開(kāi)展的菌群結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)分析研究。

長(zhǎng)江鱘 (Acipenserdabryanus) 是中國(guó)特有魚(yú)類(lèi)，主要分布于長(zhǎng)江上游干流以及部分重要支流[13]。近年來(lái)，由于環(huán)境污染、過(guò)度捕撈、生境破壞等因素的影響，其自然種群資源急劇下降，已被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟 (International Union for Conservation of Nature,IUCN) 列為極危級(jí) (CR) 物種。對(duì)長(zhǎng)江鱘開(kāi)展科學(xué)、有效的人工養(yǎng)殖工作仍是維持其種群數(shù)量的關(guān)鍵。本研究采用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)，探究了長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體的微生物菌群組成、多樣性及動(dòng)態(tài)變化，以期為長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)的健康養(yǎng)殖和病害分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)由中華鱘研究所2022 年春季自主繁育。2022 年6—9 月單養(yǎng)在直徑4 m、水深0.8 m 的圓形流水養(yǎng)殖池。水源為井水和塘水混合水，6、7 和9 月每日投喂2 次鱘魚(yú)配合飼料，投喂量約為魚(yú)體質(zhì)量的1%；8 月水溫升高，調(diào)整為每日投喂1 次鱘魚(yú)配合飼料，投喂量約為魚(yú)體質(zhì)量的0.5%。養(yǎng)殖期間每日排污2 次，換水量約為20%，每周開(kāi)展常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測(cè)。

1.2 樣品采集

春夏季節(jié)，水溫適宜，各種病原體容易滋生繁殖，是魚(yú)類(lèi)疾病的高發(fā)期。2022 年6—9 月期間，每月對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)開(kāi)展一次體表黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體樣品的采集工作，每種樣品設(shè)置6 個(gè)平行。黏液樣品和腸道內(nèi)容物樣品的采集方法為：隨機(jī)挑取6 尾魚(yú)，在2 mL 無(wú)菌EP 管中加入1 mL無(wú)菌水，用無(wú)菌鑷輕輕刮取鰭條、腹部、體側(cè)及背部黏液與無(wú)菌水混合均勻，于—80 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。隨后，用75% (φ) 乙醇棉球?qū)︳~(yú)肛門(mén)、腹部及體側(cè)進(jìn)行消毒，用無(wú)菌解剖剪從腹部剪開(kāi)，取出腸道，用無(wú)菌PBS 緩沖液沖洗3 次，無(wú)菌棉球擦拭干燥后將瓣腸、直腸腸道內(nèi)容物置于2 mL 無(wú)菌EP 管中，于—80 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。同時(shí)，采集與黏液、腸道樣品同時(shí)期的養(yǎng)殖水體樣品，采集方法為：在養(yǎng)殖池3 個(gè)對(duì)角線點(diǎn)分別用無(wú)菌水樣采集袋采集500 mL水樣，3 個(gè)水樣混合均勻，用0.22 μm 濾膜抽濾收集菌體，—80 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。

1.3 16S rRNA 高通量測(cè)序

采集的全部樣品于干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA 高通量測(cè)序。具體流程如下：利用Fast DNA?Spin Kit for Soil (MP Biomedical，美國(guó)) 試劑盒提取黏液、腸道內(nèi)容物及其水環(huán)境微生物總DNA，用1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。使用V3—V4 變異區(qū)引物(338F-806R) 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后進(jìn)行定量和均一化處理，構(gòu)建文庫(kù)并通過(guò)Illumina Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

在美吉生物云平臺(tái)完成數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析工作。使用Fastp 0.19.6 軟件對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，使用Flash 1.2.11 軟件進(jìn)行拼接。使用Uparse 11 軟件根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)并剔除嵌合體。采用PDR Classifier 2.13 軟件對(duì)每條序列進(jìn)行物種注釋分類(lèi)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，比對(duì)Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)。按照最小樣本序列數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)抽平處理后，進(jìn)行物種組成分析、Alpha 和Beta 多樣性分析、潛在病原菌分析及功能預(yù)測(cè)分析，采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)開(kāi)展指數(shù)間差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

共計(jì)采集到長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物、養(yǎng)殖水體樣品72 個(gè)，PCR 擴(kuò)增顯示69 個(gè)樣品滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，測(cè)序結(jié)果顯示69 個(gè)樣品共計(jì)獲得3 462 138條高質(zhì)量序列，有效序列的平均長(zhǎng)度為417 bp。對(duì)有效序列進(jìn)行97% 的相似性聚類(lèi)，可劃分為4 349 個(gè)OTUs，鑒定出50 門(mén)、154 綱、381 目、632 科、1 306 屬、2 360 種。各樣品稀釋曲線顯示稀釋曲線已到達(dá)平臺(tái)期 (圖1)，表明本次測(cè)序幾乎已覆蓋所有的細(xì)菌，可真實(shí)反映出細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves and Shannon curves of different samples

2.2 多樣性分析

Venn 圖分析顯示，長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物和養(yǎng)殖水體共有OTUs 數(shù)量為485 個(gè)，養(yǎng)殖水體特有OTUs 數(shù)量最多 (1 229 個(gè))，黏液和腸道內(nèi)容物特有OTUs 數(shù)量相似，分別為680 和691 個(gè)(圖2)。三者之間微生物多樣性存在差異。Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)顯示，黏液和腸道內(nèi)容物微生物物種豐富度無(wú)顯著性差異，二者均極顯著低于養(yǎng)殖水體(P<0.001，圖3-a、3-b)。Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示，養(yǎng)殖水體微生物的物種多樣性最高、黏液次之、腸道內(nèi)容物最低 (圖3-c、3-d)?；赽ray_curtis 的PCoA 分析顯示，黏液和腸道內(nèi)容物樣本部分重疊 (圖4-a)，說(shuō)明二者的菌群差異較小，而養(yǎng)殖水體與二者間有一定距離，說(shuō)明它們之間的菌群具有差異?；谙嗤嚯x算法的樣本層級(jí)聚類(lèi)分析將樣本明顯分成2 個(gè)簇 (圖4-b)，其中黏液和腸道內(nèi)容物聚為一簇，養(yǎng)殖水體單獨(dú)為一簇，表明黏液和腸道內(nèi)容物菌群更為相似，且可與養(yǎng)殖水體菌群區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖2 黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體 OTUs 分布 Venn 圖Fig.2 Venn diagram analysis of mucus,intestinal content and culture water

圖3 黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體中微生物的 Alpha 多樣性指數(shù)間差異檢驗(yàn)注：*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001。Fig.3 Alpha diversity difference of microorganism in mucus,intestinal content and culture waterNote: *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001.

圖4 黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中微生物的 Beta 多樣性注：a.PCoA 圖 (屬水平)；b.樣本層級(jí)聚類(lèi)樹(shù) (屬水平)。Fig.4 Beta diversity of bacteria in mucus,intestinal content and culture waterNote: a.PCoA on genus level; b.Hierarchical clustering tree on genus level.

2.3 物種組成及變化分析

在門(mén)水平，長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液和腸道內(nèi)容物微生物優(yōu)勢(shì)菌門(mén)較為相似，均以放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為主，不同門(mén)類(lèi)的排列順序有所差異(圖5-a、5-b)。6—9 月期間，黏液微生物優(yōu)勢(shì)菌門(mén)變幅不大，而腸道內(nèi)容物微生物中梭桿菌門(mén)在8 月明顯增加，在9 月明顯減少并趨于正常，這可能與高溫季節(jié)投喂頻率和投喂量下降有關(guān)。養(yǎng)殖水體微生物優(yōu)勢(shì)菌門(mén)依次為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，與前兩者優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有所差異 (圖5-c)。6 月，養(yǎng)殖水體中排名前三的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為變形菌門(mén) (占比58.91%)、厚壁菌門(mén) (35.60%) 和擬桿菌門(mén) (3.46%)。7 月，養(yǎng)殖水體微生物優(yōu)勢(shì)菌門(mén)發(fā)生改變，擬桿菌門(mén)成為第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén) (占比46.80%)，變形菌門(mén)下降至25.45%，厚壁菌門(mén)下降至3.16% (圖5-c)。8—9 月，開(kāi)始重新建立新的平衡。9 月，變形菌門(mén)恢復(fù)為第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén) (占比60.29%)，擬桿菌門(mén)成為第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén) (占比34.08%)，厚壁菌門(mén)占比3.07%。6—9 月，養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌門(mén)排序發(fā)生變化可能與高溫、枯水期水源改變有關(guān)。

圖5 黏液 (a)、腸道內(nèi)容物 (b) 及養(yǎng)殖水體中 (c) 微生物在門(mén)水平的菌群結(jié)構(gòu)組成Fig.5 Dominant species of bacteria in mucus (a),intestinal content (b) and culture water (c) on phylum level

在屬水平，長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液優(yōu)勢(shì)菌群為紅球菌屬 (Rhodococcus)、產(chǎn)堿菌屬 (Alcaligenes)、不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter) 和葉桿菌屬(Phyllobacterium) (圖6-a)。6 月以紅球菌屬 (占比31.25%)、葉桿菌屬 (17.72%) 和不動(dòng)桿菌屬(14.53%) 為主；7 月葉桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬占比降低，優(yōu)勢(shì)菌屬變?yōu)橐约t球菌屬 (51.13%)和產(chǎn)堿菌屬 (28.07%) 為主；8 月仍以紅球菌屬 (53.91%)、產(chǎn)堿菌屬 (30.40%) 為主；9 月以紅球菌屬 (35.06%)、產(chǎn)堿菌屬 (19.81%)、檸檬酸桿菌屬 (16.16%) 和不動(dòng)桿菌屬(13.11%) 為主。腸道內(nèi)容物優(yōu)勢(shì)菌屬為紅球菌屬、葉桿菌屬、鯨桿菌屬、乳球菌屬 (Lactococcus) 和Clostridium_sensu_stricto_1(圖6-b)。6 月以紅球菌屬 (38.25%)、Clostridium_sensu_stricto_1(26.69%) 和葉桿菌屬 (24.95%) 為主；7 月Clostridium_sensu_stricto_1占比大幅下降，以紅球菌屬(54.60%) 和葉桿菌屬 (27.59%) 為主；8 月，隨著投喂頻率和投喂量的下降，鯨桿菌屬成為第一大優(yōu)勢(shì)菌屬 (37.43%)，其次為紅球菌屬 (32.20%)，葉桿菌屬 (14.76%) 為第三大優(yōu)勢(shì)菌屬；9 月，紅球菌屬恢復(fù)為第一優(yōu)勢(shì)菌屬 (30.28%)，乳球菌屬激增成為第二大優(yōu)勢(shì)菌屬 (29.32%)，葉桿菌屬為第三大優(yōu)勢(shì)菌屬 (14.86%)。養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢(shì)菌屬為黃桿菌屬(Flavobacterium)、不動(dòng)桿菌屬、乳球菌屬和檸檬酸桿菌屬 (圖6-c)。6 月以不動(dòng)桿菌屬 (45.37%) 和乳球菌屬 (28.57%) 為主；隨著水溫升高和枯水期水源改變，7—8 月菌群種類(lèi)更加豐富，打破原有平衡，黃桿菌屬成為第一優(yōu)勢(shì)菌屬；9 月形成以黃桿菌屬 (28.30%)、檸檬酸桿菌屬 (24.12%) 和不動(dòng)桿菌屬 (19.40%) 為主的新平衡。

圖6 黏液 (a)、腸道內(nèi)容物 (b) 及養(yǎng)殖水體中 (c) 微生物在屬水平的菌群結(jié)構(gòu)組成Fig.6 Dominant species of bacteria in mucus (a),intestinal content (b) and culture water (c) on genus level

2.4 潛在病原菌的分析

對(duì)OTU 豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選擇豐度前50 個(gè)OTUs 在屬水平進(jìn)行熱圖分析，以展示潛在病原菌在黏液、腸道內(nèi)容物和養(yǎng)殖水體中的分布情況(圖7)。發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、黃桿菌屬、愛(ài)德華氏菌屬 (Edwardsiella)、假單胞菌屬(Psedomonas)、鄰單胞菌屬 (Plesiomonas) 和氣單胞菌屬 (Aeromonas) 共計(jì)7 種潛在病原菌菌屬。養(yǎng)殖水體中潛在病原菌分布最廣，以檸檬酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、黃桿菌屬、鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬為主；黏液次之，以檸檬酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和鄰單胞菌屬為主；腸道內(nèi)容物中各病原菌屬分布較窄。

圖7 屬水平下黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體中微生物組成熱圖Fig.7 Heatmap of microbial communities in mucus,intestinal content and culture water on genus level

2.5 表型預(yù)測(cè)分析

為進(jìn)一步了解長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體微生物菌群的功能輪廓，利用BugBase 對(duì)細(xì)菌表型進(jìn)行預(yù)測(cè)。BugBase 表型預(yù)測(cè)分析開(kāi)展了革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性、厭氧、兼性厭氧、好氧和潛在致病性共計(jì)6 種表型特征。結(jié)果顯示，腸道內(nèi)容物以革蘭氏陽(yáng)性菌為主 (占比62.57%，圖8-a)，黏液和養(yǎng)殖水體以革蘭氏陰性菌為主，分別占比59.70% 和71.18% (圖8-b)。在厭氧菌組成方面，腸道內(nèi)容物厭氧菌豐度最高，養(yǎng)殖水樣次之，黏液厭氧菌豐度最低 (圖8-c)；在兼性厭氧菌組成方面，養(yǎng)殖水體兼性厭氧菌顯著高于黏液和腸道內(nèi)容物 (圖8-d)；在好氧菌組成方面，黏液好氧菌豐度為79.87%，腸道內(nèi)容物為62.73%，養(yǎng)殖水體為37.31% (圖8-e)。有潛在致病性的菌群主要富集在養(yǎng)殖水體和黏液中，遠(yuǎn)高于腸道內(nèi)容物(圖8-f)。

圖8 利用BugBase 對(duì)黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中微生物菌群表型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析Fig.8 Phenotype analysis of bacteria in mucus,intestinal content and culture water by BugBase

3 討論

微生物是生命世界中豐富多樣的生物資源，不同來(lái)源的微生物表現(xiàn)出不同的菌群結(jié)構(gòu)和特征。本研究對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示三者間的菌群結(jié)構(gòu)兼具相似性和差異性。魚(yú)類(lèi)表皮細(xì)胞分泌大量黏液，其微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)受到物種、餌料、發(fā)育進(jìn)程以及健康狀態(tài)的影響，但這些影響隨著宿主發(fā)育而逐漸減弱[14]。魚(yú)類(lèi)體表黏液根據(jù)自身需要建立特定菌群，并在特定發(fā)育時(shí)期保持相對(duì)穩(wěn)定[15]。研究認(rèn)為魚(yú)類(lèi)黏液微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能與腸道具有相似性[16]。本研究中，Alpha 和Beta 多樣性分析表明黏液和腸道內(nèi)容物微生物菌群結(jié)構(gòu)更為相似，且可與養(yǎng)殖水體微生物菌群區(qū)分開(kāi)來(lái)。推測(cè)可能是魚(yú)類(lèi)體表黏液和腸道與機(jī)體互利共存、相互作用的結(jié)果。養(yǎng)殖水體中存在大量的微生物，它們參與各項(xiàng)物質(zhì)循環(huán)，維持整個(gè)養(yǎng)殖系統(tǒng)的生態(tài)平衡[17]。研究表明，斑點(diǎn)叉尾鮰 (Ictalunespunctatus)[18]、大菱鲆 (Scophthalmusmaximus)[19]、花鱸 (Lateolabraxjaponicus) 和日本黃姑魚(yú) (Nibeajaponica)[20]腸道的微生物多樣性低于養(yǎng)殖水體。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，Alpha 多樣性分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)腸道內(nèi)容物中微生物的菌群豐富度和多樣性低于同時(shí)期養(yǎng)殖水體，且差異顯著 (P<0.001)。

在門(mén)水平，虹鱒 (Oncorhynchusmykiss) 體表黏液以變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主[21]；小頭裸裂尻魚(yú)體表皮膚的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為放線菌門(mén)和變形菌門(mén)[9]。變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)是大口黑鱸 (Micropterussalmoides) 腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[22]；變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是玫瑰高原鰍 (Triplophysarosa) 腸道的主要菌群[23]；變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是石首魚(yú) (Aplodinotusgrunniens) 腸道的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液和腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)較為相似，均為放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，與上述學(xué)者的研究結(jié)果有所差異?？赡苁怯捎诓煌M織來(lái)源、不同種類(lèi)的微生物菌群因其宿主特征、餌料種類(lèi)、組織特性不同，其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)會(huì)呈現(xiàn)不同組成變化。本研究顯示6—9 月期間各門(mén)類(lèi)比例呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，其中黏液動(dòng)態(tài)變幅不大，而腸道內(nèi)容物在8 月出現(xiàn)梭桿菌門(mén)明顯增加，9 月明顯下降恢復(fù)正常的現(xiàn)象。這可能與8 月水溫升高降低日投喂量和投喂頻率，9 月恢復(fù)正常投喂有關(guān)。這提示我們改變投喂策略可以直接影響腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的組成。

在門(mén)水平對(duì)養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行研究，結(jié)果表明遼寧長(zhǎng)海刺參 (Apostichopusjaponicus) 養(yǎng)殖池水體[25]和凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeusvannamei) 異養(yǎng)、自養(yǎng)型生物絮團(tuán)[26]以變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主；4 種鱘鰉網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌門(mén)由變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)等組成[27]。本研究養(yǎng)殖水體中變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)占優(yōu)勢(shì)地位，與上述結(jié)果相一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體隨外界因素影響呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。6 月，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)排列由高到低依次為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。7 月，枯水期水源改變導(dǎo)致擬桿菌門(mén)成為第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，變形菌門(mén)降至第二。9 月，水源逐步趨于穩(wěn)定，形成以變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)為主的新平衡狀態(tài)。變形菌門(mén)是細(xì)菌中最大的一個(gè)門(mén)，具有利用碳源，去除氮與磷，降解有機(jī)物等作用[28-29]。擬桿菌門(mén)作為第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在降解生物大分子、發(fā)酵碳水化合物、參與碳循環(huán)等方面具有重要作用[30-31]。

在屬水平，長(zhǎng)江鱘體表黏液優(yōu)勢(shì)菌屬為紅球菌屬、產(chǎn)堿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬和葉桿菌屬；腸道內(nèi)容物優(yōu)勢(shì)菌屬為紅球菌屬、葉桿菌屬、鯨桿菌屬、乳球菌屬和Clostridium_sensu_stricto_1；養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢(shì)菌屬為黃桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、乳球菌屬和檸檬酸桿菌屬。其中黏液和腸道內(nèi)容物共同優(yōu)勢(shì)菌屬2 個(gè)，且第一優(yōu)勢(shì)菌屬相同，黏液和養(yǎng)殖水體共同優(yōu)勢(shì)菌屬2 個(gè)，腸道內(nèi)容物和養(yǎng)殖水體共同優(yōu)勢(shì)菌屬1 個(gè)。魚(yú)體黏液與水環(huán)境密切接觸，水環(huán)境中含有復(fù)雜多樣的微生物群落，但物種組成分析結(jié)果和多樣性結(jié)果均顯示黏液與養(yǎng)殖水體的相似性低于其與腸道的相似性。推測(cè)產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因有兩種：1) 黏液作為機(jī)體的第一道防御屏障，含有大量的土著微生物，水環(huán)境中的微生物難以定殖成功，其在水環(huán)境中會(huì)選擇自身需要的微生物并構(gòu)建特定的群落；2) 黏液和腸道共同與宿主互相作用、互相影響，宿主利用各種防御機(jī)制將二者中的微生物群落維持在一定的范圍，以保障機(jī)體健康生長(zhǎng)。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中，細(xì)菌性疾病是制約養(yǎng)殖成活率的一大瓶頸[32-33]。眾所周知，條件病原菌廣泛存在于養(yǎng)殖環(huán)境和魚(yú)體內(nèi)外，當(dāng)魚(yú)體體質(zhì)下降或外界環(huán)境惡化極易導(dǎo)致病害的發(fā)生。已報(bào)道的鱘魚(yú)病害研究顯示，柱狀黃桿菌 (Flavobacteriumcolumnare) 可導(dǎo)致中華鱘 (A.sinensis) 患爛鰓病[34]；嗜水氣單孢菌(Aeromonashydrophila)[35-36]、維氏氣單胞菌 (A.veronii)[37]、遲緩愛(ài)德華氏菌 (Edwardsiellatarda)[38]、弗氏檸檬酸桿菌 (Citrobacterfreundii)[39]可導(dǎo)致西伯利亞鱘 (A.baerii)、達(dá)氏鱘、中華鱘患細(xì)菌性敗血癥；惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida) 可導(dǎo)致雜交鱘 (Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂) 患腸炎病[40]；停乳鏈球菌 (Streptococcusdysgalactiae)[41]、海豚鏈球菌 (S.iniae)[42]可導(dǎo)致俄羅斯鱘 (A.gueldenstaedti)、波斯鱘 (A.persicus) 患鏈球菌?。慌及l(fā)分枝桿菌 (Mycobacteriumfortuitum)[43]、龜分枝桿菌 (M.chelonae)[44]、海分枝桿菌 (M.marinum)[45]可導(dǎo)致小體鱘 (A.ruthenus)、俄羅斯鱘、中華鱘患分枝桿菌病。本研究通過(guò)對(duì)豐度前50 個(gè)OTUs 在屬水平進(jìn)行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)潛在病原菌在長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中普遍存在，共計(jì)發(fā)現(xiàn)7 個(gè)潛在病原菌屬：檸檬酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、黃桿菌屬、愛(ài)德華氏菌屬、假單胞菌屬、鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬。提示在養(yǎng)殖過(guò)程中容易發(fā)生爛鰓病、腸炎病和細(xì)菌性敗血癥。潛在病原菌在三者之間的分布關(guān)系為養(yǎng)殖水體最廣、黏液次之、腸道內(nèi)容物最窄，表明在適宜的條件下，潛在病原菌可能會(huì)由外向內(nèi)導(dǎo)致上述疾病的發(fā)生。

通過(guò)BugBase 對(duì)細(xì)菌表型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中存在革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌。其中腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢(shì)菌群為革蘭氏陽(yáng)性菌，占比超過(guò)60%；黏液和養(yǎng)殖水體的優(yōu)勢(shì)菌群均為革蘭氏陰性菌，占比分別為60%和70%。研究發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鰉 (Husodauricus)[46]和大瀧六線魚(yú)幼魚(yú)[47]腸道中革蘭氏陽(yáng)性菌分別占比80% 和56%，與本研究結(jié)果相似。這與梭菌屬、乳球菌屬等革蘭氏陽(yáng)性菌的功能有關(guān)，它們可以在腸道中發(fā)酵碳水化合物、利用蛋白質(zhì)和糖分，幫助魚(yú)類(lèi)從餌料中獲取營(yíng)養(yǎng)和能量[48-49]。已有研究顯示小頭裸裂尻魚(yú)皮膚黏膜微生物中革蘭氏陰性菌占比約為50%[9]，南極中山站上層海水微生物中革蘭氏陰性菌占比約為60%[14]，二者革蘭氏陰性菌比例均小于本研究，這可能與物種、水源以及發(fā)育進(jìn)程的影響相關(guān)。在氧氣需求方面，黏液和腸道內(nèi)容物以好氧菌為主；養(yǎng)殖水體以好氧菌和兼性厭氧菌為主。與黏液和養(yǎng)殖水體相比，腸道內(nèi)容物中含有更多的厭氧菌，Clostridium_sensu_stricto_1在腸道厭氧菌中占比超過(guò)70%，成為優(yōu)勢(shì)菌屬。Clostridium_sensu_stricto_1具有促進(jìn)短鏈脂肪酸(SCFAs) 產(chǎn)生，改善腸道微生物結(jié)構(gòu)的作用[50]。在人類(lèi)醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，Clostridium_sensu_stricto_1可以通過(guò)阻礙病原微生物的定殖進(jìn)而增強(qiáng)嬰兒腸道中細(xì)菌的耐藥性[51]。潛在致病性菌群在養(yǎng)殖水體和黏液中占比均超過(guò)45%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腸道內(nèi)容物(0.2%)。由此可見(jiàn)，養(yǎng)殖水體和黏液中存在著大量的條件致病菌，當(dāng)魚(yú)體處于應(yīng)激狀態(tài)或養(yǎng)殖環(huán)境惡化時(shí)，可能導(dǎo)致病害的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江鱘幼魚(yú)黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體的微生物多樣性進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體的微生物多樣性最高、黏液次之、腸道內(nèi)容物最低。黏液和腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)更為相似，且可與養(yǎng)殖水體微生物菌群區(qū)分開(kāi)來(lái)。養(yǎng)殖水體和黏液中存在大量的潛在致病菌，當(dāng)魚(yú)體處于應(yīng)激狀態(tài)或養(yǎng)殖環(huán)境惡化時(shí)，可能導(dǎo)致病害的發(fā)生。

致謝：衷心感謝三峽金沙江川云水電開(kāi)發(fā)有限公司柯偉主任在本研究過(guò)程中給予的支持與幫助！