王碩 時(shí)唐恩 趙春光 徐慶陽(yáng)

摘要：目前工業(yè)上主要采取微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸，此工藝存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、糖酸轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題。因此，該研究以發(fā)酵過(guò)程中菌體量、L-酪氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)換率以及耗糖速率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)探究La3+、Ce3+、Nd3+對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響并最終確定了稀土元素的添加組合，提高了菌體的活力，縮短了延滯期，延長(zhǎng)了產(chǎn)酸高峰期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，向L-酪氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中添加80 mg/L La3+、2 mg/L Ce3+、0.3 mg/L Nd3+對(duì)發(fā)酵有利。發(fā)酵耗時(shí)35 h，縮短了2.2%；最高菌體量達(dá)到80.3，提升了10.8%；產(chǎn)酸量達(dá)到55.7 g/L，提升了9.7%；糖酸轉(zhuǎn)化率為23.4%，提升了6.4%。驗(yàn)證了添加稀土元素的可行性，為L(zhǎng)-酪氨酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；L-酪氨酸；稀土元素；耗糖速率

中圖分類號(hào)：TS201.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）12-0001-06

Study on Effect of Rare Earth Elements on Fermentation of L-Tyrosine

WANG Shuo1， SHI Tang-en1， ZHAO Chun-guang2， XU Qing-yang1，3，4*

（1.College of Bioengineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China;

2.Ningxia Eppen Biotech Co.， Ltd.， Yinchuan 750100， China; 3.National and Local

United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation Technology，

Tianjin 300457， China; 4.Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and

Green Amino Acid Manufacturing， Tianjin 300457， China）

Abstract： At present， microbial fermentation method is the main method to produce L-tyrosine in industry， which has problems such as long production cycle and low sugar-acid conversion rate. Therefore， in this study， with the bacterial biomass， L-tyrosine yield， sugar-acid conversion rate and sugar consumption rate in the fermentation process as the indexes， the effects of La3+， Ce3+ and Nd3+ on the fermentation of L-tyrosine is explored through single factor experiment and orthogonal experiment. Finally， the addition combination of rare earth elements is determined， which has improved the bacterial vitality， shortened the lag period and extended the peak period of acid production. The results show that adding 80 mg/L La3+， 2 mg/L Ce3+ and 0.3 mg/L Nd3+ into L-tyrosine fermentation medium is beneficial to fermentation. Fermentation time is 35 h， which is shortened by 2.2%. The maximum bacterial biomass reaches 80.3， increasing by 10.8%. Acid yield reaches 55.7 g/L， increasing by 9.7%. The sugar-acid conversion rate is 23.4%， increasing by 6.4%. The feasibility of adding rare earth elements is verified， which has provided a basis for large-scale industrial production of L-tyrosine.

Key words： Escherichia coli; L-tyrosine; rare earth element; sugar consumption rate

L-酪氨酸是一種對(duì)人體起著重要作用的芳香族氨基酸[1]，屬于三大芳香族氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)[2]。L-酪氨酸有助于加快新陳代謝，刺激人體神經(jīng)系統(tǒng)，輔助治療慢性疾病。除此之外，L-酪氨酸可以作為一種重要的大腦化學(xué)物質(zhì)來(lái)幫助調(diào)節(jié)人體的情緒、食欲以及人體對(duì)外界壓力的應(yīng)激反應(yīng)等[3]，L-酪氨酸還是多種醫(yī)藥化工產(chǎn)品的制備原料，在農(nóng)業(yè)中作為肥料增加農(nóng)作物的抗旱性，在化妝品行業(yè)中起到美白和調(diào)理皮膚的作用[4]。

稀土元素被發(fā)現(xiàn)于18世紀(jì)末，包括銅、鈷、欽等17種元素，21世紀(jì)初有人開始對(duì)稀土元素的醫(yī)學(xué)作用進(jìn)行研究[5]。我國(guó)是首個(gè)將稀土元素應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的國(guó)家，并取得了良好的效果。馬文彬等[6]通過(guò)研究稀土在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，稀土有促進(jìn)動(dòng)物分泌生長(zhǎng)素的作用。除了動(dòng)、植物外，早在20世紀(jì)末，有研究表明稀土元素對(duì)微生物的生長(zhǎng)也起到一定的作用，王燕等[7]通過(guò)研究稀土元素對(duì)谷氨酸發(fā)酵及谷氨酸脫氫酶的作用，發(fā)現(xiàn)稀土元素能促進(jìn)谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng)和酶活力。也有報(bào)道表明，稀土配合物對(duì)黑曲霉、黃曲霉等真菌的生長(zhǎng)有抑制作用。根據(jù)已有研究[8]，少量稀土可以作為一種生理激活劑，起到激活生物體內(nèi)生長(zhǎng)因子的作用，有關(guān)稀土生物效應(yīng)的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。因此，探究稀土元素對(duì)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的作用具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前生產(chǎn)L-酪氨酸最主要的方法為微生物發(fā)酵法[9]，該方法原材料廉價(jià)，且發(fā)酵成本低，原料易獲得，反應(yīng)所需能耗小，對(duì)環(huán)境污染很小。在合適的發(fā)酵條件下，菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵可直接獲得L-酪氨酸。大腸桿菌成為生產(chǎn)L-酪氨酸的主要微生物，主要是由于大腸桿菌具有生長(zhǎng)速率快、易于培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的理想菌株之一[10]?，F(xiàn)已有眾多科研人員開展了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸的研究[11]，但發(fā)酵技術(shù)仍然不成熟。針對(duì)發(fā)酵過(guò)程中生物量低、生產(chǎn)速率低、糖酸轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題，本研究以L-酪氨酸生產(chǎn)菌——大腸桿菌為供試菌株，探究稀土元素對(duì)該菌株的生長(zhǎng)及其合成產(chǎn)物的影響，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)初步確定了稀土元素的最適添加量以及生產(chǎn)L-酪氨酸的最適培養(yǎng)基的組成成分。

因此，為了緩解L-酪氨酸發(fā)酵后期菌體活力下降的問(wèn)題，本研究以La3+、Ce3+、Nd3+3種稀土元素為基礎(chǔ)，探究稀土元素對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響，并優(yōu)化其用量，為L(zhǎng)-酪氨酸及其他芳香族氨基酸的低成本、高效率工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-酪氨酸生產(chǎn)菌：大腸桿菌TYR-05（PT7-aroGfbr+PT7-tyrAfbrtyrB+PxylF-T7RNAP+ApheLA），天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖25 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸鹽2 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 2.5 g/L，KH2PO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO4·7H2O 1 mg/L，VH 0.5 mg/L，VB混0.5 mg/L，微量元素混合液1 mL/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L，酵母粉4 g/L，（NH4）2SO4 3 g/L，KH2PO4·3H2O 1.5 g/L，檸檬酸鹽1.8 g/L，蛋氨酸1 g/L，苯丙氨酸0.8 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 30 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VB混0.5 mg/L，微量元素混合液1.5 mL/L（除對(duì)稀土元素添加方式進(jìn)行探究外，其他成分均相同）。

1.3 主要儀器

Biotech-JG/JGY/BG發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40ES生物傳感分析儀 濟(jì)南延和生物科技有限公司；BT-4電子天平 深圳博途科技有限公司；75UV分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；MiniSpin 離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀、ZW型色譜柱溫箱 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；pH 計(jì)、Direct-Q3超純水機(jī) 美國(guó)Mettler Toledo公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

從－80 ℃冰箱中取出菌株，在超凈臺(tái)中于酒精燈火焰旁用接種環(huán)取3環(huán)于試管斜面上，于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h。

1.4.2 一級(jí)種子培養(yǎng)

待菌種活化好后，在超凈臺(tái)中于酒精燈火焰旁用接種環(huán)取3環(huán)于茄形瓶斜面培養(yǎng)基上，于32 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.4.3 二級(jí)種子培養(yǎng)

待一級(jí)種子活化好后，用滅菌的細(xì)菌水洗菌株，在發(fā)酵罐補(bǔ)料口于酒精燈火焰旁倒入發(fā)酵罐中，于36 ℃、pH 7.0中性環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)

當(dāng)菌體量OD600 nm達(dá)到要求時(shí)，按相應(yīng)要求的接種量放液，同時(shí)加入發(fā)酵培養(yǎng)基于發(fā)酵罐中，加入底糖，流加氨水來(lái)調(diào)節(jié)pH，使其維持在7.0～7.2，調(diào)節(jié)攪拌軸控制罐內(nèi)溶氧，調(diào)節(jié)通風(fēng)控制罐壓，使罐壓維持在0.04 MPa，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵周期35 h。

1.5 稀土元素添加控制發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在培養(yǎng)基成分和其他發(fā)酵條件不變的前提下，分別探究培養(yǎng)基中添加不同添加量的3種稀土元素對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響。

1.6 發(fā)酵檢測(cè)方法

1.6.1 發(fā)酵過(guò)程中pH的測(cè)定

采用Hamilton pH電極實(shí)時(shí)檢測(cè)，精密pH試紙輔助測(cè)定。

1.6.2 發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)堑臏y(cè)定

于罐中取樣，用離心機(jī)離心留上清液，將上清液稀釋100倍，用SBA-40ES生物傳感儀測(cè)定殘?zhí)呛俊?/p>

1.6.3 發(fā)酵過(guò)程中菌體量的測(cè)定

每2 h于發(fā)酵罐中取樣，吸取原樣稀釋相應(yīng)倍數(shù)，用75UV分光光度計(jì)測(cè)定菌體量，菌體量可用吸光度OD600 nm表示，其計(jì)算方式為：

菌體量=OD600 nm×稀釋倍數(shù)。

1.6.4 發(fā)酵過(guò)程中L-酪氨酸的測(cè)定

發(fā)酵開始，每2 h取樣，發(fā)酵液用pH 10～12的NaOH溶液稀釋一定倍數(shù)后，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾。高效液相色譜測(cè)定：層析柱：Phenomenex C18 110 （250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相1 mL/min 10%的乙腈;溫度30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同La3+添加量對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響

在5 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行不同La3+添加量的分批發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中每2 h測(cè)定菌體量（OD600 nm）、L-酪氨酸產(chǎn)量和最終的糖酸轉(zhuǎn)化率，按照不同濃度配比設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，稀土元素鑭添加量分別為0，40，80，120，160 mg/L[12]，從而確定最佳La3+添加量，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中L-酪氨酸產(chǎn)量、菌體量以及糖酸轉(zhuǎn)化率，明確不同La3+添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酸的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著La3+添加量的逐漸升高，菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加La3+時(shí)，菌體量為68.1，L-酪氨酸產(chǎn)量為51.8 g/L。當(dāng)La3+添加量為80 mg/L時(shí)，菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量分別為75.1和55.7 g/L，相比于空白組，二者分別提高了9.7%和7.1%。La3+添加量在0～80 mg/L時(shí)與菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量呈正相關(guān)，此時(shí)La3+添加量的升高影響了大腸桿菌的代謝能力，增強(qiáng)了菌體本身對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使菌體生長(zhǎng)速率加快，最終菌體量得到提高。此時(shí)La3+作為一種生理激活劑使代謝流更多地流向產(chǎn)物L(fēng)-酪氨酸的合成，L-酪氨酸的產(chǎn)量也得到提高。當(dāng)La3+添加量大于80 mg/L時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量逐漸下降，這是由于發(fā)酵液中的La3+添加量過(guò)多，對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用。La3+也會(huì)直接影響大腸桿菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)[13]，抑制產(chǎn)物合成，且這種抑制作用會(huì)隨著La3+添加量的進(jìn)一步提高而更加顯著。因此，培養(yǎng)基中添加80 mg/L的La3+對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵提升最大。

綜合結(jié)果來(lái)看，一定濃度的稀土元素鑭會(huì)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，而濃度過(guò)高反而會(huì)起到抑制作用，因此發(fā)酵時(shí)La3+的最適添加量為80 mg/L。

由表1可知，La3+添加量在80 mg/L時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率最高，為23.4%，相比于空白組提高了8.5%，且不同La3+添加量所對(duì)應(yīng)的耗糖量也是不同的，這是由于La3+添加量為80 mg/L時(shí)，La3+作為一種生理激活劑，起到激活生物體內(nèi)生長(zhǎng)因子的作用，增強(qiáng)菌體對(duì)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮源的吸收與利用，從而促進(jìn)菌體生長(zhǎng)[14]，使菌體消耗的葡萄糖更多地用于代謝產(chǎn)物的合成?？梢钥闯鱿蚺囵B(yǎng)基中添加La3+可以提高L-酪氨酸的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。所以，培養(yǎng)基中添加一定量的稀土元素鑭對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵有利。

2.2 不同Ce3+添加量對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0，2，4，6，8 mg/L的Ce3+，以菌體量、L-酪氨酸產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，探究不同Ce3+添加量對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)不添加Ce3+的菌體量為67.8，L-酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到51.4 g/L；當(dāng)Ce3+添加量為4 mg/L時(shí)為最佳添加量，菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量分別為69.3和54.6 g/L，相比于空白組分別提高了2.2%和5.9%。Ce3+添加量在0～4 mg/L時(shí)，隨著Ce3+添加量的升高，菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量也隨之增大。這是由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌細(xì)胞對(duì)Ce3+的敏感性較強(qiáng)，Ce3+可以增加大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性[15]，而且通透性增加的程度會(huì)隨著Ce3+添加量的增加而加劇。當(dāng)Ce3+添加量大于4 mg/L時(shí)，菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量也隨之下降，這是因?yàn)镃e3+同時(shí)參與了阻礙細(xì)胞生理代謝相關(guān)的酶促反應(yīng)，對(duì)菌體本身產(chǎn)生毒害作用，加速菌體的衰亡[15]。

在Ce3+添加量為4 mg/L時(shí)，L-酪氨酸產(chǎn)量高于傳統(tǒng)發(fā)酵方法，細(xì)胞膜通透性的增加會(huì)提高產(chǎn)物外排的能力，解除產(chǎn)物對(duì)關(guān)鍵酶的反饋抑制，L-酪氨酸得以積累。因此，在培養(yǎng)基中添加適量的Ce3+會(huì)增強(qiáng)菌株的產(chǎn)酸能力，進(jìn)而提高發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率。

由表2可知，沒有添加Ce3+的培養(yǎng)基糖酸轉(zhuǎn)化率僅為20.3%，而添加了Ce3+的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)較好，菌株達(dá)到了最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了22.9%，相對(duì)于空白組提升了11.4%，且在0～4 mg/L時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率隨著Ce3+添加量的升高而升高。

2.3 不同Nd3+添加量對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵中后期分別選擇0，0.3，0.6，0.9，1.2 mg/L的Nd3+進(jìn)行L-酪氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后的菌體量、L-酪氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，通過(guò)對(duì)比確定最適的Nd3+添加量，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，空白組即不添加Nd3+的菌體量為73.4，L-酪氨酸產(chǎn)量為52.1 g/L；Nd3+添加量為0.6 mg/L時(shí)，菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量均達(dá)到最大，分別為75.1和54.3 g/L，相比于空白組分別提升了2.3%和4.1%。添加Nd3+后，菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量隨著Nd3+添加量的增加而增大，Nd3+能夠延長(zhǎng)菌體的穩(wěn)定期，提高菌體的活力，降低發(fā)酵后期菌體裂解的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)能夠促進(jìn)輔酶Q及細(xì)胞DNA和RNA的生物合成，并能調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)維生素等生長(zhǎng)因子的吸收與消耗，從而促進(jìn)細(xì)菌的增殖[16]。而過(guò)多的Nd3+會(huì)與細(xì)菌DNA發(fā)生作用，使DNA斷裂，使其不能完成基本的代謝活性，菌體活力下降，降低L-酪氨酸的產(chǎn)量[17]。因此，選擇0.6 mg/L Nd3+為最適添加量。

由表3可知，Nd3+添加量為0.6 mg/L時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率最大，為22.5%，相比于不添加Nd3+提高了6.2%。隨著Nd3+添加量的增加，細(xì)胞膜的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)靡约訌?qiáng)，細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力增強(qiáng)，糖酸轉(zhuǎn)化率也隨之增加。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

通過(guò)上述單因素實(shí)驗(yàn)，本研究確定了La3+、Ce3+、Nd3+的最佳添加量分別為80，4，0.6 mg/L。采用菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量為考核指標(biāo)，以L9（34）為正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)（見表4），A為L(zhǎng)a3+添加量，B為Ce3+添加量，C為Nd3+添加量，探究發(fā)酵中的菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量情況。菌體量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6；L-酪氨酸產(chǎn)量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，方差分析見表8。

結(jié)合菌體量的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差（R）分析可知，3種因素對(duì)于菌體量而言，影響順序?yàn)锳＞B＞C，即La3+>Ce3+>Nd3+，通過(guò)比較3個(gè)因素的均值大小，即最大均值對(duì)應(yīng)最佳添加量，得到最佳添加組合為A2B1C1，即La3+最佳添加量為80 mg/L，Ce3+最佳添加量為2 mg/L，Nd3+最佳添加量為0.3 mg/L。

綜合產(chǎn)量的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差（R）分析可知，3種因素對(duì)于產(chǎn)量而言，影響順序?yàn)镃>A>B，即Nd3+>La3+>Ce3+；由均值結(jié)果可知，最佳添加量組合為A2B2C3，即La3+添加量為80 mg/L，Ce3+添加量為4 mg/L，Nd3+添加量為0.9 mg/L。

本研究通過(guò)對(duì)菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，La3+和Ce3+添加量對(duì)發(fā)酵菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量均有極顯著影響，而Nd3+添加量?jī)H對(duì)菌體量有顯著影響，為了達(dá)到既保證菌體量又促進(jìn)L-酪氨酸生產(chǎn)的目的，選擇La3+添加量80 mg/L、Ce3+添加量2 mg/L、Nd3+添加量0.3 mg/L為稀土元素的最佳添加量。

2.5 最適稀土元素添加量與常規(guī)發(fā)酵的對(duì)比驗(yàn)證

傳統(tǒng)的L-酪氨酸發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵中期L-酪氨酸的產(chǎn)酸速率達(dá)到最大，但持續(xù)時(shí)間較短，發(fā)酵后期隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，L-酪氨酸的產(chǎn)酸速率出現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)，分析原因可能是發(fā)酵后期菌體逐漸衰亡，對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力減弱。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了3種不同稀土元素的最優(yōu)添加量，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到了最佳添加量組合，為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可行性，在其他培養(yǎng)基條件一致的情況下，以不添加稀土元素的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以La3+、Ce3+、Nd3+分別添加80，2，0.3 mg/L為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)一步探究稀土元素及添加量的優(yōu)化效果，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，添加了最適稀土元素的對(duì)照組菌體量、產(chǎn)量和耗糖速率均大于空白組，其中對(duì)照組菌體量和產(chǎn)量分別達(dá)到75.6和52.9 g/L，相對(duì)于空白組提高了8.1%和3.8%；對(duì)照組在20 h時(shí)耗糖速率最大，為13.2 g/（h·L），而空白組最大耗糖速率出現(xiàn)在16 h時(shí)，為10.2 g/（h·L）。在對(duì)照組的發(fā)酵過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)旺盛，菌體活力高，耗糖速率大，產(chǎn)酸多，因此糖酸轉(zhuǎn)化率高于空白組。由此可見，稀土元素的添加提高了菌體本身對(duì)葡萄糖的利用率，解決了L-酪氨酸發(fā)酵后期菌體活力不足、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力弱的問(wèn)題，為L(zhǎng)-酪氨酸大規(guī)模生產(chǎn)提供了有利的依據(jù)。

2.6 不同稀土元素添加方式對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響

根據(jù)上述2.4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出稀土元素添加量的最佳組合為L(zhǎng)a3+添加量80 mg/L、Ce3+添加量2 mg/L、Nd3+添加量0.3 mg/L。根據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，發(fā)酵過(guò)程一次性補(bǔ)加稀土元素會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生抑制，為了解決這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用表9中3種發(fā)酵方式進(jìn)行L-酪氨酸生產(chǎn)，并對(duì)其發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，采用傳統(tǒng)發(fā)酵方式生產(chǎn)L-酪氨酸時(shí)，最大菌體量為71.6，L-酪氨酸產(chǎn)量為50.3 g/L。采用一次性補(bǔ)加發(fā)酵方式的最大菌體量為76.5，L-酪氨酸產(chǎn)量為53.2 g/L，相比于傳統(tǒng)發(fā)酵分別提高了6.4%和5.5%。采用流加發(fā)酵方式的最大菌體量為80.3，L-酪氨酸產(chǎn)量為55.7 g/L，相比于傳統(tǒng)發(fā)酵分別提高了10.8%和9.7%。可能是在向發(fā)酵底物中加入稀土元素后，稀土元素能夠改變細(xì)胞膜的通透性，增強(qiáng)了細(xì)胞主動(dòng)運(yùn)輸或被動(dòng)擴(kuò)散的能力，加快了菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高了菌體自身的活力，加快了菌體生長(zhǎng)，從而提高了L-酪氨酸的產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量，但一次性補(bǔ)加稀土元素會(huì)在發(fā)酵初期菌體量較少時(shí)對(duì)菌體產(chǎn)生一定的抑制作用，延長(zhǎng)菌體的延滯期，從而降低菌體的生長(zhǎng)速率[18]。

由上述結(jié)果可知，采用流加稀土元素發(fā)酵的方式對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵起到了促進(jìn)作用，分析原因?yàn)榧訌?qiáng)了大腸桿菌的磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，使菌體對(duì)葡萄糖的攝取能力提高；同時(shí)磷酸烯醇式丙酮酸合成酶是L-酪氨酸中心代謝途徑的關(guān)鍵酶[19]，而稀土元素作為一種生理激活劑增加了此酶的活性，使葡萄糖更多地流向產(chǎn)物，從而促進(jìn)了L-酪氨酸產(chǎn)量的提高。

3 結(jié)論

在大腸桿菌發(fā)酵法產(chǎn)L-酪氨酸的研究中，其產(chǎn)酸量與糖酸轉(zhuǎn)化率是大規(guī)模生產(chǎn)需要控制的重要指標(biāo)，本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別確定了最佳La3+添加量為80 mg/L，最佳Ce3+添加量為4 mg/L，最佳Nd3+添加量為0.6 mg/L；通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出3種不同稀土元素的最佳組合為L(zhǎng)a3+80 mg/L、Ce3+2 mg/L、Nd3+0.3 mg/L；最終對(duì)稀土元素的添加方式進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用流加補(bǔ)料對(duì)提升L-酪氨酸發(fā)酵的菌體量、產(chǎn)酸量、糖酸轉(zhuǎn)化率影響最顯著，且采用發(fā)酵各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到最優(yōu)。在此條件下，最大菌體量為80.3，與傳統(tǒng)發(fā)酵方式相比提高了10.8%；產(chǎn)酸量達(dá)到55.7 g/L，相比傳統(tǒng)發(fā)酵方式提高了9.7%；糖酸轉(zhuǎn)化率提高至23.4%。大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中容易被環(huán)境以及營(yíng)養(yǎng)條件所影響，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知La3+能增強(qiáng)菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取能力；Ce3+能增加細(xì)胞膜的通透性；Nd3+能延長(zhǎng)菌體的穩(wěn)定期，提高菌體的活力。通過(guò)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基成分，添加一定濃度的稀土元素，從而提高其產(chǎn)酸能力，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)L-酪氨酸具有一定的參考價(jià)值。

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收稿日期：2023-06-25

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021BDE92007）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021ZDSYS10）

作者簡(jiǎn)介：王碩（1999—），男，碩士研究生，研究方向：代謝控制發(fā)酵。

*通信作者：徐慶陽(yáng)（1980—），男，副研究員，博士，研究方向：代謝控制發(fā)酵。