楊玉娟，封 雅

(蘇州華測安評技術(shù)服務(wù)有限公司，江蘇 蘇州 215121)

2甲4氯異辛酯為苯氧乙酸類除草劑，主要登記作物為冬小麥田，大豆田，小麥田，春小麥田，春玉米田，水稻田(直播)，高粱田等，用于防治一年生和多年生闊葉雜草，其主要具有較強(qiáng)的內(nèi)吸傳導(dǎo)性，能穿過角質(zhì)層和細(xì)胞膜，迅速傳導(dǎo)至雜草各個部位，最后引起全株死亡[1]。FAO 在2甲4氯評估報告指出2甲4氯異辛酯在小麥中很容易被水解為2甲4氯，其可與葡萄糖等形成共軛物[2]，董見南等在研究小麥中2甲4氯異辛酯的殘留及代謝轉(zhuǎn)化時也發(fā)現(xiàn)2甲4氯異辛酯在小麥植株體內(nèi)可快速代謝為2甲4氯，消解半衰期為1.1～3 d[3]。2甲4氯亦是苯氧乙酸類除草劑，通常以鹽、胺鹽或酯來配制和使用，均為低毒農(nóng)藥，但隨著該類農(nóng)藥的廣泛使用其帶來的食品農(nóng)藥殘留、水土污染問題亦不能忽視。目前我國規(guī)定小麥中2甲4氯和2甲4氯異辛酯臨時殘留限量均為0.1 mg/kg[4]，日本小麥中2甲4氯殘留限量為0.04 mg/kg(酯、鹽等)[5]，歐盟規(guī)定小麥2甲4氯殘留限量為0.2 mg/kg (包括鹽、酯、共軛物)[6]。

目前國內(nèi)外對2甲4氯異辛酯的測定方法主要為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和氣相色譜，其代謝產(chǎn)物2甲4氯的測定方法主要為高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[7-12]?！掇r(nóng)藥登記殘留試驗待測殘留物和植物源性食品膳食風(fēng)險評估殘留物目錄(2021版)(征求意見稿)》中2甲4氯異辛酯的殘留物定義為2甲4氯異辛酯、2甲4氯及其共軛物之和，要求檢測過程加堿水解釋放共軛物，膳食風(fēng)險評估采用2甲4氯計算ADI(每日容許攝入量)[13]。但2甲4氯異辛酯遇酸、堿分解[14]，若二者獨立測定，在測定樣品時加堿水解釋放共軛物時會引起2甲4氯異辛酯水解造成二者含量結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，加堿將2甲4氯異辛酯徹底水解為2甲4氯，并釋放2甲4氯的共軛物，HPLC-MS/MS儀器測定結(jié)果為2甲4氯含量，能夠滿足2甲4氯異辛酯在農(nóng)藥登記試驗的膳食風(fēng)險評估要求。聶春林等采用甲醇-氫氧化鈉提取并堿解小麥籽粒和秸稈中的2甲4氯異辛酯，高效液相色譜測定2甲4氯含量的方法，表明將2甲4氯異辛酯堿解為2甲4氯的方法可行，轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%～102%。但該方法提取和凈化過程較為復(fù)雜，采用液相色譜儀檢測，靈敏度較低，檢測時間較長[15]。本文中籽粒和秸稈樣品通過0.1%甲酸乙腈提取、氫氧化鈉堿解的方法將2甲4氯異辛酯和2甲4氯共軛物均轉(zhuǎn)變?yōu)?甲4氯，樣品經(jīng)GCB和PSA凈化后采用HPLC-MS/MS檢測，檢測過程簡單快捷，回收率好、靈敏度較高，適用于小麥籽粒和秸稈中2甲4氯異辛酯和代謝產(chǎn)物2甲4氯及其共軛物的殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 美國AB SCIEX Triple quad 4500液質(zhì)聯(lián)用儀，瑞士梅特勒XS205DU電子天平；常州普天儀器制造有限公司MS200多管漩渦混合儀；湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司L550離心機(jī)；普蘭德移液器(100 μL～5 mL)；Milli-Q Academic超純水儀等。

試劑和材料 2甲4氯異辛酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度93.43%；2甲4氯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.7%；乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；氯化鈉(分析純)；無水硫酸鎂(分析純)；鹽酸(分析純，36.0%～38.0%)；氫氧化鈉(分析純)；GCB凈化劑(石墨化碳黑)；PSA凈化劑(N-丙基乙二胺)，0.22 μm PTFE親水性濾膜，50 mL和2 mL離心管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗樣品 采集江蘇蘇州小麥籽粒和秸稈空白樣品，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后制備成空白實驗室樣品。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取18.81 mg的2甲4氯異辛酯和12.92 mg的2甲4氯標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成濃度分別為1 757 mg/L(標(biāo)準(zhǔn)品純度為93.43%)的2甲4氯異辛酯和1 292 mg/L 2甲4氯標(biāo)準(zhǔn)儲備液。按照2甲4氯異辛酯相對分子量312.8，2甲4氯相對分子量200.6，2甲4氯異辛酯以2甲4氯計濃度為1 126 mg/L。

1.2.3 樣品處理 提取：分別稱取2.5 g籽粒、秸稈樣品(精確至0.01 g，偏差±0.02 g)于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈溶液(秸稈先加入10 mL水潤濕)，2 500 rpm渦旋提取10 min，加入約0.5 g NaCl和約1 g無水MgSO4(秸稈加入約1 g NaCl和約2 g無水MgSO4)，2 500 rpm渦旋提取5 min，4 000 rpm離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液。

堿解：在上清液中加入2 mL (秸稈2.5 mL)0.25 mol/L的NaoH溶液，2 500 rpm渦旋堿解15 min(秸稈堿解30 min)后加入1 mL 1mol/L的鹽酸溶液，2 500 rpm渦旋5 min，加入約1 g NaCl和約2 g無水MgSO4，2 500 rpm渦旋5 min，然后4 000 rpm離心5 min，上清液待凈化。

凈化：移取上清液1 mL，加入20 mg GCB(秸稈加入約20 mg GCB和7 mg PSA)，籽粒渦旋30 s后靜置，秸稈渦旋15 s后盡快過濾膜。上清液過0.22 μm親水PTFE濾膜，供HPLC-MS/MS分析測定。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 um)；柱溫：40°C；進(jìn)樣量2 μL；流動相：0.1%甲酸溶液(A)：乙腈(B)，梯度洗脫條件(表1)。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫條件

1.2.5 質(zhì)譜條件 離子源：ESI，負(fù)離子模式。電噴霧離子源溫度550℃，電噴霧電壓4.5 kV，氣簾氣30 psi，霧化氣GS1：55psi，輔助氣GS2：55 psi。質(zhì)譜參數(shù)(表2)。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 2甲4氯異辛酯轉(zhuǎn)化為2甲4氯的轉(zhuǎn)化率將2甲4氯異辛酯(以2甲4氯計)用10 mL 0.1%甲酸乙腈配制成濃度為1、5、10、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)置一個空白樣品(0.1%甲酸乙腈)，經(jīng)1.2方法中籽粒的前處理方法進(jìn)行提取、堿解和凈化處理后上機(jī)。采用經(jīng)過前處理的空白溶液配制2甲4氯系列標(biāo)溶液對以上2甲4氯異辛酯樣品結(jié)果進(jìn)行定量，比較二者峰面積，結(jié)果表明2甲4氯異辛酯(以2甲4氯計)在1～100 μg/L范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化為2甲4氯的為93%～99%(表3)，表明經(jīng)1.2試驗方法，2甲4氯異辛酯可完全轉(zhuǎn)化為2甲4氯。

表3 2甲4氯異辛酯轉(zhuǎn)化率

2.2 提取和堿解 常用的提取試劑為乙腈、甲醇等，甲醇不利于后續(xù)的鹽分層，因此本研究主要采用乙腈作為提取試劑。借鑒聶春林等采用甲醇-0.25 mol/L NaOH作為提取試劑[15]，筆者初期試驗也考慮采用提取和堿解一體的方式，在純?nèi)軇╇A段提取和堿解一體是可行的，但加入樣品基質(zhì)后，堿解對小麥樣品的破壞力較大，基質(zhì)效應(yīng)明顯，易污染儀器，造成結(jié)果不穩(wěn)定，因此采用先提取再堿解的前處理方法。樣品提取溶劑選取過程中比較乙腈、0.1%甲酸乙腈和0.25 mol/L NaOH∶乙腈(1∶5)提取劑，發(fā)現(xiàn)籽粒樣品添加2甲4氯標(biāo)準(zhǔn)品后經(jīng)0.25 mol/L NaOH∶乙腈(1∶5)提取為經(jīng)0.1%甲酸乙腈提取的峰面積的1/3，因此本研究采用0.1%甲酸乙腈作為提取劑。堿解時間及加堿量，多次試驗表明秸稈樣品需要較長的堿解時間才可達(dá)到較為滿意的回收率，因此秸稈樣品堿解過程中的加堿量和堿解時間較籽粒樣品多。

2.3 凈化劑選擇 常用的凈化劑包括C18(十八烷基鍵合硅膠)、PSA、GCB，GCB對色素有較 強(qiáng)的吸附能力，PSA對脂肪酸、有機(jī)酸、糖類及部分親脂的色素有吸附能力，C18主要對脂肪等非極性化合物有吸附能力[16]。本研究通過在籽粒中添加 0.01 mg /kg 的2甲4氯對以上3種凈化劑凈化結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對2甲4氯的吸附能力順序為C18>PSA>GCB，因此本研究采用GCB凈化籽粒上清液。而秸稈上清液僅用GCB凈化后效果略差，凈化后仍有明顯的顏色，而加入少量PSA后，樣品液顏色變淺，可能是PSA有助于去除部分親脂的色素和其他的一些物質(zhì)，減少干擾，可以確?；厥章瘦^好，因此本研究采用GCB和PSA兩種凈化劑凈化秸稈上清液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng) 分別采用乙腈溶劑、籽?；|(zhì)空白和秸稈基質(zhì)空白配制2甲4氯溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線、籽粒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和秸稈基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍均為1～100 μg/L。通過濃度和峰面積的做回歸曲線后進(jìn)行定量并計算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線、籽粒和秸稈基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均>0.999(表4)。

表4 2甲4氯在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比(k)來評價基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)k>1.1時為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，k<0.9時為基質(zhì)減弱效應(yīng)，而當(dāng)k在0.9～1.1之間時為基質(zhì)效應(yīng)不明顯，本試驗籽粒和秸稈基質(zhì)效應(yīng)(表4)，結(jié)果顯示2甲4氯在籽粒中呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，在秸稈中基質(zhì)效應(yīng)不明顯。為保證試驗定量結(jié)果準(zhǔn)確性，本方法均采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 方法的回收率和精密度 稱取已粉碎混勻的籽粒和秸稈空白樣品2.5 g，使樣品中2甲4氯異辛酯或者2甲4氯的濃度分別為0.02、0.5和5 mg/kg，靜置30 min，均設(shè)置5個平行，另設(shè)空白(用于空白試驗和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制)。按照1.2.3進(jìn)行前處理和分析測定，計算回收率和精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)，結(jié)果(表5)。2甲4氯異辛酯在0.02、0.5 和5 mg/kg的添加水平下，籽粒的回收率分別為96%、87%、93%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.6%、4.6%、3.3%，秸稈的回收率分別為91%、91%、86%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.1%、3.4%、4.7%。2甲4氯在0.02、0.5和5 mg/kg的添加水平下，籽粒的回收率分別為94%、102%、106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.1%、3.3%、3.9%，秸稈的回收率分別為98%、102%、100%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.0%、4.8%、6.3%；另溶劑空白在標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)位置的信號應(yīng)無響應(yīng)，籽粒和秸稈基質(zhì)空白在標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)位置峰面積均低于最低定量限的30%，以上試驗結(jié)果表明本方法符合農(nóng)藥殘留分析方法NY/T 788-2018要求[17]。溶劑空白、籽粒和秸稈空白色譜圖(圖1～3)。本方法小麥籽粒和秸稈中2甲4氯和2甲4氯異辛酯定量限濃度均為0.02 mg/kg，典型譜圖(圖4～7)。

圖1 溶劑空白

圖2 秸稈基質(zhì)空白

圖3 籽?；|(zhì)空白

圖4 秸稈中2甲4氯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

圖5 籽粒中2甲4氯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

圖6 秸稈中2甲4氯異辛酯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

圖7 籽粒中2甲4氯異辛酯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

表5 2甲4氯異辛酯和2甲4氯在小麥籽粒和秸稈中的添加回收率(n=5)

3 結(jié)論

本研究結(jié)合QuEChERS前處理方法和堿解衍生技術(shù)，將小麥籽粒和秸稈中的2甲4氯異辛酯水解為2甲4氯并釋放2甲4氯共軛物，建立了一種檢測小麥樣品中2甲4氯異辛酯和2甲4氯及其共軛物殘留的HPLC-MS/MS 檢測方法，定量限為0.02 mg/kg，該方法回收率和精密度等符合農(nóng)藥殘留檢測分析的要求，檢測過程簡單快捷，可應(yīng)用于大量小麥樣品中2甲4氯異辛酯和代謝產(chǎn)物2甲4氯及其共軛物的殘留檢測，為2甲4氯異辛酯在小麥中的膳食風(fēng)險評估提供更為便捷的檢測方法。