陶菊紅，李亞娟，季向東，張 濤

(1.常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 常熟 215500; 2.常熟理工學(xué)院端木銀熙水稻育種研究推廣中心,江蘇 常熟 215500; 3.常熟市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,江蘇 常熟 215500)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，然而，水稻生產(chǎn)受到稻瘟病(rice blast)、紋章枯萎病(sheath blight)、白葉枯病(bacterial blight)和病毒性疾病等各種疾病的制約[1]，其中稻瘟菌引起的稻瘟病是影響水稻可持續(xù)生產(chǎn)最致命的疾病之一[2]。全世界超過85個(gè)國家發(fā)現(xiàn)有稻瘟病菌危害，每年因稻瘟病而造成了全球約30%的水稻產(chǎn)量損失，相當(dāng)于可以養(yǎng)活6000萬人[3-4]。

稻瘟菌是一種子囊菌真菌，病變主要發(fā)生在葉領(lǐng)、莖稈、莖稈節(jié)、穗頸節(jié)，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。對孟加拉國3個(gè)芳香水稻品種穗頸瘟感染的研究顯示籽粒不育率提高，籽粒大小和產(chǎn)量下降，而且種子產(chǎn)量和質(zhì)量的下降程度與感染病菌的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]。育種過程中，抗性水稻品種的選育和栽培是控制稻瘟病菌感染和穩(wěn)定產(chǎn)量最有效方法[9]，比如中國水稻研究所應(yīng)用分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)將Pita、Pib和Pid2導(dǎo)入高感品種鹽豐47中，選育出高抗品種鹽粳144，其產(chǎn)量和外觀品質(zhì)明顯提高[10]。盡管稻瘟病菌感染會危害水稻產(chǎn)量已經(jīng)成為共識，且科學(xué)家們利用現(xiàn)代分子育種手段導(dǎo)入稻瘟病抗性基因改良優(yōu)良水稻種質(zhì)資源的經(jīng)驗(yàn)逐漸成熟，但稻瘟病菌對大米品質(zhì)尤其是食味品質(zhì)的影響報(bào)道較少。

常香粳1813是優(yōu)良食味中熟晚粳，是常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所2020年通過江蘇省審定品種，具有良好的應(yīng)用前景。本研究通過對常香粳1813基因組稻瘟病抗性基因鑒定，并對其孕穗期幼穗進(jìn)行稻瘟病菌接種試驗(yàn)，檢測成熟期種子千粒重、長寬比，以及大米加工品質(zhì)、食味品質(zhì)各參數(shù)變化情況，分析稻瘟病菌感染對種子生產(chǎn)和大米品質(zhì)的影響，進(jìn)而為抗病育種和優(yōu)質(zhì)稻米品種的選育和推廣提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用的種質(zhì)材料為常香粳1813，是常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育品種，對照組和試驗(yàn)組于2022年種植于常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水稻育種創(chuàng)新基地，統(tǒng)一水肥管理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了研究稻瘟病菌感染后對種子產(chǎn)量和大米品質(zhì)的影響，對孕穗期的常香粳1813進(jìn)行了稻瘟病菌(江蘇省內(nèi)稻瘟病菌優(yōu)勢小種的代表菌株混合液)接種試驗(yàn)。接種后50 d，空白對照組種子成熟。收取試驗(yàn)組(接種稻瘟病菌)和空白對照組葉片、稻穗進(jìn)行觀察以及種子千粒重、長、寬等參數(shù)分析；隨后對試驗(yàn)組和對照組谷粒進(jìn)行了糙米、精米加工，對兩者糙米率、整精米率、堊白率、堊白度等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了分析；最后檢測了試驗(yàn)組和對照組大米的總蛋白、總脂肪、總淀粉和直鏈淀粉的含量，探索稻瘟病感染對常香粳1813大米食味的影響。

1.3 基因組測序和分析

用常香粳1813的幼苗進(jìn)行了全基因組測序(安諾基因，北京)，開展了生物信息學(xué)分析，對其所有基因進(jìn)行了組裝和基因注釋(烈冰生物，上海)。

1.4 稻瘟病菌接種和抗性水平評價(jià)

常香粳1813試驗(yàn)組和對照組稻瘟病菌接種和抗性評價(jià)方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.5 千粒重測定

谷粒千粒重、長、寬、長寬比均通過SC-G型考種及千粒重自動分析儀(萬深，杭州)進(jìn)行測定，每個(gè)測定重復(fù)5組。

1.6 稻米品質(zhì)分析

利用大米外觀品質(zhì)檢測分析儀(萬深，杭州)分析大米的外觀品質(zhì)和加工品質(zhì)，包括長寬比、堊白粒率、堊白度、糙米率、精米率。糙米率和精米率的分析參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5495-2008《稻谷出糙率檢驗(yàn)》和GB/T 21719-2008《稻谷整精米率檢驗(yàn)法》。

1.7 稻米總蛋白含量測定

稱取精米粉沫(60目篩)試樣0.2 g左右，置于100 mL消煮管中(勿將樣品黏附在瓶頸上)。加入5 mL濃硫酸，輕輕搖勻并放置數(shù)小時(shí)。加入適量雙氧水，在管口放一彎頸小漏斗，在消煮爐上380℃消煮。1 h取下稍冷，加雙氧水 1 mL，重復(fù)2～3次，消煮到溶液呈無色或清亮后，再加熱5～10 min，以除盡剩余的雙氧水。將消煮管取下至冷卻，并用少量水沖洗彎頸漏斗，洗液流入消煮管。將消煮液無損的洗入50 mL容量瓶中，混勻待測。另外做3個(gè)空白。

蒸餾前配制好氫氧化鈉、硫酸標(biāo)準(zhǔn)液、混合指示劑，對定氮儀進(jìn)行充分預(yù)熱，進(jìn)行空蒸餾清洗管道，直至讀數(shù)穩(wěn)定。吸取上述待測液5.00 mL，注入凱氏定氮儀(沛歐，上海)蒸餾管中，參數(shù)設(shè)置后，對待測液進(jìn)行測定。

樣品中蛋白質(zhì)含量可根據(jù)公式計(jì)算：

注：V1為滴定體積(mL)；V2為空白滴定體積(mL)；V3為消解定容體積(mL)；6.25為氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)；0.01為硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol·L-1)；0.01401為每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)；V4為取液體積(mL)；M為樣品質(zhì)量(g)。

1.8 稻米總脂肪含量測定

稱取精米粉末(60目篩)試樣2～5 g，準(zhǔn)確至0.001 g，全部移入濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒放入索氏抽提器(菲躍，杭州)的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入無水乙醚或石油醚至瓶內(nèi)容積的2/3處，于水浴上加熱，使無水乙醚或石油醚不斷回流抽提(6～8次·h-1)，一般抽提6～10 h。提取結(jié)束時(shí)，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上無油斑表明提取完畢。稱量取下接收瓶，回收無水乙醚或石油醚，待接收瓶內(nèi)溶劑剩余1～2 mL時(shí)在水浴上蒸干，再于(100±5)℃干燥1 h，放干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量。重復(fù)以上操作直至恒重(直至兩次稱量的差不超過2 mg)。

樣品中粗脂肪含量可根據(jù)公式計(jì)算：

注：M1為烘干后總質(zhì)量(g)；M2為空瓶質(zhì)量(g)；M3為樣品質(zhì)量(g)。

1.9 稻米總淀粉含量測定

取干凈的15 mL離心管，稱約50 mg干樣(60目)，準(zhǔn)確至0.001 g，加2 mL 80%乙醇，混勻，70℃放置2 h，其間渦旋混勻，取出冷卻至室溫。加2 mL去離子水，混勻，12000 r·min-1離心10 min，棄上清。加4 mL 80%乙醇，混勻，12000 r·min-1離心10 min，棄上清，重復(fù)2次。加入2 mL 2 mol·L-1氫氧化鉀，用手將離心管上下顛倒混勻，置于冰上搖20 min。加入8 mL 1.2 mol·L-1的醋酸鈉緩沖溶液(pH=3.8)，渦旋均勻。加入0.1 mL耐熱α-淀粉酶，再加入0.1 mL淀粉葡糖苷酶，渦旋均勻，置于50℃水浴鍋中，孵育30 min，其間間斷渦旋均勻。用蒸餾水將0.1 mL樣品稀釋至1 mL，取液體0.05 mL至新的EP管中，加入1.5 mL GOPOD試劑，渦旋混勻，于50℃下孵育20 min。同時(shí)取0.05 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1.5 mL GOPOD試劑，50℃反應(yīng)20 min，510 nm處測定吸光度。

樣品中總淀粉含量可根據(jù)以下公式計(jì)算：

注：ΔA為樣品OD值減去空白OD值；F為葡萄糖的OD值；M為樣品質(zhì)量；90為換算系數(shù)。

1.10 稻米直鏈淀粉含量測定

取干凈的15 mL離心管，稱取適量樣本(約10 mg)。加入100 μL 95%酒精，900 μL NaOH溶液，渦旋混勻。沸水煮13 min，待冷卻后定容至10 mL，搖勻后靜置10 min。取干凈的15 mL離心管，依次加入0.5 mL上清，0.1 mL乙酸和0.2 mL碘化鉀溶液，定容至10 mL，室溫避光放置10 min，620 nm處測定吸光值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：稱取直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)樣各10 mg，加入0.1 mL酒精和0.9 mL NaOH，沸水煮10 min，冷卻后定容至10 mL。按如下比例混勻(表1)，取混樣0.5 mL加入離心管，按測定方法同樣品一起測定。

表1 淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液配方

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用SigmaPlot 12.0分析，用GraphPad Prism 6.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組之間的顯著性差異用Student′st和one-way ANOVA檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05視作差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 常香粳1813稻瘟病抗性基因分析

根據(jù)序列比對結(jié)果和現(xiàn)有稻瘟病抗性基因功能位點(diǎn)報(bào)道，常香粳1813中Pid2(LOC_Os06g29810)、Pid3(LOC_Os06g22460)和Pib(LOC_Os02g57305)基因?qū)儆诘疚敛】剐曰?，而Bsr-d1(LOC_Os03g32230)、Pita(LOC_Os12g18360)、Pit(LOC_Os01g05620)、Pi21(LOC_Os04g32850)、Pi37(LOC_Os01g57310)、Pi36(LOC_Os08g05440)、Pita2(LOC_Os12g18729)、Pish(LOC_Os01g57340)則對稻瘟病菌無抗性。

2.2 稻瘟病菌感染后常香粳1813種子產(chǎn)量和質(zhì)量變化分析

由圖1可知，試驗(yàn)組劍葉表面有明顯的褐色病斑，且葉片頂部干枯面積較對照組明顯大(圖1A)。試驗(yàn)組稻穗頂部一些谷粒明顯干秕，而中下部灌漿的谷粒外稃表面有明顯的褐色斑點(diǎn)(圖1B和1C)。同時(shí)，對這些灌漿的谷粒進(jìn)行了千粒重和長寬比分析，結(jié)果顯示試驗(yàn)組和對照組谷粒的千粒重分別約為19.98 g和23.42 g，且顯著性分析顯示試驗(yàn)組較對照組顯著下降；而兩者長寬比分別約為2.27和2.23，試驗(yàn)組較對照組顯著上升(P<0.05)(圖2)。

注：(A)稻瘟病菌感染后葉片出現(xiàn)銹斑和干枯現(xiàn)象。(B)稻瘟病菌感染后稻穗頂部有明顯的秕谷，稻谷外稃有明顯的銹斑。箭頭指示秕谷。(C)稻瘟病菌感染后谷粒外觀比較。A和C中標(biāo)尺為3.5 cm，B中標(biāo)尺為3 cm

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)

2.3 稻瘟病菌感染后常香粳1813大米加工品質(zhì)分析

由圖3可知，和對照組比較，試驗(yàn)組加工后的精米色澤稍發(fā)黃。由圖4可知，試驗(yàn)組大米的出糙率和整精米率分別約為0.80和0.68，而對照組分別為0.84和0.70，顯著性分析試驗(yàn)組出糙率和整精米率都顯著低于對照組；且同谷粒長寬比情況相似，試驗(yàn)組大米長寬比同樣顯著高于對照組(P<0.05)。由圖5可知，試驗(yàn)組和對照組加工整精米的堊白度分別約為5.51和2.14，且兩者差異顯著(P<0.05)，但兩者堊白率無顯著差別。

注：圖中標(biāo)尺為3 cm。

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)

2.4 稻瘟病菌感染后常香粳1813大米主要物質(zhì)含量發(fā)生變化

由圖6可知，常香粳1813試驗(yàn)組和對照組總脂肪含量分別約為0.38%和0.80%(圖6A)，而兩者總蛋白含量分別約為88.11 g·kg-1和66.03 g·kg-1(圖6B)，總淀粉含量分別約為75.98%和80.76%(圖6C)，而兩者直鏈淀粉含量分別約為7.93%和9.15%(圖6C)，顯著性分析發(fā)現(xiàn)兩者這些參數(shù)差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)

3 討論與結(jié)論

稻瘟病是最嚴(yán)重的水稻病害之一，由于稻瘟病菌的不穩(wěn)定性，全球水稻生產(chǎn)受到稻瘟病的威脅一直沒有解除[12]。利用經(jīng)典的植物育種技術(shù)，育種家已經(jīng)開發(fā)出了許多適應(yīng)全球不同水稻種植地區(qū)的抗稻瘟病品種。常香粳1813是適宜江蘇省沿江和蘇南稻區(qū)種植的香軟米水稻品種，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，常香粳1813基因組含有Pid2、Pid3和Pib稻瘟病抗性基因。其中Pib基因?qū)|南亞稻瘟病菌小種具有廣譜抗性[13-14]，Pid2和Pid3則對特異性稻瘟病菌小種有抗性[15-17]。因此，常香粳1813基因組中多個(gè)稻瘟病抗性基因的存在，使常香粳1813對稻瘟病菌具備一定免疫抗性，并順利通過江蘇省品種審定。

水稻穗瘟對糧食生產(chǎn)造成的損失最為嚴(yán)重[18-19]。對常香粳1813孕穗期幼穗接種稻瘟病菌后，雖然常香粳1813表現(xiàn)出明顯的抗性，但其穗頂部仍有一小部分癟粒，且中下部谷粒外稃表面有明顯的褐色病斑，千粒重下降，谷粒長寬比上升，說明稻瘟病菌感染對其灌漿過程有明顯的影響，谷粒不夠飽滿。這進(jìn)一步證實(shí)稻瘟病會造成種子產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[8，20]。

本研究中，試驗(yàn)組大米色澤變暗黃，出糙率和精米率顯著下降，而堊白度和長寬比顯著上升，說明常香粳1813感染稻瘟病菌后大米的加工品質(zhì)明顯下降。蛋白質(zhì)含量、淀粉含量和結(jié)構(gòu)有顯著的功能特征，能夠很好地指示大米食味性能[21]，本研究中試驗(yàn)組大米的總蛋白含量顯著增加，總淀粉含量、直鏈淀粉含量和總脂肪含量卻都顯著減少。因?yàn)楦呖诟兄档拇竺淄哂休^高的直鏈淀粉含量以及較低的蛋白質(zhì)含量[22]，所以這些結(jié)果說明稻瘟病菌的感染明顯影響了常香粳1813的食味品質(zhì)。而且大麥的研究也表明蛋白質(zhì)含量的增加與直鏈淀粉含量顯著負(fù)相關(guān)[21]，本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該觀點(diǎn)。

本研究證明常香粳1813品種中存在多個(gè)抗病性基因，因此具備了對稻瘟病菌的一定抗性，但是稻瘟病菌感染對軟香米常香粳1813的種子、大米產(chǎn)量和品質(zhì)還有顯著的影響，因此優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病品種的選育需要結(jié)合分子標(biāo)記、產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)參數(shù)的結(jié)合驗(yàn)證，這也是今后育種過程中需要關(guān)注的方面。