吳珊 趙國廷 董振耀 馬秀花 姚毅章

(青海省第五人民醫(yī)院口腔科,青海 西寧810007)

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)是牙周炎的致病菌,也是口腔鱗狀細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素。研究顯示,P.g感染可通過破壞牙齦上皮屏障、內(nèi)化進(jìn)入牙齦上皮細(xì)胞,促進(jìn)牙齦上皮細(xì)胞增殖和自噬[1-2]。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解過程,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用,據(jù)報(bào)道,P.g可誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞自噬,利用自噬機(jī)制來生存[3];且自噬可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖,導(dǎo)致牙槽骨吸收,這是導(dǎo)致牙周炎患者牙齒脫落的根本原因[4]。因此,抑制P.g誘導(dǎo)的自噬是治療牙周病的一個(gè)新策略。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/UNC-51樣激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用,激活的AMPK可使ULK1磷酸化,誘導(dǎo)自噬,而抑制AMPK/ULK1通路激活,可抑制自噬體的產(chǎn)生[5]。綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)是具有多種藥理活性的酚類化合物,可從金銀花、杜仲等藥材獲得,具有抗炎、抗氧化作用。研究顯示,負(fù)載CGA的納米膠束在局部注射后可在牙齦組織中保留超過24 h,抑制牙槽骨吸收并阻止牙周炎小鼠模型進(jìn)展,有望成為牙周炎的新型治療策略[6]。此外,CGA被報(bào)道可抑制P.g的增殖和P.g的蛋白酶活性,對(duì)牙周疾病發(fā)揮保護(hù)作用[7]。然而,CGA對(duì)P.g誘導(dǎo)的牙齦上皮細(xì)胞自噬的影響及作用機(jī)制尚不明確。研究顯示,CGA能夠通過激活A(yù)MPK發(fā)揮降糖調(diào)脂的抗糖尿病作用[8];CGA還可抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的自噬與凋亡,發(fā)揮抗抑郁作用[9]。以上研究表明CGA對(duì)AMPK通路和自噬具有調(diào)節(jié)作用,但CGA是否通過調(diào)節(jié)AMPK/ULK1通路影響人牙齦上皮細(xì)胞的自噬與凋亡少見報(bào)道。因此,本研究通過P.g誘導(dǎo)人牙齦上皮細(xì)胞(Human gingival epithelial cells,HGE)建立炎性HGE細(xì)胞模型,探討CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞自噬的影響及其可能的作用機(jī)制,為牙周病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 HGE、牙齦卟啉單胞菌(P. gingivalis)(ATCC,美國),CGA(HPLC≥98%,源葉生物科技有限公司),MTT檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司),AICAR(Selleck,美國),兔抗人LC3Ⅱ、LC3I、Beclin-1、P62、p-ULK1、ULK1、p-AMPK、AMPK抗體及Alexa Fluor?488標(biāo)記的二抗(Abcam,英國)。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) HGE細(xì)胞培養(yǎng)于含藥雙抗(100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)液中,待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí),以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,使用或不使用P.g處理(MOI=100)HGE細(xì)胞12 h,再使用濃度為5、10、20、40、60 mg/L的CGA處理24 h,每孔加入20 μL的MTT溶液(PBS緩沖液制成5 mg/mL溶液),37 ℃避光孵育4 h,再加入150 μL DMSO溶液,檢測(cè)酶標(biāo)儀490 nm處吸光度值。

1.3 細(xì)胞處理及分組 將對(duì)數(shù)生長期HGE細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組,不做任何處理)、P.g組、CGA組(藥物濃度分別為10.0、20.0、40.0 mg/L)、CGA+AICAR(AMPK激活劑)組,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。P.g組使用P.g誘導(dǎo)建立細(xì)胞模型;CGA組在P.g誘導(dǎo)HGE細(xì)胞12 h后,分別使用終濃度為10.0、20.0、40.0 mg/L CGA(溶于DMSO中配制成100 mg/mL母液)處理細(xì)胞24 h;CGA+AICAR組P.g誘導(dǎo)HGE細(xì)胞12 h后,使用濃度為40.0 mg/L的CGA與1.0 nmol/L的AICAR共同處理細(xì)胞24 h,Control組與P.g組不使用藥物處理。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組處理的HGE細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,PBS洗滌,加入5 μL FITC染料及2.5 μL PI染料,避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 免疫熒光染色檢測(cè)HGE細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá) 各組處理的HGE細(xì)胞使用冰PBS緩沖液洗滌細(xì)胞,4%預(yù)冷的多聚甲醛固定10 min,冰PBS洗滌3次,0.5%的TritonX-100孵育細(xì)胞10 min,冰PBS洗滌3次,5% BSA室溫封閉30 min,加入LC3Ⅱ抗體(5%BSA配制)4 ℃孵育過夜,加入Alexa Fluor?488標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1h,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組處理的HGE細(xì)胞以每孔1×106接種于6孔板培養(yǎng)48 h后,500×g離心5 min、收集細(xì)胞,加入預(yù)冷的RIPA裂解液提取蛋白,使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量,取30 μg蛋白進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)膜,5%的BSA封閉1 h,別加入LC3Ⅱ(1:1000)、LC3I(1:1000)、Beclin-1(1:1000)、P62(1:1500)、p-ULK1(1:1500)、ULK1(1:1000)、p-AMPK(1:1000)、AMPK(1:1000)稀釋液和β-actin(1:1500)抗體稀釋液,4 ℃孵育過夜,加入二抗室溫孵育1h,ECL顯色放大,凝膠成像系統(tǒng)成像,以β-actin為內(nèi)參,對(duì)各蛋白進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 CGA對(duì)HGE細(xì)胞增殖的影響 與Control組比較,使用5、10、20、40、60 mg/L的CGA處理HGE細(xì)胞24 h后,細(xì)胞增殖活性無顯著變化(P>0.05),見圖1。

2.2 CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞增殖的影響 與Control組比較,P.g處理HGE細(xì)胞后,細(xì)胞增殖活性顯著增加,使用5～60 mg/L的CGA處理P.g誘導(dǎo)的HGE細(xì)胞24 h后,細(xì)胞增殖活性有所下降,CGA濃度在10 mg/L以上時(shí),對(duì)HGE細(xì)胞的抑制作用較為明顯(圖2),故選擇10、20、40 mg/L的CGA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞凋亡的影響 與Control組比較,P.g組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與P.g組比較,濃度為10.0、20.0、40.0 mg/L的CGA處理的HGE細(xì)胞凋亡率顯著升高,且呈藥物濃度依賴性(P<0.05);與40mg/L CGA組比較,CGA+AICAR組HGE細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞凋亡的影響

2.4 CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示,LC3Ⅱ顯示為綠色熒光,與Control組比較,P.g組綠色熒光增強(qiáng),相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05);與P.g組比較,CGA濃度為10.0、20.0、40.0 mg/L處理組HGE細(xì)胞綠色熒光明顯減弱,相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05);與40mg/L CGA組比較,CGA+AICAR組綠色熒光增強(qiáng),相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05),見圖4。

圖4 免疫熒光檢測(cè)炎性HGE細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)

2.5 CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較,P.g組LC3Ⅱ/I、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高,P62表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與P.g組比較,濃度為10.0、20.0、40.0 mg/L的CGA處理組LC3Ⅱ/I、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低,P62表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),且呈藥物濃度依賴性;與40.0 mg/L CGA組比較,CGA+AICAR組HGE細(xì)胞LC3Ⅱ/I、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高,P62表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)炎性HGE細(xì)胞LC3Ⅱ/I、Beclin-1、P62蛋白表達(dá)

2.6 CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞AMPK/ULK1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較,P.g組p-ULK1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與P.g組比較,濃度為10.0、20.0、40.0 mg/L的CGA處理組p-ULK1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),且呈藥物濃度依賴性;與40.0 mg/L CGA組比較,CGA+AICAR組HGE細(xì)胞p-ULK1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)炎性HGE細(xì)胞p-ULK1、p-AMPK蛋白表達(dá)

3 討論

P.g可誘導(dǎo)口腔來源細(xì)胞如牙齦上皮細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞的自噬,實(shí)現(xiàn)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖,進(jìn)而促進(jìn)牙周炎的炎性反應(yīng)。脂多糖是P.g外膜的重要毒力因子,可激活細(xì)胞炎癥反應(yīng)與自噬[10]。本研究使用P.g誘導(dǎo)HGE細(xì)胞后,細(xì)胞自噬水平升高,表明建模成功。

CGA是一種由咖啡酸和奎尼酸組成的縮酚酸化合物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒的作用,還具有調(diào)節(jié)糖脂代謝,治療代謝疾病的作用[11-12]。研究顯示,CGA可抑制高糖誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞凋亡[13];且CGA可抑制P.g的增殖,表現(xiàn)出抗菌作用,還可抑制P.g的蛋白酶活性,對(duì)牙周疾病具有保護(hù)作用[7]。本研究使用5～60 mg/L的CGA處理炎性HGE細(xì)胞24 h后,HGE細(xì)胞增殖活性下降,表明CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞增殖有抑制作用,且CGA濃度在10 mg/L及其以上時(shí),可顯著抑制HGE細(xì)胞的增殖,故選擇濃度為10、20、40 mg/L的CGA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

CGA可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬,自噬與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),如CGA可通過上調(diào)溶酶體功能增強(qiáng)自噬保護(hù)過氧化氫誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞氧化損傷[14];而在皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中,CGA可通過抑制自噬,抑制PC12細(xì)胞凋亡[9]。本研究使用10、20、40 mg/L的CGA處理炎性HGE細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CGA可呈濃度依賴性方式誘導(dǎo)HGE細(xì)胞凋亡。LC3Ⅱ、Beclin-1、P62自噬的標(biāo)志性蛋白,P.g被報(bào)道可促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞自噬,誘導(dǎo)LC3Ⅱ表達(dá)[15]。本研究使用不同濃度的CGA處理炎性HGE細(xì)胞后,LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低,P62表達(dá)水平顯著升高,且呈濃度依賴性,表明CGA可抑制炎性HGE細(xì)胞自噬,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這與既往研究中CGA誘導(dǎo)自噬的結(jié)果不一致,推測(cè)其原因可能與自噬的特性有關(guān)。因?yàn)樽允墒且话央p刃劍,即可誘導(dǎo)凋亡,又可抑制凋亡,這種抑制或促進(jìn)作用可以根據(jù)細(xì)胞內(nèi)情形而相互轉(zhuǎn)化。

細(xì)胞自噬由多種信號(hào)通路調(diào)控,AMPK是細(xì)胞能量感受器,也是應(yīng)激反應(yīng)觸發(fā)自噬的主要調(diào)節(jié)因子[16-17];在能量缺乏下,AMPK發(fā)生磷酸化而被激活,活化的AMPK可以使自噬起始關(guān)鍵蛋白ULK1磷酸化,ULK1活化后,可提高FUNDC1與LC3Ⅱ的結(jié)合效率,促進(jìn)自噬的產(chǎn)生[18]。AMPK/ULK1信號(hào)通路在多種疾病(如藥物神經(jīng)損傷、腦缺血、肝損傷)的自噬中發(fā)揮重要調(diào)控作用[19-20]。研究顯示,抑制AMPK/ULK1通路激活可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬,促進(jìn)細(xì)胞存活并減少細(xì)胞凋亡[21]。而激活A(yù)MPK/ULK1通路,可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬與凋亡[22]。本研究使用不同濃度CGA處理炎性HGE細(xì)胞后,p-ULK1、p-AMPK蛋白水平降低,且呈濃度依賴性,提示CGA具有抑制AMPK/ULK1通路激活的作用。此外,本研究還顯示,使用AMPK激活劑AICAR與CGA共同處理炎性HGE細(xì)胞后,HGE細(xì)胞凋亡率下降,LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白水平顯升高,P62表達(dá)水平降低,表明AICAR可部分逆轉(zhuǎn)CGA對(duì)炎性HGE細(xì)胞自噬的抑制作用。以上結(jié)果表明,CGA可能通過抑制AMPK/ULK1通路,抑制人牙齦上皮細(xì)胞自噬,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但姚宏紀(jì)等[8]的報(bào)道顯示,CGA對(duì)AMPK發(fā)揮激動(dòng)作用,在糖尿病合并糖脂代謝紊亂的小鼠中,CGA可通過激活A(yù)MPK改善血脂、糖耐量和胰島素抵抗。這與本研究結(jié)果不一致,推測(cè)CGA對(duì)AMPK是發(fā)揮激動(dòng)還是抑制作用與疾病、細(xì)胞和組織類型有關(guān)。

4 結(jié)論

CGA可通過抑制AMPK/ULK1通路抑制炎性HGE細(xì)胞自噬與增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究初步探討了CGA作為牙周炎治療候選藥物的潛力,但CGA的具體作用與機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證,在未來的研究中將以牙齦成纖維細(xì)胞為對(duì)象并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn),進(jìn)行深入分析。此外,CGA在機(jī)體的代謝與安全性評(píng)估也是接下來的研究重點(diǎn)。