田 昕,單婉鑫,石 艷,王陸飛*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春130041:2.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春130021)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是由糖尿病引發(fā)的腎臟功能損害,此病已逐漸成為危害程度極大的糖尿病微血管并發(fā)癥之一[1]。腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells,MCs)是腎小球內(nèi)極其活躍的細(xì)胞,腎小球系膜細(xì)胞異常增殖并伴隨著胞外基質(zhì)的大量合成是DN的早期主要病理特征之一,且DN與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。MicroRNA(miRNA)廣泛存在于真核生物中,在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究表明,miRNA在腎小球疾病中也扮演著重要的角色。一些miRNAs在腎小球肥大和腎小球系膜細(xì)胞增殖中起到了調(diào)節(jié)作用[3-4]。三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)為五加科中藥材三七的主要活性成分,具有預(yù)防和治療糖尿病腎病的作用,具體機制尚不明確。本課題組前期通過microRNA芯片技術(shù)預(yù)測出三七總皂苷可恢復(fù)高糖引起的人腎小球系膜細(xì)胞中miR-1231的下調(diào),為DN的防治提供了新的思路。本研究旨在研究PNS對高糖誘導(dǎo)下HMCs增殖的影響以及從microRNA的角度來探討PNS對DN分子水平上的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器DMEM低糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基(普諾賽生命科技有限公司,武漢),胎牛血清(賽百慷生物技術(shù)股份有限公司,上海),胰蛋白酶(翌圣生物科技股份有限公司,上海),三七總皂苷(南京景竹生物科技有限公司),TransScript反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系One-Step gDNA Removal(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司),hsa-miR-1231(金開瑞生物工程有限公司),IL-6、TNF-α一抗購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,GAPDH 一抗及二抗購于ABclonal,ECL底物發(fā)光顯色試劑盒購于上海威奧生物科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱(日本松下公司),Strata-gene實時熒光定量PCR儀(博日科技有限公司),TG16-W臺式高速冷凍離心機(英泰儀器有限公司,長沙),SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備(美國Bio-Rad公司)。

1.2 HMCs的復(fù)蘇、培養(yǎng)及分組液氮中取出細(xì)胞凍存管,在37 ℃水浴鍋中1 min解凍。加4 mL的DMEM低糖培養(yǎng)液(10%胎牛血清、1%雙抗)1 000 rpm離心5 min,棄上清。加入2 mL DMEM低糖完全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞,再加入8 mL DMEM低糖完全培養(yǎng)基。將其混合后,移到25 cm2的培養(yǎng)皿中,于5% CO2,37℃下孵育24 h,之后更換培養(yǎng)基,并繼續(xù)培養(yǎng)。將HMCs分為空白對照組(CON),高糖組(HG)和三七總皂苷組(PNS)。

1.3 CCK-8法檢測各組HMCs增殖能力選擇3～5代的HMCs,胰酶消化離心,按照每個孔3×103個的細(xì)胞將細(xì)胞懸液接種到96孔板中,每孔加200 μL,每組平行設(shè)6個復(fù)孔。邊緣孔用無菌PBS填充。分別經(jīng)5.6 mM D-葡萄糖(CON)、30 mM D-葡萄糖(HG)的培養(yǎng)液和6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的三七總皂苷處理24 h,向每孔加入10 μL CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選定450 nm波長,利用空白對照孔調(diào)零,再測得各組的吸光度(OD)值。

1.4 Real-time PCR法檢測miR-1231表達采用全式金EasyPure○RmiRNA Kit試劑盒提取microRNA,紫外分光光度計檢測A260/A280在1.8和2.0之間的RNA純度,逆轉(zhuǎn)錄采用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis試劑盒,采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix進行Real-time PCR。反應(yīng)結(jié)束后,計算機分析并計算終產(chǎn)物的融解曲線,采用2-ΔΔCt方法分析相關(guān)基因的表達水平。

1.5 miR-1231靶基因預(yù)測及功能和信號通路分析對miR-1231進行靶基因的初級篩選,采用以下microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)進行預(yù)測分析,并采用Cytoscape軟件將miR-1231與靶基因的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)可視化作圖分析。以GeneOntology和KEGG數(shù)據(jù)庫對所確定的靶基因進行功能富集及信號通路的可視化分析。

1.6 ELISA法檢測PNS對HMCs中TNF-α、IL-6分泌情況的影響用0.05 mol/L pH為9.6的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/mL。在每個聚苯乙烯板反應(yīng)孔中加100 μL溶液,4 ℃過夜。次日棄去孔內(nèi)溶液,再用PBS洗滌3次,每次3 min。細(xì)胞上清液300 g離心10 min,立即檢測。加稀釋好的待測樣品100 μL于上述孔中,37℃孵育1 h后洗滌。每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體(現(xiàn)配現(xiàn)用),37 ℃孵育1 h后洗滌。每孔加入100 μL TMB底物溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用),37 ℃孵育30 min。孵育完成后,向每個孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在ELISA檢測儀上設(shè)定檢測波長為450 nm,用空白對照孔調(diào)零后測定各孔的OD值。

1.7 Western blot法檢測炎癥因子蛋白表達水平提取各組細(xì)胞蛋白,應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒檢測以上各樣本蛋白濃度,用微量進樣器吸取20 μL蛋白樣品,注入梳孔內(nèi)。用80 V恒壓電流電泳到蛋白樣品到達層積膠與分離膠界限處時,立即切換至120 V恒壓電泳。設(shè)定200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h,將凝膠條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入TBST中在搖床上晃動1 min,以洗去殘余轉(zhuǎn)膜液,再將膜浸入5%脫脂奶粉中封閉,孵育1～2 h。4 ℃過夜,回收一抗,TBST洗3×15 min。再加入稀釋好的二抗,室溫孵育1 h,TBST洗3×15 min。將 ECL發(fā)光底物 A液和 B液以1∶1的比例混合在一起,并在整個 PVDF膜上均勻地鋪滿,反應(yīng)1 min,使用 Tanon 4200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光和顯影。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0分析各組條帶的灰度值,統(tǒng)計結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS19.0軟件分析統(tǒng)計數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異用方差分析進行統(tǒng)計學(xué)檢驗,組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測三七總皂苷對高糖下HMCs增殖的抑制作用與CON組相比,HG組細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.01);與HG組相比,各個濃度的三七總皂苷組OD值均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明,三七總皂苷對高糖環(huán)境誘導(dǎo)的細(xì)胞過度增殖的抑制作用具有一定的濃度依賴性,50 μg/mL的三七總皂苷已經(jīng)能顯著降低高糖環(huán)境引起的細(xì)胞增殖,細(xì)胞OD值已降低到與CON組相近水平,所以本實驗選用50 μg/mL的三七總皂苷進行后續(xù)的實驗(圖1)。

圖1 三七總皂苷對高糖誘導(dǎo)下HMCs增殖的影響

2.2 Real-time PCR法檢測三七總皂苷對高糖下HMCs miR-1231的調(diào)控作用與CON組相比,HG組miR-1231顯著下調(diào)(P<0.01),與HG組相比PNS組miR-1231表達量顯著上升(P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-1231的含量測定

2.3 miR-1231靶基因預(yù)測及通路富集采用Targetscan數(shù)據(jù)庫對miR-1231進行靶基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)miR-1231的靶基因有IGF1、TMED1、GSTT2等(圖3)。以KEGG數(shù)據(jù)庫對miR-1231的靶基因進行信號通路分析,發(fā)現(xiàn)與miR-1231相關(guān)的通路有Parathyroid hormone synthesis、secretion and action、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、MAPK signaling pathway等。用Cytoscape軟件將排列前20的信號通路可視化(圖4)。由信號通路氣泡圖可知,MAPK signaling pathway所形成的原點最大,pvalue值最小,說明MAPK signaling pathway與miR-1231密切相關(guān)(圖5)。以GeneOntology對miR-1231的靶基因進行生物功能富集可知,miR-1231的靶基因參與調(diào)控腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子結(jié)合等生物學(xué)功能(圖6)。

圖3 miR-1231靶基因預(yù)測

圖4 信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 信號通路氣泡圖

圖6 生物學(xué)功能分析

2.4 三七總皂苷對高糖下HMCs炎癥的抑制作用采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的含量,HG組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平較CON組顯著升高(P<0.01),PNS組較HG組相比TNF-α、IL-6含量均顯著降低(P<0.01)(圖7)。采用Western blot法針對炎癥因子的蛋白表達進行了檢測,結(jié)果表明,HG組細(xì)胞中TNF-α、IL-6蛋白表達水平較CON組顯著升高(P<0.01),PNS組較HG組相比TNF-α、IL-6蛋白表達量顯著降低(P<0.01)(圖8)。

圖7 各組細(xì)胞炎癥因子分泌情況

圖8 HMCs內(nèi)TNF-α、IL-6蛋白表達情況

3 討論

DN是一種糖尿病腎小球硬化癥,具有遺傳因素、高血糖等誘因,是一種伴有血管損傷和腎小球血流動力學(xué)變化的腎小球代謝紊亂綜合征。DN狀態(tài)下,腎小球病變主要包括系膜細(xì)胞肥大、基底膜增厚和系膜基質(zhì)增生等。MCs是DN極其重要的靶細(xì)胞,持續(xù)的高糖環(huán)境能夠誘發(fā)其異常增殖以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5-6]。PNS是從中藥材三七中提取的主要活性成分,其具有擴張血管、增強微循環(huán)、抗炎、抗氧化、抗休克、抗腫瘤等功能[7-8]。目前PNS已被證實具有腎臟保護作用,減緩糖尿病腎病的發(fā)展[9],但其機制尚不明確。

本實驗采用CCK-8法探究了三七總皂苷對HMCs的增殖的影響,發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞過度增殖,且其抑制作用具有濃度依賴性,并選用50 μg/mL的三七總皂苷進行后續(xù)實驗。

miRNA是各種細(xì)胞活動的強大調(diào)節(jié)劑,調(diào)控著細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育和凋亡。miRNA也被證明可以在與糖尿病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的組織中發(fā)揮作用,包括胰腺、骨骼肌和脂肪組織[10]。近年來,在糖尿病腎病中,miRNA具有靶向炎癥、纖維化、氧化應(yīng)激等作用[11]。已有報道證明miRNA通過介導(dǎo)炎癥來調(diào)節(jié)糖尿病腎病[12]。

在前期實驗中,通過microRNA芯片分析預(yù)測出三七總皂苷可上調(diào)高糖下HMCs內(nèi)miR-1231的表達,但三七總皂苷是否通過調(diào)控miR-1231實現(xiàn)對高糖下HMCs的保護作用尚不明確。

有研究表明,miR-1231可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)展[13-14]。但miR-1231對于DN及高糖下腎小球系膜細(xì)胞的作用未有文獻報道,通過Real-time PCR法結(jié)果發(fā)現(xiàn),PNS可恢復(fù)高糖引起的HMCs miR-1231的下調(diào)。對miR-1231進行了生物信息學(xué)分析,預(yù)測到miR-1231的靶基因有IGF1、TMED1、GSTT2等;且通過KEGG通路富集以及GO分析,得到miR-1231與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),MAPK信號通路可以通過激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)炎癥因子的表達。在炎癥過程中,炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達水平會升高,而MAPK信號通路的激活可以促進這些炎癥因子的表達[15-16]。PNS被證實對多種實驗性炎癥模型具有良好的抗炎活性。在本實驗中,采用ELISA和Western blot法對炎癥因子的表達量進行了檢測,發(fā)現(xiàn)PNS可顯著抑制高糖下HMCs中TNF-α和IL-6的高表達,起到良好的抗炎作用。

綜上所述,三七總皂苷可通過上調(diào)miR-1231的表達有效地改善高糖引起的HMCs過度增殖,并起到一定的抗炎作用。