陳世豪,金 鵬,李詩(shī)揚(yáng),李 揚(yáng),劉倩倩,陳玉丙*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 腫瘤放療科,吉林 長(zhǎng)春130041)

腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)在不同類(lèi)型腫瘤和不同腫瘤個(gè)體之間存在差異,但是在一些腫瘤患者中,可檢測(cè)到針對(duì)TAAs免疫應(yīng)答產(chǎn)生的自身抗體[1]。在TAAs被檢測(cè)到之前,自身抗體就已出現(xiàn),甚至在CT檢測(cè)或發(fā)病率篩查能夠識(shí)別腫瘤之前數(shù)年就能被檢測(cè)到[2-3]。因此自身抗體也被認(rèn)為是腫瘤早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物[2,4]。2011年有團(tuán)隊(duì)首次研發(fā)出用TAAs檢測(cè)自身抗體的肺癌診斷試劑EarlyCDT○R-Lung,包括p53、NY-ESO-1、DDX53、GBU4-5、ANXA1和SOX2等6個(gè)TAAs,其敏感性為40%,特異性為82%[5]。后來(lái)又對(duì)其優(yōu)化升級(jí),包括P53、NY-ESO-1、DDX53、GBU4-5、HuD、MAGE A4和SOX2-B等7種TAAs,使其敏感性達(dá)到47%,特異性達(dá)到90%[6]。

機(jī)體針對(duì)TAAs分泌自身抗體的機(jī)制尚不清楚,但有研究認(rèn)為,針對(duì)TAAs的免疫應(yīng)答可能源于TAAs免疫原性的增加,包括抗原突變、抗原折疊改變、異常降解、過(guò)表達(dá)、異位表達(dá)及異常糖基化等[7]。由于蛋白質(zhì)抗原分子較大,用多種蛋白質(zhì)聯(lián)合檢測(cè)來(lái)提高敏感性比較困難。因此本課題組開(kāi)發(fā)了一種應(yīng)用線(xiàn)性肽抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)自身抗體,使TAAs自身抗體的檢測(cè)成為診斷或篩查腫瘤及監(jiān)測(cè)抗腫瘤治療后復(fù)發(fā)的一種方法。本課題組已選擇了多種TAAs進(jìn)行了相關(guān)研究。

已有報(bào)道證實(shí)腫瘤相關(guān)抗原P53和ENO1的自身抗體在多種腫瘤中被檢測(cè)到[8-11],而IMPDH、LAMR1在多種腫瘤中高表達(dá)[12-15]。本研究選擇腫瘤相關(guān)抗原P53、IMPDH、LAMR1和ENO1,應(yīng)用其肽抗原檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌中的相應(yīng)自身抗體,為肺癌篩查及預(yù)后監(jiān)測(cè)手段的建立提供更多有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)和樣本信息

本研究收集了從2013年1月至2018年1月吉林大學(xué)第二醫(yī)院確診的221名NSCLC患者血標(biāo)本,納入標(biāo)準(zhǔn)是首次確診為NSCLC且未經(jīng)任何抗腫瘤治療的患者。NSCLC患者均通過(guò)組織病理學(xué)確診,并根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)癌癥分期手冊(cè)的第八版確定腫瘤分期。排除復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移癌或合并其他腫瘤病史及多腫瘤患者,排除合并自身免疫性疾病及其它嚴(yán)重并發(fā)癥如糖尿病、肝病患者。同時(shí)取243名于吉林大學(xué)第二醫(yī)院體檢中心體檢的年齡、性別匹配的健康體檢者血標(biāo)本作為健康對(duì)照組。參與者的基本信息見(jiàn)表1,NSCLC組和健康對(duì)照組性別、年齡無(wú)明顯差異。

表1 參與者信息和臨床病理學(xué)特征

1.2 應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)自身抗體

應(yīng)用免疫學(xué)軟件和免疫信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT 數(shù)據(jù)庫(kù)、IMGT/HLA 數(shù)據(jù)庫(kù)、T 細(xì)胞表位查詢(xún)和預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù))及HLA 表位結(jié)合預(yù)測(cè)工具設(shè)計(jì)并用固相合成法合成肽抗原(hAgs),每個(gè)hAg攜帶超過(guò)10個(gè)重疊的HLA-Ⅱ限制性表位,純度>95%。并根據(jù)山羊α-乳清蛋白蛋白質(zhì)序列(Gene Bank登錄號(hào)NP_002280.1)設(shè)計(jì)對(duì)照肽抗原(cAg),該蛋白質(zhì)序列不含任何類(lèi)似于源自人的配對(duì)物序列的HLA-Ⅱ表位。

將肽抗原溶解并調(diào)整濃度至10 μg/ml,取100 μl加至酶標(biāo)板,4℃孵育過(guò)夜。棄去孔中液體,每孔加PBS洗液200 μl,洗滌3次。將血清樣品、陰性對(duì)照品(BSA分析液)和質(zhì)控品(200名健康者的混合血清樣品)用BSA分析液按1∶100倍稀釋,分別取100 μl加入酶標(biāo)板,室溫(18～22℃) 孵育1.5 h。洗滌3次后加1∶20 000倍稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體100 μl,室溫孵育1 h。洗滌3次后,每孔加TMB顯色液100 μl,避光孵育20 min,每孔再加50 μl終止液,終止反應(yīng)。液體由藍(lán)色變?yōu)辄S色,5 min內(nèi)應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。所有檢測(cè)樣本均設(shè)置雙復(fù)孔,取平均OD值作為檢測(cè)結(jié)果。用特異結(jié)合指數(shù)(SBI)表示血清中的抗體水平:

SBI=(ODhAg-ODNC)/(ODcAg-ODNC)

ODNC為陰性對(duì)照的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組和健康對(duì)照組血清中腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體的水平

應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原P53、IMPDH、LAMR1和ENO1的肽抗原檢測(cè)自身抗體,結(jié)果顯示NSCLC組P53、IMPDH、LAMR1和ENO1的自身抗體明顯高于健康對(duì)照組(P<0.001)(圖1,表2)。

圖1 NSCLC組(LC)和健康對(duì)照組(NC)血清中TAAs自身抗體的水平

表2 NSCLC患者P53、IMPDH、LAMR1和ENO1自身抗體的水平

2.2 不同病理類(lèi)型的NSCLC腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體的水平

對(duì)NSCLC的腺癌和鱗癌患者的P53、IMPDH、LAMR1和ENO1的自身抗體水平分別分析,結(jié)果表明腺癌和鱗癌患者的P53、IMPDH、LAMR1和ENO1的自身抗體水平均顯著高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且腺癌患者自身抗體水平顯著高于鱗癌(P<0.05)(表2)。

2.3 不同病理分期的NSCLC患者的腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體的水平

按照NSCLC的病理分期,對(duì)NSCLC患者的P53、IMPDH、LAMR1和ENO1的自身抗體分別分析,結(jié)果顯示Ⅰ～Ⅳ期自身抗體水平均顯著高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05(表3),各期之間沒(méi)有明顯差異。

表3 不同病理分期的NSCLC患者P53、IMPDH、LAMR1和ENO1的自身抗體水平

3 討論

腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),在第一臨床癥狀出現(xiàn)之前即已穩(wěn)定、持續(xù)地存在于外周血中,且比較容易被檢測(cè)到,已成為受關(guān)注的腫瘤標(biāo)志物[7,16]。BABEL等[17]應(yīng)用含有8 000 種人蛋白質(zhì)的蛋白微陣列,檢測(cè)結(jié)直腸癌患者TAAs的自身抗體,發(fā)現(xiàn) PIM1、MAPKAPK3、STK4、SRC和FGFR4的水平最高,經(jīng)ROC進(jìn)一步分析表明MAPKAPK3和ACVR2B蛋白的組合可使特異性達(dá)73.9%,敏感性達(dá)83.3%,AUC值達(dá)0.85。本研究中NSCLC患者P53、IMPDH、LAMR1和ENO1自身抗體水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.001)。表明P53、IMPDH、LAMR1和ENO1自身抗體對(duì)NSCLC的診斷具有潛在價(jià)值。Rom 應(yīng)用ROC分析c-myc、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、CDK2 和 survivin組合評(píng)估吸煙和不吸煙的健康人患肺癌的風(fēng)險(xiǎn),AUC達(dá)0.907,特異性97%時(shí)靈敏度達(dá)81%[18]。所以多種TAAs組合檢測(cè)自身抗體,可使其靈敏性和特異性達(dá)到最優(yōu)。但是檢測(cè)自身抗體的肺癌診斷試劑EarlyCDT○R-Lung[5-6]的敏感性比較低,可能與其使用基因工程完整抗原有關(guān),而本研究應(yīng)用的是攜帶超過(guò)10個(gè)重疊的HLA-Ⅱ限制性表位的肽抗原檢測(cè)對(duì)應(yīng)的自身抗體,容易獲得高敏感性。

有研究也證實(shí)了TAAs的自身抗體在肺癌早期的診斷性能,Yao等檢測(cè)了93名NSCLC患者DKK1自身抗體的水平,ROC分析結(jié)果顯示其敏感性為62%,對(duì)Ⅰ期NSCLC患者檢測(cè)的敏感性達(dá)到64.3%[19]。本研究中Ⅰ期NSCLC患者的P53、IMPDH、LAMR1和ENO1的自身抗體水平即顯著高于健康對(duì)照組(P<0.001),可以把NSCLC患者與健康人區(qū)分開(kāi)。甚至能把不同病理類(lèi)型腺癌和鱗癌區(qū)分開(kāi)(P<0.05),LEIDINGER的研究可以把鱗狀細(xì)胞肺癌和非腫瘤肺部疾病區(qū)分開(kāi)[20]。

可見(jiàn)檢測(cè)TAAs的自身抗體對(duì)癌癥診斷、篩查和預(yù)后監(jiān)測(cè)有潛在價(jià)值,但使檢測(cè)的靈敏性和特異性達(dá)到最優(yōu),仍需進(jìn)一步篩選TAAs及其組合,以及大規(guī)模的臨床研究。