趙建國(guó)，朱曉靈，金學(xué)英，江黎明，李振軍，陳遐林

紹興市人民醫(yī)院 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院，浙江 紹興 312000，1.腫瘤內(nèi)科；2.肛腸外科

結(jié)腸癌（colon cancer, CC）是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CC的發(fā)病率和病死率自2000 年以來(lái)總體呈下降趨勢(shì)，但在50歲以下的年輕人群中卻持續(xù)上升[2]。因此，CC依然是嚴(yán)重威脅人類身體健康的惡性腫瘤之一，需要進(jìn)一步探究其分子機(jī)制，制定具有針對(duì)性的診斷和治療策略。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類小的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，可以通過(guò)調(diào)控相應(yīng)mRNA靶標(biāo)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)眾多生物過(guò)程，在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中往往都伴隨著miRNA的表達(dá)異常[3-4]。 miR-152-3p作為一個(gè)重要的miRNA，在多種癌細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，如肝細(xì)胞癌[5]、非小細(xì)胞腺癌[6]、前列腺癌[7]等。在肺癌中，miR-152-3p作為lncRNA KIF9-AS1的下游靶標(biāo)，可抑制肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[8]。在甲狀腺乳頭狀癌中，miR-152-3p低表達(dá)可促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞惡性進(jìn)展，且miR-152-3p通過(guò)靶向TGFA發(fā)揮作用[9]。此外，有研究報(bào)道m(xù)iR-152-3p在CC中的表達(dá)異常[10-11]。但有關(guān)miR-152-3p在CC中是促癌因子還是抑癌因子的結(jié)論卻不完全一致。Krüppel樣因子4（Krüppellike factor 4, KLF4）是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在多種癌癥中差異表達(dá)[12-13]。KLF4同樣在不同癌種中發(fā)揮促癌或抑癌作用[14-15]。在CC中，KLF4對(duì)CC細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生影響[16]。但miR-152-3p對(duì)CC細(xì)胞表型的影響是否與KLF4有關(guān)，還需進(jìn)一步探究。因此，進(jìn)一步研究miR-152-3p在CC中的分子機(jī)制，明確其在CC中的作用，具有一定意義。

本研究通過(guò)調(diào)控miR-152-3p及其靶基因在CC細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步探究miR-152-3p對(duì)調(diào)控CC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過(guò)程的分子機(jī)制，明確其在CC細(xì)胞中的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞 CCD841CON（BNCC338086）、人CC細(xì)胞系HCT116（BNCC287750）、SW620（BNCC337664）、SW480（BNCC100604）均購(gòu)自北京北納生物科技有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、鏈霉素、青霉素、Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、結(jié)晶紫均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，EMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、L-15 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green?Premix Ex TaqTM均購(gòu)自日本TaKaRa公司，RIPA裂解液、ECL試劑盒、MTT溶液均購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司，PVDF膜和EZ Magna RIP Kit購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，一抗兔抗KLF4（ab215036）、兔抗GAPDH（ab181602）、二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab6721）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，pmirGLO、Luciferase Assay System均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，細(xì)胞周期試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物有限公司，ABI 7500 Real-Time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)Clinx公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2 生物信息學(xué)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載CC表達(dá)量數(shù)據(jù)集，采用“edgeR”包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析（|logFC|＞2，adj.p value＜0.01）。利用starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)has-miR-152-3p靶基因以及結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合相關(guān)性分析，初步確定其靶向結(jié)合關(guān)系及表達(dá)情況。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) CCD841CON細(xì)胞在含10% FBS、 0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的EMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HCT116細(xì)胞在含10% FBS、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SW620細(xì)胞在含10% FBS、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SW480 細(xì)胞在含10% FBS、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為37 ℃，5% CO2。

1.4 載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 mimic NC、miR-152-3p mimic購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，pcDNA3.1-KLF4質(zhì)粒（oe-KLF4）和空pcDNA3.1質(zhì)粒（oe-NC）由上海生工生物工程有限公司合成。將CC細(xì)胞接種到6孔板中（1×105個(gè)/孔）培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度至80%左右時(shí)，按制造商的說(shuō)明書(shū)，使用Lipofectamine 2000將mimic NC、miR-152-3p mimic、oe-NC和oe-KLF4轉(zhuǎn)染至CC細(xì)胞中，并在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2。

1.5 RT-qPCR 使用TRIzol試劑從結(jié)腸癌細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著使用TB Green?Premix Ex TaqTM在ABI 7500 RT-PCR系統(tǒng)上進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。miR-152-3p以U6為內(nèi)參，KLF4以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。用2-ΔΔCt法比較相對(duì)表達(dá)量的差異。

表1 引物列表

1.6 Western blot 用RIPA裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白，隨后用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜于5%脫脂牛奶中封閉1 h，隨后將膜分別與一抗兔抗KLF4（1:1 000）、一抗兔抗GAPDH（1:10 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜。TBST清洗3次后，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（1:2 000）在室溫下孵育2 h。使用ECL試劑盒在熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶并拍照。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將細(xì)胞接種到24孔板中，構(gòu)建含有WT-KLF4（野生型）和MUT-KLF4（突變型）兩種pmirGLO熒光素酶質(zhì)粒。隨后將mimic NC和miR-152-3p mimic與WT/MUT-KLF4 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使用 Luciferase Assay System測(cè)定熒光素酶活性。

1.8 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn) 使用EZ Magna RIP Kit，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。將SW480細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，使用RIP裂解緩沖液裂解細(xì)胞，并加入anti-KLF4抗體或正常兔IgG免疫沉淀RNA-蛋白復(fù)合物，在4 ℃孵育6 h后，純化共沉淀的RNA，并進(jìn)行RT-qPCR分析。

1.9 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)期CC細(xì)胞，接種于96 孔板（3×103個(gè)/孔），在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，小心吸去上清，加入 90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后吸掉上清，每孔加入100 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.10 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的CC細(xì)胞接種在6孔板中（2×105個(gè)/孔）培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)，用200 μL移液管尖端輕輕刮擦經(jīng)過(guò)孔中心垂直于孔板路徑上的細(xì)胞，PBS洗滌除去分離的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，在0 h和24 h時(shí)分別在顯微鏡下拍照記錄。

1.11 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的CC細(xì)胞加入到用基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室中，在下室添加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。除去底部膜表面的細(xì)胞后，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，拍照。

1.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染48 h后的CC細(xì)胞，按照細(xì)胞周期試劑盒說(shuō)明書(shū)，制備單細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇固定，4 ℃下過(guò)夜。PBS洗去固定液，1 000 r/min離心3 min，收集沉淀細(xì)胞。加入提前配制好的500 μL PI/RNase A染色工作液，室溫避光30 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.13 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h后的CC細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，用胰蛋白酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，然后收集并重懸于PBS （4 ℃）中。1 000 r/min離心細(xì)胞并去除PBS后，加入Binding Buffer輕輕吹勻制備單細(xì)胞懸液。加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）混勻后，加入5 μL PI。室溫下避光10 min，隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次技術(shù)性重復(fù)，采用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Students’t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-152-3p在CC中表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞惡性行為 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載表達(dá)量數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)[正常組織（n=8），腫瘤組織（n=457）]。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，相對(duì)于正常組織，miR-152-3p在腫瘤組織中顯著上調(diào)（P＜0.001），見(jiàn)圖1A。qRT-PCR檢測(cè)miR-152-3p在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CON和人CC細(xì)胞HCT116、SW620、SW480中的表達(dá)情況，結(jié)果表明人CC細(xì)胞中miR-152-3p的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。選取相對(duì)表達(dá)較高的SW480細(xì)胞與mimic NC和miR-152-3p mimic進(jìn)行轉(zhuǎn)染。RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的兩組SW480細(xì)胞miR-152-3p相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-152-3p mimic后的細(xì)胞miR-152-3p表達(dá)量顯著增高（P＜0.01），見(jiàn)圖1C，證明轉(zhuǎn)染效率較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-152-3p的SW480細(xì)胞增殖能力顯著高于正常表達(dá)的細(xì)胞（P＜0.01），見(jiàn)圖1D。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-152-3p后細(xì)胞遷移能力較正常表達(dá)miR-152-3p的細(xì)胞顯著增高（P＜0.001），見(jiàn)圖1E。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-152-3p的細(xì)胞侵襲能力顯著增高（P＜0.01），見(jiàn)圖1F。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-152-3p過(guò)表達(dá)使G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1G。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-152-3p使SW480細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1H。

圖1 miR-152-3p在CC細(xì)胞中高表達(dá)且促進(jìn)細(xì)胞惡性行為

2.2 miR-152-3p和KLF4 存在靶向結(jié)合關(guān)系 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載表達(dá)量數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)[n（正常組織）=41，n（腫瘤組織）=480]，分析得KLF4在腫瘤組織中顯著下調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。相關(guān)性分析結(jié)果顯示KLF4與miR-152-3p呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），見(jiàn)圖2B。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)KLF4的mRNA和蛋白在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CON和人CC細(xì)胞HCT116、SW620、SW480中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，人CC細(xì)胞中KLF4的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著低于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（均P＜0.01），見(jiàn)圖2C。通過(guò)starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得miR-152-3p與KLF4存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2D）。為驗(yàn)證miR-152-3p和KLF4之間的關(guān)系，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和RIP實(shí)驗(yàn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-152-3p顯著降低了人CC細(xì)胞中野生型KLF4 報(bào)告基因的熒光活性 （P＜0.01），而對(duì)突變型KLF4報(bào)告基因的熒光活性沒(méi)有影響（P＞0.05），見(jiàn)圖2E，表明miR-152-3p和KLF4之間存在靶向關(guān)系。RIP實(shí)驗(yàn)表明，與IgG組相比，在anti-KLF4免疫沉淀中，miR-152-3p的表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖2F，表明miR-152-3p可能直接與KLF4相互作用。隨后，RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了mimic NC和miR-152-3p mimic的SW480細(xì)胞中KLF4的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-152-3p使細(xì)胞中KLF4的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2G，表明miR-152-3p與KLF4呈負(fù)相關(guān)性，與生物信息學(xué)分析的結(jié)果一致。

圖2 miR-152-3p靶向下調(diào)KLF4的表達(dá)

2.3 KLF4在CC中抑制細(xì)胞惡性行為 選取相對(duì)表達(dá)量變化較大的SW480細(xì)胞與oe-NC和oe-KLF4進(jìn)行轉(zhuǎn)染。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞KLF4的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了oe-KLF4的細(xì)胞KLF4的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增高（P＜0.01），見(jiàn)圖3A，轉(zhuǎn)染效率較好。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于較正常表達(dá)的細(xì)胞，過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3B；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞遷移能力顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3C；同樣地，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞侵襲能力受到顯著抑制（P＜0.01），見(jiàn)圖3D。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)KLF4使SW480細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3E。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.01），見(jiàn)圖3F。

圖3 KLF4抑制CC細(xì)胞的惡性行為

2.4 miR-152-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控KLF4 促進(jìn)CC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 構(gòu)建以下分組：mimic NC+oe-NC、miR-152-3p mimic+oe-NC、mimic NC+oe-KLF4、miR-152-3p mimic+oe-KLF4。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，相較于正常表達(dá)組，單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-152-3p的細(xì)胞KLF4的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01），而單獨(dú)過(guò)表達(dá)KLF4后KLF4的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.01），同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-152-3p和KLF4后，細(xì)胞中KLF4的表達(dá)情況得到恢復(fù)（圖4A）。MTT實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-152-3p的細(xì)胞增殖能力顯著增高（P＜0.01），而單獨(dú)過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.01），兩者同時(shí)過(guò)表達(dá)使增殖能力變化得到恢復(fù)（圖4B）。劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-152-3p后細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力均顯著增高（均P＜0.01），而單獨(dú)過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞遷移能力和侵襲能力均顯著降低（均P＜0.01），而同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-152-3p和KLF4則使細(xì)胞的遷移和侵襲能力恢復(fù)到正常表達(dá)組的水平（圖4C、圖4D）。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-152-3p的細(xì)胞處于G0/G1期的顯著減少（P＜0.01），且細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；單獨(dú)過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞顯著滯留于G0/G1期（P＜0.01），細(xì)胞凋亡率也顯著增高 （P＜0.01）；而兩者同時(shí)過(guò)表達(dá)后則抑制了這些變化（圖4E、圖4F）。

圖4 miR-152-3p通過(guò)靶向KLF4影響CC細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程

3 討論

越來(lái)越多的研究證明，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一些miRNA在多種腫瘤中表達(dá)異常，因此其可能被用于預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后。有多個(gè)研究報(bào)道m(xù)iR-152-3p在CC中表達(dá)異常[10-11，21]， 但結(jié)果卻不全一致。基于此，我們通過(guò)生物信息分析初步確定miR-152-3p在CC組織中的表達(dá)上調(diào)，隨后在CC細(xì)胞系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)驗(yàn)證了miR-152-3p的表達(dá)，miR-152-3p過(guò)表達(dá)促進(jìn)CC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，并增加G2/M細(xì)胞比例。這表明，本研究中miR-152-3p在CC中發(fā)揮促癌作用。

目前對(duì)于miR-152-3p的研究報(bào)道顯示，其可以通過(guò)作用于多個(gè)靶基因發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用，如 SLC7A5[22]、RAB14[23]和ITGA9[24]等。本研究中，我們通過(guò)生物信息分析預(yù)測(cè)到miR-152-3p與KLF4具有結(jié)合位點(diǎn)，并利用雙熒光素酶和RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的靶向結(jié)合關(guān)系。接著我們對(duì)miR-152-3p和KLF4進(jìn)行相關(guān)性預(yù)測(cè)分析，并通過(guò)qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-152-3p與KLF4 呈負(fù)相關(guān)性。KLF4是一個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)上調(diào)p21WAF1/Cip1和下調(diào)cyclin D1來(lái)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，在結(jié)直腸癌中確認(rèn)為抑制腫瘤的基因[25]。本研究中KLF4過(guò)表達(dá)可抑制CC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡，并阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期。在miR-152-3p過(guò) 表達(dá)的同時(shí)上調(diào)KLF4的表達(dá)，則可以減弱miR-152-3p過(guò)表達(dá)對(duì)CC細(xì)胞表型的促進(jìn)作用。這表明在CC中，miR-152-3p通過(guò)靶向KLF4調(diào)控細(xì)胞表型。有研究發(fā)現(xiàn)，KLF4與干細(xì)胞分化有關(guān)[26]。MA等[14]研究發(fā)現(xiàn)KLF4與整合素β4結(jié)合后，通過(guò)維持癌癥干細(xì)胞形狀對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)揮促進(jìn)作用。此外，有研究報(bào)道，KLF4對(duì)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation, EMT）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑制作用，進(jìn)而對(duì)EMT的發(fā)生產(chǎn)生影響[27]。因而，我們猜測(cè)在CC中，miR-152-3p靶向KLF4對(duì)CC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等產(chǎn)生影響，其中KLF4 可能通過(guò)影響多種途徑，比如細(xì)胞干性、EMT進(jìn)程等對(duì)CC細(xì)胞發(fā)揮作用。當(dāng)然，這還需要在未來(lái)的研究中繼續(xù)探究。

綜上所述，本研究明確了miR-152-3p在CC中為促癌因子，并參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究尚存不足之處，今后還需利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并納入臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，使其能真正應(yīng)用于臨床。