柯超 周紅見 蔣斌 謝興旺 張超 (武漢市第三醫(yī)院胃腸腹壁與疝外科,湖北 武漢 430061)

結(jié)直腸癌是全球第3大常見癌癥和第4大癌癥相關(guān)死亡原因〔1〕。遺傳變異和細(xì)胞環(huán)境是影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的主要原因〔2〕。盡管結(jié)直腸癌的診斷方法和綜合治療取得了顯著進展,但患者5年生存率僅為15%左右〔3,4〕。因此,研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找有效治療靶點,對結(jié)直腸癌的診斷和治療具有重要意義。由于結(jié)直腸癌的高復(fù)發(fā)率和高異質(zhì)性,具有自我更新和分化能力的腫瘤干細(xì)胞成為許多研究者的研究對象〔5〕。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、多步驟的過程,結(jié)直腸癌干細(xì)胞是結(jié)直腸癌發(fā)生、進展、侵襲和耐藥性的關(guān)鍵細(xì)胞亞群〔6〕。研究報道,GTP結(jié)合蛋白(GTPBP)2是G蛋白超家族的成員,位于人6p21.13,具有G蛋白激酶活性〔7〕。沉默GTPBP2可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖能力〔8〕。然而,GTPBP2在結(jié)直腸癌中的表達和作用未見報道。Wnt/β-catenin信號通路失調(diào)在結(jié)直腸癌的發(fā)病機制中起重要作用,燈盞花素可通過減弱Wnt/β-catenin信號級聯(lián)來改善結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)直腸癌〔9〕。盡管已有多項研究報道Wnt/β-catenin信號通路在結(jié)直腸癌中的作用,但GTPBP2對結(jié)直腸癌進展的作用及其分子機制是否與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)還尚未清楚,本實驗研究GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移、侵襲、凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取武漢市第三醫(yī)院2017年1月至2019年1月30例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織,手術(shù)切除后立即將樣本-80 ℃保存,患者均知情且同意,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞與試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Trziol、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司;放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司;CD133磁珠分選試劑盒購自中科雷鳴科技有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司;Transwell小室購于美國密理博公司;膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-PE/7-AAD流式試劑盒購自美國BD公司;si-NC、si-GTPBP2購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。

1.3CD133陽性細(xì)胞分離 采用免疫磁珠法分選出人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的CD133陽性腫瘤干細(xì)胞,取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞,以磁珠試劑盒緩沖液重懸,計數(shù),與CD133磁珠冰上孵育30 min,加入緩沖液洗滌離心2次,將細(xì)胞沉淀用500 μl緩沖液重懸,經(jīng)過磁珠分選儀獲得CD133陰性細(xì)胞和CD133陽性細(xì)胞〔10〕。

1.4結(jié)直腸癌干細(xì)胞處理與分組 按照Lipofectamine2000試劑盒說明將si-NC、si-GTPBP2轉(zhuǎn)染至CD133陽性細(xì)胞中,分別記為si-NC組、si-GTPBP2組,未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CD133陽性細(xì)胞記為Con組。

1.5RT-qPCR 提取組織和各組CD133陽性細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以GAPDH為內(nèi)參檢測GTPBP2 mRNA表達水平,相對表達量采用2-△△Ct法計算。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6MTT 取各組CD133陽性細(xì)胞(2.5×104個/ml),接種于96孔板(100 μl/L),72 h后,每孔加入MTT溶液20 μl,培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl,室溫震蕩孵育5 min,酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值,存活率=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.7Transwell 將各組CD133陽性細(xì)胞接種于Transwell小室上室,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在37 ℃下孵育24 h后,用棉簽擦去未穿膜的細(xì)胞。甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min。置于顯微鏡下計數(shù)。

1.8Annexin Ⅴ 將各組CD133陽性細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,在50 μl結(jié)合緩沖液中加入5 μl 7-氨基分霉素(7AA)D,混勻后,室溫、避光反應(yīng)10 min,加入450 μl結(jié)合緩沖液和1 μl Annexin Ⅴ-PE,混勻后,室溫、避光反應(yīng)10 min,流式細(xì)胞儀進行觀察和檢測。70%乙醇4 ℃固定2 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗1次,加入0.5 ml碘化丙啶(PI),37 ℃避光溫浴30 min,4 ℃避光,流式細(xì)胞儀在激發(fā)488 nm波長處檢測紅色熒光,并檢測光散射情況。

1.9Western印跡 取對數(shù)生長期的CD133陰性細(xì)胞和CD133陽性細(xì)胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,制成單細(xì)胞懸液,以1×106/L濃度接種于培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h。提取CD133陰性細(xì)胞、CD133陽性細(xì)胞、Con組、si-NC組、si-GTPBP2組細(xì)胞總蛋白,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜,一抗4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育1 h,顯色曝光,以GAPDH作為內(nèi)參。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1GTPBP2在結(jié)直腸癌組織中表達 結(jié)直腸癌組織GTPBP2 mRNA和蛋白表達(3.62±0.26、0.53±0.04)顯著高于癌旁組織(1.00±0.06、0.21±0.03;t=9.656、7.165,均P=0.000)。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織GTPBP2蛋白表達

2.2CD133陽性細(xì)胞干性基因表達 CD133陽性細(xì)胞干細(xì)胞表面標(biāo)志物八聚體結(jié)合蛋白(Oct)-4、性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)-2、胚胎干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Nanog)表達水平顯著高于CD133陰性細(xì)胞(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 CD133陽性細(xì)胞干細(xì)胞表面標(biāo)志物Oct-4、SOX-2、Nanog蛋白表達

2.3沉默GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響 與si-NC組比較,si-GTPBP2組GTPBP2表達水平、細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例及細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、細(xì)胞核增殖抗原(Ki)-67蛋白表達降低,G0-G1細(xì)胞比例、p21蛋白表達升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Con組以上各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見圖3、表2。

表2 沉默GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

圖3 3組增殖和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達

2.4沉默GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與si-NC組相比,si-GTPBP2組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達明顯降低(P<0.05),Con組以上各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表3、圖5。

表3 沉默GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響

圖4 沉默GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)的影響

圖5 Western印跡檢測各組遷移、侵襲、凋亡及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達

2.5沉默GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC組比較,si-GTPBP2組細(xì)胞凋亡率、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)蛋白(Bax)蛋白表達明顯升高,Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05),Con組以上各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3、圖5、圖6。

圖6 沉默GTPBP2對結(jié)直腸癌干細(xì)胞凋亡的影響

2.6沉默GTPBP2對Wnt/β-catenin信號通路的影響 與si-NC組比較,si-GTPBP2組p-GSK3β、β-catenin蛋白表達明顯降低(P<0.05),Con組以上各指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、表4。

表4 沉默GTPBP2對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化成異質(zhì)癌細(xì)胞系能力的獨特特征的細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。CD133和CD44是公認(rèn)的干細(xì)胞生物標(biāo)志物,且在結(jié)直腸癌表現(xiàn)出干細(xì)胞相似性〔11〕。本研究結(jié)果表明,CD133陽性細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。

GTPBPs是一類具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的蛋白質(zhì),在細(xì)胞信號傳遞、骨架調(diào)節(jié)及蛋白質(zhì)合成等中發(fā)揮重要作用,GTPBP2在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達,其高表達與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),且可通過與信號通路相互作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔12〕。GTPBP2在人和小鼠之間高度保守,存在于人體的絕大部分組織和器官。目前,人類對GTPBP2的研究僅限于遺傳學(xué)〔13〕。GTPBP2可與轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子SMAD1結(jié)合并參與骨形成蛋白(BMP)/SMAD1信號通路〔14〕。GTPBP2等位基因失活變異與家族性神經(jīng)發(fā)育障礙和智力殘疾有關(guān),在維持細(xì)胞正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用〔15〕。本研究結(jié)果提示,沉默GTPBP2可抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進程、遷移、侵襲,促進細(xì)胞凋亡。

Wnt信號通路具有高度保守性,包括Wnt基因家族與Wnt受體等〔10〕。研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號通路主要包括Wnt/β-catenin、Wnt/平面細(xì)胞極性(PCP)和Wnt/Ca2+信號通路,其中Wnt/β-catenin信號通路最為關(guān)鍵和經(jīng)典。Wnt/β-catenin信號通路在多種人類腫瘤發(fā)展中起著重要作用,miR-758通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路靶向抑制HMGB3表達,從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔16〕。Wnt/β-catenin通路在誘導(dǎo)和維持卵巢癌干細(xì)胞特性、誘導(dǎo)干細(xì)胞化和化療耐藥性方面至關(guān)重要〔17〕。Circ-DENND4C通過激活Wnt/β-catenin信號通路來上調(diào)TCF4表達,從而促進肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為〔18〕。敲除Tim-1可抑制Wnt/β-catenin信號通路激活,抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力〔19〕。miR-377-3p通過調(diào)節(jié)EMT和Wnt/β-catenin信號通路顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長和遷移〔20〕。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似,提示沉默GTPBP2可抑制Wnt/β-catenin信號通路活性。

綜上,GTPBP2在結(jié)直腸癌中高表達,沉默GTPBP2可抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,阻滯細(xì)胞周期進程,并促進凋亡,沉默GTPBP2可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌干細(xì)胞的惡性行為。