宋坤玉 張偉冬 李宗洋 于斌 李裕柳 尹宏兵 莊世偉

(1長春中醫(yī)藥大學,吉林 長春 130000 ;2長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院)

膝骨性關節(jié)炎(KOA)是一種關節(jié)退行性疾病,其最顯著的特征是關節(jié)軟骨的破損和碎裂,包括滑膜、軟骨成分(尤其是Ⅱ型膠原和聚集蛋白)、軟骨下骨和周圍軟組織的破壞,同時伴隨著關節(jié)功能障礙〔1〕。KOA在60歲以上的老年人中發(fā)生率為30%～50%〔2〕,KOA的發(fā)病機制錯綜復雜,包括遺傳、肥胖、創(chuàng)傷和年齡等多種因素,均可能導致其發(fā)生。據相關研究表明〔3〕,Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號通路在調控細胞增殖和分化方面扮演著至關重要的角色,該通路的異常會對軟骨細胞的正常代謝產生影響,導致軟骨及軟骨下骨的細胞表型和分子功能失衡,同時也會影響細胞外基質的合成,這在KOA的發(fā)病過程中具有重要意義。近年來研究表明,中藥方劑對于治療KOA有顯著效果。膝痹康方(XBKF)由蒼術、黃柏、熟地、雞血藤、肉蓯蓉、大黃、牛膝、赤芍、莪術等藥物組成,具有清熱除濕、補腎活血、消腫止痛的功效。在KOA的長期臨床治療中,XBKF顯著改善KOA的癥狀,改善患者健康和生活質量〔4〕。然而,XBKF治療KOA的具體機制尚未明確。本實驗觀察XBKF對KOA兔Wnt/β-catenin信號通路及細胞凋亡相關蛋白表達水平及炎性因子的影響,進一步探討XBKF對KOA軟骨的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級新西蘭大白兔30只,平均體質量2.5～3.0 kg,雌雄各半。實驗動物公司:長生生物科技有限公司,許可證號SCXK(黑)2017-008。實驗動物環(huán)境:長春中醫(yī)藥大學動物實驗中心(許可證號SYXK(吉)2018-0013)。每只單獨分籠喂養(yǎng),每日定時更換飼料、飲用水及清理大小便。實驗動物觀察室為開放式,溫度、照明、通風、噪音等條件控制在所規(guī)定范圍內。實驗方案經長春中醫(yī)藥大學動物醫(yī)學倫理委員會審核通過(倫理批號:2022-644)。

1.2實驗藥物 主要藥物:XBKF(配比如下薏苡仁50 g、蒼術、黃柏、熟地各25 g,雞血藤、肉蓯蓉各20 g,牛膝、赤芍、莪術、蘇木各15 g,大黃、木通、地龍、茯苓、甘草各10 g、蜈蚣2條、全蝎3 g)上述中藥選自長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院中藥房,將所購各位藥材加水后,兩次煎煮合并提取液,減壓濃縮為含生藥1 g/ml,于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。塞來昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司;規(guī)格:0.2 g/粒,批號:J20140072)。

1.3主要試劑 木瓜蛋白酶(公司:Biosharp,批號:BS190-25g),L-半胱氨酸(公司:Biosharp,批號:BS181-25g),速眠新Ⅱ(公司:圣達動物藥品有限公司,批號:070031582,),舒泰50(公司:Virbac China,批號:外獸藥證號43號),蘇木素-伊紅(HE)高清恒染、Wnt3a兔抗體、β-catenin兔抗體、Bcl-2兔抗體、Bax兔抗體(公司Servicebio,批號:G1076、GB113750、GB12015、GB112495、GB11247-1),兔IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(MM-0305O1,MM-0302O1,MM-0240O1,均購買于江蘇酶免實業(yè)有限公司)。

1.4主要儀器 動物跑步機(宇晟YS-J100)、酶標儀(公司:Rayto,型號:RT-6100)、超聲波細胞破碎儀(公司:寧波新芝生物,型號:JY92-11N)、臺式高速冷凍離心機(公司:DRAGONLAB,型號:D3024R)、烤箱(公司:天津市萊玻瑞儀器設備有限公司,型號:GFL-230)、化學發(fā)光儀(公司:CLINX,型號:6100)正置光學顯微鏡(公司:日本尼康,型號:Nikon Eclipse E100)等。

1.5實驗動物分組 將30只新西蘭健康大耳白兔采用隨機數字表法,分為空白組、模型組、塞來昔布組、膝痹康方低劑量(XBKF-L)組、膝痹康方高劑量(XBKF-H)組,每組6只。

1.6KOA模型制備 適應性喂養(yǎng)1 w后,除空白組外,其余4組參照文獻方法〔5〕進行造模:精確稱取木瓜蛋白酶0.4 g、L-半胱氨酸 36 mg,共同置于離心管中,加入生理鹽水 10 ml,均勻混合后4 ℃低溫冷藏保存。以兔子右膝建立模型:推去右腿兔毛,以髕骨下極髕韌帶外緣為進針點。分別于第1、4、7天注入配置好的溶液,并每日定時強迫大白兔在動物跑步機活動15 min。連續(xù)驅趕14 d后,空白組和造模組分別隨機抽取1只大白兔進行X光拍照觀察兔右膝關節(jié),建立穩(wěn)定的 KOA 兔模型。

1.7藥物干預 藥物治療于造模成功后第1天開始,各組兔連續(xù)灌胃4 w,給藥劑量按照徐叔云等〔6〕主編的《藥理實驗方法學》算出大白兔的等效劑量。每只兔每天灌胃液體量20 ml?？瞻捉M、模型組每只每日等量生理鹽水灌胃;塞來昔布組每只每日給予24 mg/(kg·d)塞來昔布灌胃;XBKF-L組每只每日給予8.7 g/(kg·d)膝痹康濃縮液灌胃;XBKF-H組每只每日給予17.4 g/(kg·d)膝痹康濃縮液灌胃;(分別相當于臨床等效劑量1、2 倍)。

1.8觀察兔一般情況 觀察實驗兔造模與給藥期間膝關節(jié)形態(tài),活動度和色澤等改變,及有無發(fā)熱現象,并對其精神狀態(tài)、進食狀況、毛發(fā)光澤及疏密程度,實驗兔步態(tài)和大小便色澤性狀進行觀察。

1.9觀察指標及方法 連續(xù)灌胃4 w,末次給藥后稱量每只兔的體重,右后肢肌肉注射進行麻醉,麻醉劑(舒泰50和速眠新Ⅱ,配比 6∶1),0.35 ml/kg,腹主動脈采血,4 ℃、1 500 r/min分離血清;在二氧化碳下安樂死后,無菌條件下分離膝關節(jié),將部分膝關節(jié)放入含4%多聚甲醛的EP管中,用于后續(xù)組織形態(tài)學觀察;部分膝關節(jié)放入凍存管中,置于-80 ℃冰箱中保存,用于后續(xù)蛋白檢測。

1.10HE染色觀察KOA兔關節(jié)軟骨的病理變化及Makin評分 取各組兔右側股骨頂點鈣化層以上軟骨制作標本,使用10%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液進行脫鈣,接著進行脫水、浸蠟、矢狀位包埋、切片(3 μm)。通過使用HE染技術色,在顯微鏡下觀察,并以Mankin評分進行評估〔7〕。

1.11ELISA檢測兔血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達 取各組兔血清樣品,按照ELISA試劑盒說明書操作,終止反應后測定每孔450 nm最大吸收波長的OD值,并繪制標準曲線,計算出樣品中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.12Western印跡檢測兔關節(jié)軟骨組織中Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax蛋白表達 取各組兔右膝關節(jié)軟骨組織標本,進行勻漿、離心處理后收集上清液,依次經測定蛋白濃度、上樣及電泳、轉膜、封閉和孵育抗體、滴加發(fā)光液后檢測膜上蛋白,獲取目的蛋白顯色條帶并讀取灰度值。以β-actin作為內參,分析各組兔關節(jié)軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、Bcl-2及Bax蛋白相對表達水平。

1.13統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組大白兔一般情況觀察 空白組大白兔未觀察到明顯異常,毛發(fā)茂密順滑,飲水攝食正常、大小便正常。各組造模的大白兔經造模后出現膝關節(jié)紅腫明顯,輕微發(fā)熱、伴有不同程度跛行、飲水攝食量下降,精神萎靡及體質量減輕;灌胃開始后的2 w,模型組、XBKF-L組膝關節(jié)腫脹程度較膝XBKF-H組及塞來昔布組更明顯,各藥物組兔活動量較前改善、精神萎靡好轉、飲水攝食量增加。造模結束后,經X線掃描:與空白組大白兔相比較,模型組大白兔右膝關節(jié)后可見骨間隙明顯變窄,骨質增生有骨贅生成,說明模型構建成功。見圖1。

圖1 空白組與模型組右膝關節(jié)X線

2.2各組大白兔關節(jié)軟骨組織病理觀察結果及Mankin評分 空白組軟骨表面光滑,細胞排列整齊,未見裂隙,各層組織完好均未見破壞,潮線清晰完整;與空白組相比,模型組軟骨表面膜樣結構破壞,軟骨細胞變少,甚者軟骨層出現裂隙樣破壞,Mankin評分明顯升高(P<0.05);經藥物治療后,與模型組相比,塞來昔布組軟骨表面較為光滑,軟骨細胞增多,部分軟骨核皺縮;XBKF-L組軟骨表面較為粗糙,細胞排列不齊,軟骨厚薄不均;XBKF-H組軟骨表面較光滑,有少量毛刺,細胞排列較為整齊,接近于空白組;塞來昔布組、XBKF-L組、XBKF-H組Mankin評分均明顯降低(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組軟骨組織Mankin評分、血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量、Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax 蛋白表達比較

箭頭所指為軟骨損傷處圖2 各組軟骨組織病理(HE染色)

2.3各組血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較 與空白組比較,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,經各藥物組治療后兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組膝軟骨組織中Wnt /β-catenin信號通路蛋白及凋亡蛋白表達 與空白組比較,模型組軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、Bax蛋白表達量顯著升高,Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05);經各藥物組治療后,與模型組比較,各藥物治療組 Wnt3a、β-catenin 、Bax蛋白表達量顯著降低,Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見表1、圖3。

1～5:空白組,模型組,塞來昔布組,XBKF-L組,XBKF-H組圖3 各組軟骨組織中Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax蛋白表達

3 討 論

KOA導致活動嚴重受限甚至無法移動〔8〕。KOA的確切發(fā)病機制至今仍未被完全闡明。XBKF是臨床治療KOA等疾病常用方,其在臨床應用中表現出顯著的療效,具有除濕止痛的功效。XBKF中重用北蒼術、黃柏為君,以清熱解毒、祛風除濕,二藥合而為君,具有利濕、瀉火、止痛、解毒的功效,清熱燥濕力強,標本兼顧,北蒼術辛甘祛濕,脾胃最喜,故亦入之;臣以牛膝、薏苡仁、熟地黃、雞血藤、赤芍、莪術、蘇木以滋陰補血,舒筋活絡,益精填髓,具有補肝腎,強筋骨的功效;佐以大黃、木通、地龍、茯苓、蜈蚣及全蝎,大黃瀉下攻積,清熱逐瘀,涼血解毒,滌蕩濕熱瘀結之毒,木通利尿通淋,通經除煩,地龍、蜈蚣、全蝎走竄性強,破血通絡,以息風鎮(zhèn)痙,通絡止痛,攻毒散結,茯苓利水滲濕,健脾寧心,共為佐藥;使以甘草,以清熱益氣,調和諸藥,避免清熱消腫之力過盛而傷及正氣。通過本實驗研究發(fā)現,XBKF在治療膝骨關節(jié)炎中發(fā)揮的作用與非甾體抗炎藥基本一致,鑒于中藥復方具有副作用較小、不良反應發(fā)生率低,適合長期服用的優(yōu)點,這對KOA疾病治療藥物的選擇有一定意義。

Wnt/β-catenin信號通路在KOA的進展中扮演著重要的調控角色,對于關節(jié)軟骨的形成、分化及軟骨細胞的凋亡和增殖具有至關重要的影響〔9〕。該信號通路不僅參與了多種組織病理過程如炎癥反應及退行性改變,還影響著骨關節(jié)炎和骨性關節(jié)炎患者體內細胞因子表達水平及基質金屬蛋白酶(MMPs)活性〔10〕。在軟骨增生期間,Wnt信號對軟骨細胞分化起重要的調節(jié)作用,根據研究結果,Wnt3a被認為是關節(jié)軟骨領域中最具代表性的Wnt之一〔11〕。在KOA中,Wnt3a被激活,從而促進了MMPs的表達,導致軟骨組織的退化和炎癥反應的發(fā)生〔12〕。目前認為它參與了多種炎癥反應及退變機制,并通過影響細胞因子和黏附分子等起著調節(jié)作用。而在Wnt/β-catenin信號通路中,β-catenin則扮演著不可或缺的角色〔13〕。本研究說明,XBKF可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活,從而抑制細胞凋亡,延緩疾病進程。

膝骨關節(jié)炎的主要特征在于軟骨組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子的增加,炎癥在骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起核心作用〔14〕。IL-1β通過抑制Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的分泌,誘導MMP-1、MMP-3、MMP13的表達上調,從而阻斷軟骨細胞的合成并破壞軟骨組織〔15〕。此外,還可引起滑膜增生及關節(jié)腔積液。IL-6的作用在于刺激成纖維細胞的生成,同時促進了OA中IL-1β和TNF-α等細胞因子的破壞能力,從而促進了軟骨基質的快速降解〔16〕。因此認為,骨關節(jié)炎的發(fā)病機制可能與其炎性介質及相關因子的過度釋放密切相關。在骨關節(jié)炎的進展過程中,炎癥反應持續(xù)存在,而由于炎性刺激所引起的疼痛則是其主要表現之一。因此,減輕炎癥損傷已成為治療該病的關鍵。近年來,許多學者對緩解及預防KOA進行了深入研究。大量研究表明,改善KOA的機制與降低關節(jié)液或血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平有關〔8,17～20〕。目前臨床上對于膝骨關節(jié)炎患者常采用抗炎、鎮(zhèn)痛及改善關節(jié)功能的系統(tǒng)治療方案來控制病情的發(fā)展。本研究說明XBKF對于膝關節(jié)骨性關節(jié)炎有較好的抗炎效果,且未發(fā)現對胃腸道等副作用。