任炳秀 王欣 周呈義 靖功偉 陶敏 麻錦心 王嬌亞 葉梅

(遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院(遵義市第一人民醫(yī)院) 1核醫(yī)學科,貴州 遵義 563002;2醫(yī)院感染管理科)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的神經系統(tǒng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為進行性記憶障礙,研究表明β-淀粉樣蛋白(Aβ)和過度磷酸化的tau是AD的核心病理物質〔1〕;既往研究顯示,甲狀腺激素在大腦學習和記憶中起重要作用〔2〕,但AD與甲狀腺功能異常之間的關系目前仍不清楚,尤其是在甲狀腺功能異常誘發(fā)和(或)加重了AD還是AD誘發(fā)甲狀腺功能異常方面目前還不清楚。因此本研究以PC12細胞作為研究對象,在體外培養(yǎng)條件下以岡田酸(OA)誘導PC12細胞tau磷酸化以建立AD細胞模型,并對細胞表達甲狀腺激素受體表達情況檢測,觀察AD病理變化對PC12細胞甲狀腺激素受體蛋白及基因表達的影響。

1 資助與方法

1.1主要實驗材料 未分化PC12細胞(南京金斯瑞生物科技有限公司),OA (Sigma-Aldrich Biotech Co.Ltd.),甲狀腺激素受體(THRα,β)PCR試劑盒(yeasen Biotech Co.Ltd.),Western印跡所有抗體、試劑(南京金斯瑞生物科技有限公司),細胞培養(yǎng)基、馬血清(15%)胎牛血清(2.5%;Gibco,Invitrogen,USA),噻唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)(Beijing labgic Technology Co.Ltd.),神經生長因子(NGF,ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.),MTT檢測試劑盒(Sigma-Aldrich Biotech Co.Ltd.)。

1.2主要實驗儀器 生物安全柜(Jinan Biobase Biotech Co.td),ABI7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Co.td,USA),Multiskan FC酶標儀(Thermo Scientific,Co.Ltd.),免疫熒光顯微鏡檢測系統(tǒng)(NOVA View,INOVA Diagnostics,Inc.)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)儀和轉膜儀(Jinan Biobase Biotech Co.td)。

1.3PC12細胞的培養(yǎng)及OA誘導實驗 將PC12細胞按1×104/ml 10 ml接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中,于37 ℃含20%CO2的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng),培養(yǎng)基含90%的高糖DMEM、5%馬血清、5%胎牛血清、0.01%谷氨酰胺組成。培養(yǎng)5～10 d后,經0.25%胰蛋白酶消化(37 ℃,5 min)傳代,以1×104/ml 10 ml接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中進行擴增培養(yǎng)。將PC12細胞分為6組,每組6瓶,分別加入0、10、20、30及40 nmol/L的OA,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新鮮不含OA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 w,消化離心棄去培養(yǎng)液、加入含5%MTT的培養(yǎng)液,置于5 ml EP管中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,移去上清液,每管加入1 ml二甲基亞砜(DMSO),置于搖床上低速搖蕩10 min,在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測細胞在490 nm處的吸光值。

1.4PC12細胞AD模型驗證 根據(jù)MTT試驗結果,選擇濃度為0 nmol/L作為對照組、30及40 nmol/L OA為處理組細胞作為研究對象,收集相應組別細胞分別檢測Aβ(Western印跡和免疫熒光法)磷酸化tau(P-tau)、PP2A和酪氨酸307磷酸化的PP2A(PP2Ac-yp307)的表達情況以驗證細胞模型是否成功。

1.5OA處理后PC12細胞甲狀腺激素受體相關蛋白及基因表達情況檢測 分別收集對照組、OA濃度為30及40 nmol/L OA為處理組細胞(每組6瓶)檢測細胞甲狀腺激素受體(THR)α,β的蛋白(Western印跡)及基因(Real-time PCR)表達情況。

1.6圖像分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理 使用ImageJ軟件對圖像的灰度值進行定量分析,所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1MTT結果 與對照組〔(99.23±0.85)%〕比較,經30及40 nmol/L OA處理24 h后存活細胞明顯降低〔(68.76±1.59)%、(51.11±2.68)%,P<0.001〕,且光密度(OD)值(0.16±0.01、0.12±0.01)較對照組(0.22±0.01)明顯降低(P<0.001)。

2.2PC12細胞AD模型鑒定果 Western印跡及免疫熒光結果均顯示,經30、40 nmol/L OA處理后,PC12細胞的Aβ蛋白表達明顯高于對照組,其熒光表達強度也明顯高于對照組,40 nmol/L OA組Aβ蛋白表達明顯高于30 nmol/L OA組(P<0.01,P<0.000 1),見圖1、圖2、表1。與對照組比較,30、40 nmol/L OA組PP2AC-yp307、p-tau(ser396/404)、p-tau(Thr231)、tau-5表達明顯升高而PP2A表達明顯降低;40 nmol/L OA組PP2A、p-tau(ser396/404)明顯低于30 nmol/L OA組,但實驗組之間tau-5表達無明顯差別。見表1、圖3。

表1 各組Aβ蛋白、P-tau、PP2A、PP2Ac-yp307表達比較

圖1 Western印跡檢測PC12細胞表達Aβ蛋白

圖2 各組PC12細胞Aβ蛋白(免疫熒光法,×50)

圖3 Western印跡檢測各組tau磷酸化結果

2.3PC12細胞甲狀腺激素受體相關蛋白及基因表達結果 PC12細胞經30、40 nmol/L OA處理后,THRα、β表達均明顯升高,且40 nmol/L OA組THRα,β表達明顯高于30 nmol/L OA組(P<0.01,圖4,表2);與對照組比較,40 nmol/L OA組細胞THRα、β基因明顯升高(P<0.05),30 nmol/L組THRα基因表達無明顯變化(P>0.05),但THRβ基因表達明顯升高(P<0.05),30、40 nmol/L OA組間THRα、β基因表達無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表2 各組PC12細胞表達THRα、β蛋白

表3 各組PC12細胞表達THRα、β基因表達

圖4 Western印跡檢測各組PC12細胞表達THRα、β蛋白

3 討 論

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株,具神經內分泌細胞的一般特征,因其具可傳代特點,廣泛應用于神經生理和神經藥理學研究〔3〕,岡田酸可使神經元細胞發(fā)生淀粉樣變性和誘導tau蛋白過度磷酸化而常被用于制備細胞及動物阿爾茨海默病(AD)模型的化學試劑〔4〕,本實驗所使用OA濃度在20～40 nmol/L時細胞的存活率與文獻〔3,4〕所報道基本相似。研究結果與以往研究結果相符〔5〕。

血清甲狀腺激素水平與AD病情的相關性方面的研究目前已有很多報道,但研究結論并不一致〔6,7〕;但在甲狀腺激素與大腦學習記憶的相關性方面,目前國內外學者已有大量研究,且結論基本一致〔8,9〕,有研究表明AD患者腦組織中THRα、β表達異常升高與現(xiàn)神經絲氨酸激酶升高具有相關性〔10〕,這些發(fā)現(xiàn)為甲狀腺激素紊亂和老年癡呆癥之間的潛在關系提供了證據(jù),本研究結果提示,在AD發(fā)生發(fā)展過程中可能存在腦組織局部甲狀腺受體異常,但需要進一步的動物模型研究。

甲狀腺激素(TH)有兩種活性形式,三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸或甲狀腺素(T4),T4的半衰期長于T3,被認為是循環(huán)中主要的TH形式。從TH總產量中,93%為T4,7%是T3〔11〕,T4在血清中與蛋白質結合或以游離形式游離T4(FT4)。當T4在組織中時,它被脫碘酶轉化為T3,這被認為是TH的代謝活性形式,或反T3(rT3),這是一種滅活的形式〔12〕,最后,T3與其核THR結合,然后靶基因被抑制或激活〔13〕;文獻報道,T3可抑制神經母細胞瘤細胞中淀粉樣前體蛋白基因的表達,且T3負調控淀粉樣前體蛋白基因表達〔14〕,在AD細胞模型中,Aβ蛋白表達明顯增加,需要更多的T3進入細胞內,因此THR表達上調,此結果與既往臨床報道在AD尸檢中發(fā)現(xiàn)腦組織THR升高的結果相一致〔15〕。在30 nmol/L OA處理組有THRβ基因表達上調,而40 nmol/L OA處理組中THRα、β表達均上調,但兩組甲狀腺激素受體基因表達之間無明顯差別,其可能原因與兩組間OA濃度差偏小有關。