陳欣悅 宋冬冬 趙晴 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院南湖神經(jīng)內(nèi)科,吉林 長春 130000)

血管性癡呆(VD)通常由腦血管疾病所引起,它是導(dǎo)致老年癡呆的一個重要原因。但VD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)有研究對其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。中醫(yī)藥對VD的防治具有重要價值。人參皂苷Re的抗炎〔1〕和抗氧化〔2〕及對海馬體中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和可塑性相關(guān)蛋白的正向調(diào)節(jié)使其可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,對抗認(rèn)知功能障礙〔3〕。燈盞花素有抗血栓形成、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡〔4〕、清除氧自由基、抑制血小板聚集等作用,可有效減少炎癥細(xì)胞因子、降低氧化應(yīng)激和促凋亡蛋白表達(dá)〔5〕,對腦缺血損傷帶來的認(rèn)知功能障礙具有顯著改善作用〔6〕。本文旨在探討人參皂苷Re與燈盞花素組合物對VD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康SPF級成年雄性SD大鼠64只,體質(zhì)量為190～210 g。實(shí)驗(yàn)動物由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司〔許可證號:SCXK(遼)2020-0001〕提供,保持12 h的明暗循環(huán),適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。人參皂苷Re與燈盞花素均購自天馬(安徽)國藥科技有限公司,血塞通膠囊購自云南維和藥業(yè)股份有限公司,注射用青霉素鈉購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.2動物模型制備及分組 采取永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法制備VD大鼠模型,假手術(shù)組采用頸部正中切口鈍性分離,僅分離暴露出雙側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎,其他處理同模型組。術(shù)后2 w,行Morris水迷宮篩查實(shí)驗(yàn),將伴有游泳障礙的大鼠剔除。隨機(jī)選取其中造模成功的大鼠64只,遵循體質(zhì)量均衡原則分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥組(42 mg/kg血塞通膠囊每日10 ml/kg體積)、組合物低劑量組(人參皂苷Re 2.5 mg/kg+燈盞花素1 mg/kg每日10 ml/kg體積)、組合物中劑量組(人參皂苷Re 5.0 mg/kg+燈盞花素2 mg/kg每日10 ml/kg體積)、組合物高劑量組(人參皂苷Re 10.0 mg/kg+燈盞花素4 mg/kg每日10 ml/kg體積)、人參皂苷Re組(10 mg/kg每日10 ml/kg體積)、燈盞花素組(4 mg/kg每日10 ml/kg體積),每組8只。術(shù)后給予正常進(jìn)食飲水并腹腔注射青霉素〔8萬U/(kg·5 ml)〕3 d預(yù)防術(shù)后感染,3 d后除假手術(shù)組和模型組外,各組術(shù)后灌胃給予相應(yīng)藥物(每日1次),持續(xù)28 d,假手術(shù)組和模型組給予等體積純凈水(10 ml/kg)。

1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組給藥28 d結(jié)束后,每組大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)前有1 d的適應(yīng)性訓(xùn)練。在適應(yīng)性訓(xùn)練后的第2天,使用Morris水迷宮對大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)由5 d的定位航行試驗(yàn)及1 d的空間探索實(shí)驗(yàn)構(gòu)成,兩者分別對大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力進(jìn)行檢測。

1.3.1定位航行試驗(yàn) 連續(xù)5 d于上午固定時間段將各組大鼠隨機(jī)從任一象限起始點(diǎn)作為入水點(diǎn),頭朝向池壁放入水中,讓大鼠在水中自由游動。當(dāng)天的逃避潛伏期是指大鼠找到平臺的時間(60 s內(nèi)未找到平臺則按60 s計算),取3次平均值。若大鼠可以在60 s內(nèi)成功爬上平臺,則讓其在平臺上停留10 s以強(qiáng)化記憶。若大鼠在60 s內(nèi)不能找到平臺,則將大鼠帶到平臺上停留10 s再按順時針方向由下一象限入水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2空間探索實(shí)驗(yàn) 空間探索實(shí)驗(yàn)于定位航行試驗(yàn)結(jié)束24 h后開始進(jìn)行,需要將平臺撤去。實(shí)驗(yàn)需要將大鼠頭朝池壁放入第Ⅰ象限入水點(diǎn),記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺次數(shù)。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠斷頭取海馬組織,于10%甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟切片,HE染色,于光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察大鼠海馬區(qū)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.5海馬組織細(xì)胞因子含量 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定大鼠海馬組織內(nèi)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮結(jié)果

2.1.1定位航行試驗(yàn)結(jié)果 模型組逃避潛伏期比假手術(shù)組顯著延長(P<0.001),VD動物模型復(fù)制成功。與模型組比較,陽性藥組在定位航行試驗(yàn)第1天,逃避潛伏期差異無顯著性(P>0.05)。從第2天開始,陽性藥組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01,P<0.05,P<0.001)。組合物低劑量組逃避潛伏期僅有降低趨勢,但無顯著差異(P>0.05)。組合物中、高劑量組及燈盞花素組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。人參皂苷Re組逃避潛伏期在訓(xùn)練第1、2、5天明顯縮短(P<0.05),而第3天及第4天兩組逃避潛伏期無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 人參皂苷Re、燈盞花素組合物對VD大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)的影響

2.1.2空間探索試驗(yàn)結(jié)果 模型組穿過平臺次數(shù)比假手術(shù)組顯著減少(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組、組合物高劑量組過平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)。組合物低劑量組、組合物中劑量組、人參皂苷Re組、燈盞花素組穿過平臺次數(shù)無顯著變化(P>0.05)。見表1。

2.2大鼠海馬組織細(xì)胞形態(tài)觀察 假手術(shù)組中錐體細(xì)胞體積較大,胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核清晰飽滿,可見清晰的核染色質(zhì),錐體細(xì)胞分布數(shù)量較多,極少見到細(xì)胞發(fā)生胞質(zhì)固縮現(xiàn)象。模型組中錐體細(xì)胞分布數(shù)量減少,細(xì)胞胞質(zhì)含量下降,核染色質(zhì)不清;多見錐體細(xì)胞發(fā)生固縮現(xiàn)象,固縮細(xì)胞整體皺縮,胞體染色變深,胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)分不清。與模型組比較,陽性藥組錐體細(xì)胞損傷狀態(tài)有減輕,錐體細(xì)胞胞質(zhì)豐富度增加,發(fā)生固縮的大腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少;組合物低劑量組可見組織內(nèi)分布固縮的神經(jīng)元細(xì)胞;組合物中劑量組錐體細(xì)胞數(shù)量中度增加,胞質(zhì)與細(xì)胞核較為清晰,細(xì)胞發(fā)生固縮現(xiàn)象較少;組合物高劑量組錐體細(xì)胞損傷狀態(tài)明顯減輕,錐體細(xì)胞數(shù)量明顯增多,胞質(zhì)清晰,細(xì)胞核清晰可見,少見細(xì)胞發(fā)生固縮現(xiàn)象;人參皂苷Re組與燈盞花素組錐體細(xì)胞狀態(tài)改善作用較相對穩(wěn)定,也可見減少大腦錐體神經(jīng)元細(xì)胞固縮現(xiàn)象的發(fā)生。見圖1。

圖1 各組海馬組織細(xì)胞形態(tài)(HE染色,×400)

2.3各組海馬組織的細(xì)胞因子含量比較 模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均比假手術(shù)組顯著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。與模型組比較,組合物高劑量組和陽性藥組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著減少(P<0.05,P<0.01)。組合物低劑量組僅IL-1β含量顯著減少(P<0.05),IL-6、TNF-α含量無顯著差異(P>0.05)。組合物中劑量組IL-1β、TNF-α含量顯著減少(P<0.05),IL-6含量無顯著差異(P>0.05)。燈盞花素組與人參皂苷Re組各細(xì)胞因子含量有一定的減少趨勢但無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 人參皂苷Re、燈盞花素組合物對VD模型大鼠細(xì)胞因子的影響

3 討 論

VD是唯一可進(jìn)行預(yù)防的癡呆類型,若早期對VD患者進(jìn)行干預(yù)及治療,可有效延緩疾病發(fā)展。人參皂苷Re可顯著改善VD大鼠的認(rèn)知能力,這可能與促進(jìn)長時程增強(qiáng)的形成及抗膽堿能系統(tǒng)有關(guān)。現(xiàn)有研究證明,燈盞花素的抗炎、抗凋亡、抗血管內(nèi)皮損傷〔7〕等作用可能是導(dǎo)致其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示人參皂苷Re與燈盞花素組合物可改善VD大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力,而組合物高劑量組效果更為顯著。而單用人參皂苷或燈盞花素均對VD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力無明顯改善作用,這可提示兩者組合物具有協(xié)同增效作用。

海馬是與學(xué)習(xí)記憶、空間定位有關(guān)的重要部位〔8〕。因海馬對缺血、缺氧較為敏感,所以發(fā)生腦缺血時海馬區(qū)極易受損。因此,海馬組織的缺血可能形成了VD的病理基礎(chǔ)〔9〕。人參皂苷Re可以被血液吸收并迅速滲透到大腦中,它被認(rèn)為是直接影響神經(jīng)元的主要化合物〔10〕,可以顯著減少認(rèn)知障礙小鼠神經(jīng)元的損失〔11〕。燈盞花素可以降低腦損傷后腦組織含水量,改善海馬組織的病理損傷〔12〕。除此之外,燈盞花素可以抑制腦缺血模型大鼠的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬,增強(qiáng)其神經(jīng)保護(hù)作用〔13〕。本研究結(jié)果提示VD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡可致使其學(xué)習(xí)、記憶能力下降,而人參皂苷Re與燈盞花素組合物對缺血大腦有重要的保護(hù)作用,可以通過抑制海馬神經(jīng)元的凋亡從而改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙。

研究發(fā)現(xiàn),在所有的VD動物模型中,TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的表達(dá)均顯著升高,這與臨床上 VD發(fā)病機(jī)制相吻合〔14〕。在腦缺血發(fā)生過程中,IL-6參與其炎癥反應(yīng)。IL-1β可以對B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的激活起到促進(jìn)效果,而且還可以強(qiáng)化白細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,并可以調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6的產(chǎn)生〔15〕。抑制TNF-α蛋白合成已被證明可以減輕受損神經(jīng)元的損害,并緩解由神經(jīng)炎癥引起的認(rèn)知缺陷〔16〕。人參皂苷Re可以對小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6、TNF-α、一氧化氮的產(chǎn)生進(jìn)行抑制,而不會對細(xì)胞活性造成任何影響,通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子及神經(jīng)毒性因子,來對海馬細(xì)胞起到保護(hù)作用〔17〕。燈盞花素可以顯著降低炎性細(xì)胞因子表達(dá),降低了促凋亡蛋白表達(dá),并抑制了NF-κB信號傳導(dǎo)和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化〔18〕。本研究結(jié)果提示,人參皂苷Re與燈盞花素組合物可有效抑制炎癥因子從而顯著降低海馬區(qū)炎癥反應(yīng)。

綜上,VD是一個多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的級聯(lián)反應(yīng)所造成的認(rèn)知功能障礙,而人參皂苷Re與燈盞花素組合物可有效改善VD大鼠的認(rèn)知能力,降低VD大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡,抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成,對VD模型大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。