王知剛 胡聰 張波 (湖北民族大學附屬民大醫(yī)院口腔醫(yī)學中心,湖北 恩施 445000)

牙周炎主要是由微生物引起的牙周組織感染性疾病,該病的發(fā)生與心臟病、糖尿病與骨質疏松等全身性疾病相關,且隨著病情的發(fā)展可引起局部組織發(fā)生改變,出現(xiàn)結蹄組織喪失與吸收牙槽骨,使牙齒脫落〔1,2〕。牙周炎發(fā)生后無法治愈,且隨著炎癥的進展逐漸加重,損傷牙周圍組織〔3〕。木犀草素可對機體免疫功能進行調節(jié),抵抗炎癥的發(fā)生,并抑制氧化反應,木犀草素可通過調節(jié)巨噬極化來發(fā)揮抗炎作用,并促進牙周膜細胞的成骨分化,發(fā)揮抗炎作用〔4〕。牙周病的牙齒缺失是因牙槽骨的吸收造成的,骨保護素(OPG)與骨吸收的過程密切相關〔5〕。本研究分析木犀草素調控OPG對牙周炎大鼠干預效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 選取SPF級8～10周齡雄性大鼠60只,購自廣東省華微檢測股份有限公司,動物許可證號:SYXK(粵)2021-0249,體質量(255.32±31.63)g,將其放于相對濕度為(40.25±5.32)%、溫度為(22.31±2.44)℃進行飼養(yǎng)1 w,每日光照12 h,飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水。本試驗操作均嚴格參照動物實驗倫理要求相關規(guī)定進行,且獲得醫(yī)院倫理委員會審批同意。主要試劑:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒及相關試劑(深圳市安提生物科技有限公司);木犀草素(南京植佰萃生物科技有限公司);小鼠抗大鼠核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP)3(上海信裕生物科技有限公司)、兔抗人白細胞介素(IL)-1β抗體(武漢華美生物工程有限公司),OPG抗體(上海彩佑實業(yè)有限公司)。

1.2分組與建模 選取15只大鼠作為對照組,不做任何處理,其余45只參照白國輝等〔6〕研究中建模方法對大鼠建立牙周炎模型,禁食所有大鼠24 h,并將10%氯醛(0.2 ml/100 g)注入大鼠腹腔,麻醉后將4.0絲線放入大鼠齦溝處,并對大鼠左側上頜第1磨牙處進行結扎,并用眼科細剪將牙齦割破1 mm。7 d后觀察大鼠牙周情況,建模成功標準為大鼠牙齦處紅腫、探診出血、且形成深牙周袋。建模成功將大鼠隨機分為模型組、木犀草素低、高劑量組各15只。

1.3木犀草素干預 建模成功后對木犀草素低、高劑量組給予100 mg/kg木犀草素灌胃,對照組與模型組給予10 ml/kg生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)7 d。

1.4樣本采集 在最后1次灌胃處理24 h后,按照在遵從動物實驗倫理的情況下處死每組5只大鼠,將大鼠上頜左側第1磨牙及牙周組織分離,并剪取0.5 g,放入-80 ℃冰箱中,保存待用,將剩下組織放入4%甲醛中進行固定,制作石蠟切片,待用。

1.5病理組織學觀察 取石蠟切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色,后進行脫水,并采用中性樹膠做封存處理,顯微鏡下觀察5個視野。

1.6OPG表達量檢測 免疫組化法對OPG表達量進行檢測,取石蠟組織切片,脫水處理后加入一抗,4 ℃孵育過夜,后加入二抗,室溫下孵育,15 min后加入二氨基聯(lián)苯胺(DBA)進行顯色處理,并加入蘇木素復染,采用中性樹膠做封存處理,顯微鏡下觀察5個視野,陽性表達為棕色和棕黃色。

1.7牙槽骨吸收情況檢測 取石蠟組織切片,進行三維拍攝,對骨小梁數(shù)目(Tb.N),骨小梁分離度(Tb.Th),骨小梁厚度(Tb.Sp)進行檢測,并檢測釉牙骨質界(CEJ)至牙槽嵴頂(ABC)距離,觀察牙槽骨吸收情況。

1.8破骨細胞數(shù)及核因子κB受體活化因子配體(RANKL)水平檢測 取石蠟組織切片,進行脫蠟水化處理,并采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,后采用中性明膠封存,顯微鏡下觀察5個視野處破骨細胞數(shù)計數(shù),重復檢測3次,進行記錄。使用免疫組化法檢測RANKL水平,取上述牙周組織石蠟切片,進行脫蠟水化,后加入一抗,4 ℃孵育過夜,后加入二抗,15 min后加入DBA進行顯色處理,并加入蘇木素復染,采用中性樹膠做封存處理,顯微鏡下觀察5個視野。

1.9NLRP3/IL-1β通路蛋白檢測 采用Western印跡法檢測各組大鼠牙周組織中NLRP3、IL-1β蛋白表達量,取上述牙周組織,將其放入勻漿器中,加入400 μl單去污劑裂解液裂于勻漿器中勻漿,并放于冰上碾碎,裂解后放入1.5 ml離心管,離心處理5 min,取上層清液保存于-20 ℃,使用二喹啉甲酸(BCA)檢測蛋白濃度,進行電泳處理,轉膜后加入一抗,4 ℃孵育過夜,第2天加入二抗室溫下孵育2 h,使用TBST進行洗膜,后加入ECL發(fā)光液,定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內參。

1.10統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行方差分析,兩組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1組織學觀察 對照組牙周組織完整、清晰,且形態(tài)正常,無病理損傷,模型組牙周組織上皮殘缺、破裂,形態(tài)正常,牙周膜纖維排列紊亂,發(fā)生炎性細胞浸潤,木犀草素低、高劑量組牙周組織病理損傷減輕,且隨劑量增加減輕程度較大。見圖1。

圖1 各組牙周組織學(HE染色,×100)

2.2各組OPG表達量對比 與對照組相比,模型組、木犀草素低、高劑量組OPG水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,木犀草素低、高劑量組OPG水平明顯升高(P<0.05);與木犀草素低劑量組相比,木犀草素高劑量組OPG水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組OPG表達量、牙槽骨吸收、破骨細胞數(shù)及RANKL表達

2.3木犀草素對大鼠牙槽骨吸收的影響 與對照組相比,模型組、木犀草素低、高劑量組Tb.N、Tb.Th表達量明顯降低,Tb.Sp、CEJ-ABC表達量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,木犀草素低、高劑量組Tb.N、Tb.Th表達量明顯升高,Tb.Sp、CEJ-ABC表達量明顯降低(P<0.05);與木犀草素低劑量組相比,木犀草素高劑量組Tb.N、Tb.Th表達量明顯升高,Tb.Sp、CEJ-ABC表達量明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4木犀草素對牙周組織破骨細胞數(shù)及RANKL的影響 與對照組相比,模型組、木犀草素低、高劑量組破骨細胞數(shù)、RANKL表達量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,木犀草素低、高劑量組破骨細胞數(shù)、RANKL表達量明顯降低(P<0.05);與木犀草素低劑量組相比,木犀草素高劑量組破骨細胞數(shù)、RANKL表達量明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.5木犀草素對各組NLRP3/IL-1β信號通路蛋白表達量對比 與對照組相比,模型組、木犀草素低、高劑量組NLRP3、IL-1β表達量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,木犀草素低、高劑量組NLRP3、IL-1β表達量明顯降低(P<0.05);與木犀草素低劑量組相比,木犀草素高劑量組NLRP3、IL-1β表達量明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組NLRP3/IL-1β信號通路蛋白表達量對比

1～4:對照組,模型組,木犀牛草素低、高劑量組圖2 Western印跡檢測各組NLRP3/IL-1β通路蛋白

3 討 論

牙周炎是由口腔不良環(huán)境引起的,患病率較高,可使牙齦紅腫、出血,嚴重時可引起牙齒脫落,不及時治療導致患者牙齒病變〔7,8〕。研究表明〔9,10〕,牙周炎可導致患者發(fā)生免疫性疾病,并引起心血管病變,對患者生質量具有較大影響。

臨床研究顯示〔11,12〕,在果蔬與藥材中,存在木犀草素,木犀草素具有較多藥理活性,可抑制炎癥因子的表達,并增強機體內的抗氧化活性,使氧化與抗氧化狀態(tài)保持平衡,可用于多種炎癥相關疾病的治療,抑制肝細胞癌的生長、浸潤與轉移。本研究顯示,牙周炎可引起牙周組織的炎癥反應,木犀草素可使大鼠牙槽骨吸收受到抑制,并促進牙槽骨的再生,且牙槽骨的再生受到劑量的影響。

破骨細胞主要是由造血干細胞產(chǎn)生,在骨骼的生長、發(fā)育中具有重要作用,可使機體內骨骼的完整性得以維持,RANKL、OPG在破骨細胞的調控中發(fā)揮著重要作用,抑制破骨細胞可減少骨吸收〔13〕。OPG可抑制破骨前體細胞的分化,為RANKL的天然可溶性誘導受體,表達于樹突狀細胞、B淋巴細胞、成骨/基質細胞與成纖維細胞前體〔14〕。OPG為TNF受體家族成員,為可溶性糖蛋白,在細胞外的形式為雙體與單體,且雙體與單體生理活性相同〔15〕。研究顯示〔16〕,RANKL在骨吸收中具有重要作用,主要表達于成骨/基質細胞與活化的淋巴細胞。RANKL分為mRANKL與sRANKL,可促進骨吸收并刺激破骨細胞分化〔17〕。本研究結果表明,木犀草素可使RANKL表達受到抑制,減少破骨細胞的形成,使牙槽骨的吸收受到抑制。

IL-1β在機體的炎癥反應中具有重要作用,主要是由巨噬細胞、單核細胞分泌,為基因多顯性多肽調節(jié)因子,生物活性較為廣泛,在機體的免疫應答、細胞的生長與分化等方面具有重要作用,IL-1β可殺傷慢性牙周炎相關細胞,并使炎癥細胞的抗感染能力增強,促進細胞的增殖與分化,并在自身免疫病的病理損傷中具有重要作用〔18,19〕。NLRP3在慢性牙周炎的發(fā)病過程中具有重要調控作用,可使慢性牙周炎發(fā)生時的牙周膜滲透性增強,可增強慢性牙周炎發(fā)生時牙周膜的滲透性,并可抑制牙周膜上皮細胞的凋亡〔20,21〕。本研究結果表明,木犀草素可使NLRP3/IL-1β蛋白的表達受到抑制,且抑制牙槽骨的吸收。