常學(xué)鋒 曲萌 顧明 石賀 何援越 趙東明 王思文 鄒德利

(北華大學(xué) 1附屬醫(yī)院急診科,吉林 吉林 132011;2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室;3附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

心力衰竭是好發(fā)于中老年人群的慢性疾病,據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示〔1〕,發(fā)達(dá)國家中心力衰竭發(fā)生率約為2.0%,其中65歲以上人群心衰占比更是超過1/10,而我國目前心力衰竭患病率約為1.3%,全國心衰患者接近1 800萬。研究表明,盡管目前治療和康復(fù)等技術(shù)發(fā)展,心力衰竭再住院率仍高達(dá)24.5%,約20.0%和50.0%患者在確診后1年和5年內(nèi)死亡,該數(shù)據(jù)與癌癥相當(dāng),甚至高于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌等多種常見癌癥的死亡率〔2〕。心肌肥大是導(dǎo)致心力衰竭的重要致病因素,是指心肌細(xì)胞體積增大、重量增加,包括向心性肥大和離心性肥大兩個(gè)類型,是心臟在長時(shí)間負(fù)荷過重的情況下導(dǎo)致的。心肌肥大是慢性心力衰竭的一個(gè)重要的代償方式,使心臟在一段時(shí)間內(nèi)維持機(jī)體對(duì)心輸出量的需求,而不至于發(fā)生心力衰竭,但持續(xù)心肌肥大可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)不可逆重塑,最終導(dǎo)致心力衰竭病情加重。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體通過自噬實(shí)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的清除,是目前治療心肌肥大所致心力衰竭的重要靶點(diǎn)。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)1是調(diào)節(jié)典型β-連環(huán)蛋白(catenin)活性的重要因子,同時(shí)也被認(rèn)為是Wnt信號(hào)通路的抑制劑,既往研究發(fā)現(xiàn)〔3〕,SFRP1可抑制Wnt信號(hào)通路激活,阻礙心肌梗死后纖維化進(jìn)程,其原理是抑制Wnt信號(hào)通路下游自噬相關(guān)基因(ATG)級(jí)聯(lián)蛋白表達(dá)。本研究中擬采用血管緊張素(Ang)Ⅱ刺激小鼠H9C2細(xì)胞建立一個(gè)體外心肌肥大模型,用腺相關(guān)病毒9型(AAV9)-SFRP1對(duì)其進(jìn)行治療,努力為心肌肥大、心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的心力衰竭和心臟性猝死提供新的治療方法并探索其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 H9C2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫。從Abcam購買以下主要抗體:SFRP1(ab4193)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2(ab32124)、Bcl-2相關(guān)X相關(guān)蛋白(Bax,ab232479)、細(xì)胞色素(Cyt)c(ab244288)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase-3,ab32351)、p62(ab109012)、ATG5(ab108327)、Beclin1(ab207612)、心房鈉尿肽(ANP,ab251006)、腦鈉尿肽(BNP,ab309127)、β-肌球蛋白重鏈(MHC,ab37484)、GAPDH(ab181602)。Ang Ⅱ和3-甲基腺嘌呤(MA)從Sigma購買。腺相關(guān)病毒9型過表達(dá)人全長SFRP1(AAV9-SFRP1)由漢寶(中國上海)制造;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑從Hyclone購買。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與心肌肥大模型建立 采用含10%胎牛血清(FBS)和抗生素(青霉素-100 U/ml和鏈霉素-100 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃培養(yǎng)箱中加入5%的CO2中培養(yǎng)H9C2細(xì)胞,每天定時(shí)換液,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞密度,調(diào)整細(xì)胞密度在1×106個(gè)/ml,將細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上,每個(gè)培養(yǎng)板上有5×105個(gè)細(xì)胞,加入含有10.0% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5.0%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后,培養(yǎng)基更換為2.0%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,AngⅡ(1 μmol/L)在轉(zhuǎn)染5 d后暴露于H9C2細(xì)胞48 h,誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞肥大。

1.3腺相關(guān)病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 用含有Sfrp1基因或不含Sfrp1基因的重組AAV9載體轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞(MOI=6×105vg/細(xì)胞)。在轉(zhuǎn)染5 d后H9C2細(xì)胞暴露于Ang Ⅱ(1μmol/L)48 h以誘導(dǎo)肥大,其中含有Sfrp1基因的H9C2細(xì)胞為過表達(dá)SFRP1(SFRP1)組,不含Sfrp1基因的H9C2細(xì)胞為Ang Ⅱ組,未暴露于Ang Ⅱ而且未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的正常H9C2細(xì)胞為正常(Control)組。如果腺相關(guān)病毒含有熒光蛋白,一般轉(zhuǎn)染48 h后可見明顯熒光表達(dá)。Western轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證可在轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行,PCR驗(yàn)證通常在24 h進(jìn)行。

1.4細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8活力測定 通過CCK-8(中國上海Dojindo實(shí)驗(yàn)室)測量細(xì)胞活力,并嚴(yán)格按照制造商的說明進(jìn)行操作。H9C2細(xì)胞接種在96孔板中,每個(gè)孔板上有1×105個(gè)細(xì)胞。重塑后,將細(xì)胞與10 μl WST-8(一種細(xì)胞增殖檢測試劑)在37 ℃下孵育2 h。使用微孔板讀取器測量細(xì)胞的吸光度。細(xì)胞活力=試驗(yàn)孔中的平均吸光度/對(duì)照孔中的平均吸光度×100%

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染色法檢測細(xì)胞凋亡,嚴(yán)格按照制造商的指示(中國北津4A生物技術(shù)公司)進(jìn)行操作。首先設(shè)置空白管、單染管、實(shí)驗(yàn)管和陰性管,其中空白管細(xì)胞不加任何染料,用于調(diào)節(jié)電壓;單染管分別單獨(dú)添加 PI 和熒光標(biāo)記的Annexin Ⅴ兩個(gè)單染管,用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償;試驗(yàn)管誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加本實(shí)驗(yàn)的所有熒光染料;陰性管是正常培養(yǎng)細(xì)胞加入染料,確認(rèn)細(xì)胞正常狀態(tài),排除假陽性。細(xì)胞處理和染色步驟:取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔板中,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)保證最終收集的細(xì)胞數(shù)大于5×105個(gè);取出6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)基,采用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞5 min,加入不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞,為避免胰蛋白酶對(duì)質(zhì)膜破壞導(dǎo)致Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)表面上出現(xiàn)假陽性染色,胰蛋白酶消化后可使細(xì)胞在最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約 30 min,然后再染色。將收集的H9C2細(xì)胞混勻,4 ℃ 2 990 r/min速度離心5 min,棄上清。用預(yù)冷的1×PBS 洗滌細(xì)胞2次,每次5 min。加入1× 結(jié)合緩沖液,將細(xì)胞調(diào)節(jié)成相同濃度(常規(guī)為1×106/ml),取(1～2)×105個(gè)細(xì)胞懸液于流式管中,加入適量標(biāo)記了熒光染料的Annexin Ⅴ和適量 PI,輕輕混勻,并在室溫避光環(huán)境下孵育15～20 min,最后添加300 μl PBS 重懸細(xì)胞,盡快(2 h內(nèi))用流式細(xì)胞儀(ACEA,美國)分析每個(gè)樣本中的細(xì)胞,每次測量共記錄10 000個(gè)有關(guān)細(xì)胞活動(dòng)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。利用FLOWJO軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6Western印跡分析 去除細(xì)胞培養(yǎng)基并經(jīng)1×PBS洗滌3次,每次5 min,隨后加入適當(dāng)體積1×PBS,細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在離心機(jī)中以9 967 r/min速度離心10 min,去除上層PBS,根據(jù)每107個(gè)細(xì)胞加1 ml裂解緩沖液的比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液,用冰冷裂解緩沖液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的里帕緩沖液)制備細(xì)胞提取物,細(xì)胞溶解液在冰上裂解30 min,隨后在4 ℃(179 400 r/min,15 min)下離心。細(xì)胞溶解液蛋白濃度采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定,每孔加入蛋白50 μg。通過SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(微孔)上。然后在室溫下用脫脂乳封閉膜1 h,然后在4 ℃下與主要抗體(anti-SFRP1、anti-BCL-2、anti-BAX、anti-CYTC、anti-Caspase-3、anti-p62、anti-ATG5、anti-beclin1、anti-ANP、anti-BNP、anti-β-MHC、anti-GAPDH)孵育過夜。次日,PBS進(jìn)行洗膜,3次×10 min,然后將膜與辣根過氧化物酶二級(jí)抗體在室溫?fù)u床下孵育1 h。最后,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行了可視化,并用ImageJ軟件進(jìn)行了定量分析。

1.7BCA測定 ①蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備:蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至終濃度為0.5 mg/ml,可以用0.9% NaCl或PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,稀釋后的0.5 mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以-20 ℃長期保存;②BCA工作液配制:根據(jù)樣品數(shù)量,按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制適量BCA工作液,充分混勻。比如5 ml BCA試劑A加0.1 ml BCA試劑B,混勻,配制成5.1 ml BCA工作液。BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定;③蛋白濃度測定:將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中,加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μl,相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/ml。加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中。樣本可適度稀釋,如果樣品不足20 μl,加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μl。請(qǐng)注意記錄稀釋倍數(shù)。各孔加入200 μl BCA工作液,37 ℃放置20～30 min。BCA法測定蛋白濃度時(shí),顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快。如果濃度較低,適合在較高溫度孵育,或適當(dāng)延長孵育時(shí)間。用酶標(biāo)儀測定A562波長的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS27.0軟件行χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1過表達(dá)SFRP1可明顯增強(qiáng)H9C2心肌細(xì)胞活力 與Control組比較,Ang Ⅱ組H9C2心肌細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)。與Ang Ⅱ組比較,SFRP1組H9C2心肌細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 3組心肌細(xì)胞活力、ANP、BNP、β-MHC、p62、ATG5和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.2過表達(dá)SFRP1可促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞啟動(dòng)自噬程序 與Control組比較,Ang Ⅱ誘導(dǎo)后H9C2細(xì)胞的ANP、BNP和β-MHC蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),給予腺相關(guān)病毒過表達(dá)SFRP1處理后,ANP、BNP和β-MHC蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3過表達(dá)SFRP1可抑制H9C2心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物表達(dá) 與Control組比較,Ang Ⅱ誘導(dǎo)后,H9C2細(xì)胞的p62等蛋白表達(dá)明顯升高,ATG5和Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),給予過表達(dá)SFRP1后p62蛋白表達(dá)顯著降低,ATGF5和Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表1。

2.4過表達(dá)SFRP1可抑制H9C2心肌細(xì)胞凋亡 與Control組比較,Ang Ⅱ誘導(dǎo)后,H9C2細(xì)胞的Bax、Cytc和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),給予腺相關(guān)病毒過表達(dá)SFRP1處理后,Bax、Cytc和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 3組Bax、Cytc、Caspase-3和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

心力衰竭作為全球范圍內(nèi)高死亡率的慢性疾病,其發(fā)病病例機(jī)制復(fù)雜,研究證實(shí)〔4〕,包括心肌肥大在內(nèi)的多種因素均是導(dǎo)致心力衰竭病情進(jìn)展的重要因素。心肌肥大是心肌細(xì)胞對(duì)生理或者病理性刺激的適應(yīng)性調(diào)整,通過降低心室壁的應(yīng)力,最終達(dá)到滿足心臟正常功能需求,但隨著心肌肥大持續(xù)性改變轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇苑蚀?造成心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu),最終導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生。伴隨現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)發(fā)展和醫(yī)療理念的轉(zhuǎn)變,心力衰竭治療已從短暫改善癥狀,轉(zhuǎn)變至預(yù)防、延緩甚至逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)為目標(biāo)〔5〕。目前,諸如醛固酮拮抗劑、β受體阻滯劑、腦啡肽酶抑制劑等多種拮抗心肌重構(gòu)藥物被應(yīng)用于臨床,患者整體死亡率已得到顯著控制,但仍存在藥物相關(guān)副作用較多、患者生活質(zhì)量欠佳等一系列問題,最終誘發(fā)多種并發(fā)癥〔6〕,直接損害患者預(yù)后質(zhì)量。

通過Ang Ⅱ刺激H9C2細(xì)胞建立離體心肌肥大模型,H9C2細(xì)胞因其具由傳代能力強(qiáng)、細(xì)胞活性高及實(shí)驗(yàn)操作性廣等優(yōu)勢〔7〕,常被作為心血管疾病離體模型的理想細(xì)胞載體,用于探索藥物或基因在心肌細(xì)胞中作用的機(jī)制研究。Ang Ⅱ作為機(jī)體腎素-血管緊張素-醛固酮軸中重要的效應(yīng)因子,已被證實(shí)在臨床眾多心血管疾病中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,其在可在不加重外周血管阻力和心臟后負(fù)荷條件下,直接刺激心肌細(xì)胞促進(jìn)其肥大進(jìn)程,因此本研究將Ang Ⅱ作為H9C2細(xì)胞肥大模型的刺激因子,該模型有效性已被文獻(xiàn)充分證實(shí)?；A(chǔ)研究表明〔8,9〕,機(jī)體通過自噬實(shí)現(xiàn)心肌凋亡細(xì)胞的清除,是目前逆轉(zhuǎn)心肌肥大進(jìn)程的重要治療方向。Wnt/β-catenin信號(hào)通路被證實(shí)在心臟發(fā)育和結(jié)構(gòu)重構(gòu)中起主導(dǎo)作用,且與心肌肥大發(fā)生密切相關(guān),目前多種Wnt信號(hào)通路抑制劑被證實(shí)可改善心肌重塑,但由于存在明顯的不良反應(yīng),極大限制其臨床使用,因?yàn)閷で蟾鼮榘踩咝У闹委煱悬c(diǎn)迫在眉睫〔10〕。SFRP1是Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵的抑制劑,因其自身富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域具有與卷曲受體相似結(jié)構(gòu),可實(shí)現(xiàn)競爭性結(jié)合效應(yīng)〔11〕,使Wnt/β-catenin無法進(jìn)入細(xì)胞核激活下游轉(zhuǎn)錄因子。既往研究發(fā)現(xiàn)〔12,13〕,敲除SFRP1基因小鼠表現(xiàn)為更嚴(yán)重的心肌纖維化和更差的心功能,且Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活,此外過表達(dá)SFRP1基因具有抑制心肌細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)研究表明〔14〕,SFRP1能抑制ATG級(jí)聯(lián)蛋白表達(dá),啟動(dòng)心肌細(xì)胞自噬程序。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)SFRP1能夠明顯促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖活性,同時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)和Western印跡提示H9C2細(xì)胞凋亡明顯減少。自噬是真核細(xì)胞獨(dú)有且進(jìn)化高度保守的代謝調(diào)控機(jī)制,能夠降解結(jié)構(gòu)和功能異常蛋白、損傷和老化細(xì)胞器,以維持細(xì)胞正常物質(zhì)循環(huán)、能量代謝及自我更新。近年來研究發(fā)現(xiàn),心血管疾病發(fā)生發(fā)展與自噬密切相關(guān),其中細(xì)胞自噬能力減弱被證實(shí)可促進(jìn)心肌肥大發(fā)展。敲除Atg5等自噬相關(guān)基因后,心肌肥厚進(jìn)程明顯加快,而促進(jìn)自噬有助于延緩心肌肥大。本研究提示SFRP1在心肌細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用,是維持心肌細(xì)胞自噬活性的重要基因。抑制心肌肥大是臨床治療的重要目標(biāo),ANP、BNP和β-MHC是目前公認(rèn)的心肌肥大標(biāo)志物,其中ANP和BNP既往常備作為心衰等心血管疾病診斷與預(yù)后的生化標(biāo)志物,其表達(dá)水平與左心室舒縮功能、瓣膜功能及右心室功能存在明顯相關(guān)性,目前已被證實(shí)其參與心肌肥大和重構(gòu)。心肌細(xì)胞是一種分化成熟的終末功能細(xì)胞,正常情況下高表達(dá)α-肌球蛋白,而心肌肥大時(shí)β-MHC蛋白大量表達(dá)并占據(jù)優(yōu)勢,提示心肌細(xì)胞重構(gòu)處于高度活躍狀態(tài),是評(píng)估心肌細(xì)胞重構(gòu)的重要標(biāo)志物。本文結(jié)果提示SFRP1在心肌肥大進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用,與其促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、抑制凋亡及啟動(dòng)自噬程序清除凋亡細(xì)胞等作用有關(guān)。

綜上,過表達(dá)SFRP1能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和抑制凋亡,同時(shí)啟動(dòng)心肌肥大進(jìn)程中自噬程序,清除凋亡心肌細(xì)胞,是抑制心肌肥大的重要基因和潛在治療靶點(diǎn)。