倪晨 梁素瑩 蔣健 王少開(kāi) 陳志鵬 左云 (蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院,江蘇 蘇州 215600)

胃癌的發(fā)病率和病死率均較高,其男性發(fā)病率位于腫瘤發(fā)病率第2,病死率居于第3,女性發(fā)病率位于腫瘤發(fā)病率第5,病死率居于第2〔1～3〕。胃癌對(duì)人們的生命安全造成了較大的威脅〔3〕。因此,對(duì)胃癌疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究,對(duì)胃癌發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選和鑒定并且其對(duì)早期胃癌診斷及治療的靶標(biāo)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)具有相對(duì)重要的臨床意義和理論價(jià)值〔4〕。脊椎蛋白(SPON)2作為一種細(xì)胞外基質(zhì)分泌蛋白,在患者的先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用,其能夠促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)并且募集炎性細(xì)胞〔5〕。研究發(fā)現(xiàn),肺腺癌、結(jié)直腸癌及肝癌患者的預(yù)后與SPON2表達(dá)存在相關(guān)性〔6〕。但是SPON2在胃癌組織的表達(dá)和功能對(duì)胃癌患者的預(yù)后還未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討SPON2基因表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)、預(yù)后的關(guān)系及其生物學(xué)功能。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年4月到蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院就診的108例胃癌手術(shù)治療患者,平均年齡(63.28±6.48)歲,所有患者及家屬知曉此項(xiàng)研究并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批?；颊哌M(jìn)行胃癌根治性切除術(shù),患者癌旁組織選擇距離癌組織邊緣3 cm 以?xún)?nèi)的區(qū)域,收集患者的1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織,儲(chǔ)存在1.5 ml EP管中,儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中待用。另外,大體組織用多聚甲醛固定,脫水,石蠟包埋后進(jìn)行病理組織切片分析。應(yīng)用SPON2 mRNA的中位值將患者分為高、低表達(dá)組進(jìn)行為期36個(gè)月的隨訪分析患者生存情況。

1.2細(xì)胞及材料 人胃癌細(xì)胞株MGC-803由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。0.25%胰蛋白酶、胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基由蘇州有實(shí)醫(yī)療器械有限公司。熒光定量試劑盒、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,β-actin抗體、SPON2抗體購(gòu)自Abcam,電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、Marker、蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液由碧云天生物公司提供,垂直電泳儀、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀、逆轉(zhuǎn)錄儀由Bio-Rad提供,凋亡檢測(cè)試劑由北京貝博生物公司。

1.3免疫組化 對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片,將組織脫蠟水化,進(jìn)行抗原修復(fù),內(nèi)源性酶去除,對(duì)抗原進(jìn)行封閉,加入SPON2一抗和二抗進(jìn)行孵育,然后發(fā)色,然后進(jìn)行蘇木素負(fù)染,脫水、封片和鏡檢。隨機(jī)選擇5個(gè)視野,染色為棕褐色或棕黃色為SPON2陽(yáng)性表達(dá)。

1.4Western印跡與細(xì)胞總蛋白提取 將組織進(jìn)行勻漿并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解,對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量后,應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離,將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,應(yīng)用SPON2一抗進(jìn)行封膜過(guò)夜,應(yīng)用二抗進(jìn)行洗膜,加入顯影液,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行顯影。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用RNA干擾慢病毒構(gòu)建SPON2低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株(慢病毒序列:5'-CCGACTACAGCATGTGGAGGAAG-3'),慢病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P公司。應(yīng)用Trizol方法對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),對(duì)SPON2表達(dá)進(jìn)行計(jì)算,GAPDH為內(nèi)參。

1.6增殖實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用shRNA構(gòu)建SPON2低表達(dá)胃癌細(xì)胞,分為空白對(duì)照(Mock)組、陰性對(duì)照(sh-NC)組、sh-SPON組。將SPON2低表達(dá)細(xì)胞株和Mock組細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化,將1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中,培養(yǎng)孵育72 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,孵育1 h后,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm下的吸光度。吸光度代表細(xì)胞增殖情況。用胰酶消化SPON2低表達(dá)細(xì)胞和Mock組細(xì)胞,將其接種到6孔板中,500個(gè)細(xì)胞每孔,培養(yǎng)14 d后,用多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色顯微鏡觀察克隆形成。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn) SPON2低表達(dá)細(xì)胞株和Mock組細(xì)胞接種1 d后,應(yīng)用槍頭在培養(yǎng)液中劃一道均勻劃痕,應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)將脫落細(xì)胞進(jìn)行清洗,然后加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基,分別與0 h和培養(yǎng)24 h后進(jìn)行拍照觀察劃痕寬度。

1.8細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞進(jìn)行消化,應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行重懸,每孔加入50 μl基質(zhì)膠鋪于Transwell膜小室中,然后孵育30 min,將200 μl細(xì)胞懸液加入小室上室,下室中加入500 μl的血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)36 h后,應(yīng)用PBS進(jìn)行清洗,應(yīng)用多聚甲醛進(jìn)行固定,風(fēng)干后,用結(jié)晶紫進(jìn)行15 min染色,應(yīng)用PBS進(jìn)行清洗,隨機(jī)選取5個(gè)視野取平均值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及Z檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1組織中SPON2表達(dá) 胃癌組織中SPON2蛋白及mRNA表達(dá)較癌旁正常組織明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。免疫組化結(jié)果顯示,SPON2染色主要分布于細(xì)胞質(zhì),胃癌組織染色陽(yáng)性表達(dá)較高。見(jiàn)圖1。Western印跡結(jié)果顯示,癌癥組織中SPON2蛋白表達(dá)(3.85±0.26)明顯高于癌旁正常組織(1.81±0.15,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 SPON2免疫組化染色(×200)

T:胃癌組織;N:癌旁正常組織圖2 8例癌旁正常組織和胃癌組織中SPON2蛋白表達(dá)

表1 各組織SPON2蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量(n=108)

2.2胃癌患者臨床資料與SPON2表達(dá)關(guān)系 胃癌患者組織壞死、性別和年齡與SPON2 mRNA表達(dá)水平及SPON2蛋白表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05);患者的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤直徑與胃癌組織SPON2蛋白和mRNA表達(dá)有相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胃癌患者臨床資料與SPON2表達(dá)關(guān)系

2.3SPON2表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系 Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果顯示,SPON2高表達(dá)組的生存率〔37.04%(20/54)〕明顯低于低表達(dá)組〔68.52%(37/54)〕(P<0.05);兩組生存曲線(xiàn)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SPON2高表達(dá)組半數(shù)生存期為24個(gè)月,SPON2低表達(dá)組半數(shù)生存期>36個(gè)月。見(jiàn)圖3。

圖3 SPON2高表達(dá)組和SPON2低表達(dá)組生存曲線(xiàn)

2.4細(xì)胞遷移和侵襲 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,敲除SPON2后胃癌細(xì)胞增殖能力減弱,shRNA-SPON2組OD值明顯低于sh-NC組(P<0.05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示,14 d后shRNA-SPON2組細(xì)胞克隆數(shù)明顯低于sh-NC組(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí),shRNA-SPON2組細(xì)胞的劃痕面積占比明顯高于sh-NC組(P<0.05)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明,shRNA-SPON2組細(xì)胞的侵襲數(shù)明顯低于sh-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖4、圖5、表3。Mock組為未經(jīng)處理的MGC-803細(xì)胞。

圖4 各組克隆形成實(shí)驗(yàn)(結(jié)晶紫染色)

圖5 各組遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)(結(jié)晶紫染色,×200)

表3 各組細(xì)胞遷移和侵襲

3 討 論

無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是全世界范圍內(nèi),胃癌的發(fā)病率和病死率都位于前列〔7,8〕。伴隨著胃鏡等內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展及胃癌流行病學(xué)的深入研究和臨床治療技術(shù)的發(fā)展,對(duì)胃癌進(jìn)行早期診斷的概率大大提升,患者的預(yù)后水平也有著較大的提升〔9,10〕。但是胃癌早期階段的基本臨床癥狀與慢性胃炎的癥狀有著一定相似度,而且大多數(shù)患者鑒別能力和健康意識(shí)較差〔11,12〕,現(xiàn)在臨床診斷篩查靶標(biāo)存在一定的局限性,導(dǎo)致大部分胃癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或者伴有淋巴結(jié)浸潤(rùn)的中晚期,對(duì)患者的預(yù)后及臨床治療療效產(chǎn)生了較大限制〔13,14〕。所以不但要推廣和建立早期篩查意識(shí),還需要尋找一種能夠有效早期診斷胃癌的標(biāo)志物,且其應(yīng)具有更好地臨床應(yīng)用價(jià)值和理論意義〔15,16〕。

SPON2屬于一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,其能夠?qū)逃忻庖邞?yīng)答進(jìn)行激活并且對(duì)炎癥細(xì)胞進(jìn)行募集〔17,18〕。研究發(fā)現(xiàn),SPON2在多種腫瘤組織中均存在較高表達(dá),如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌〔19～21〕。本研究結(jié)果提示,胃癌的發(fā)生與SPON2高表達(dá)有一定相關(guān)性。本研究表明,SPON2表達(dá)與患者的預(yù)后存在相關(guān)性,SPON2高表達(dá)提示胃癌患者的預(yù)后不佳。

本研究對(duì)胃癌細(xì)胞的SPON2基因進(jìn)行敲除,胃癌細(xì)胞的增殖被抑制了,這與其他腫瘤細(xì)胞SPON2敲除后結(jié)果相同〔22,23〕。本研究結(jié)果表明,SPON2高表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而,先前有研究發(fā)現(xiàn),SPON2過(guò)表達(dá)組肝癌細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力受到抑制。所以,SPON2對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的作用是復(fù)雜的,需要進(jìn)行深入的研究〔24,25〕。

綜上,SPON2在胃癌患者腫瘤組織中表達(dá)相對(duì)較高,SPON2表達(dá)水平與胃癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤直徑相關(guān),而且SPON2表達(dá)水平對(duì)患者的預(yù)后有著指導(dǎo)作用,腫瘤組織中SPON2水平越高,患者的預(yù)后越差。對(duì)胃癌細(xì)胞SPON2進(jìn)行敲除,能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究也存在一定的缺陷,為回顧性研究,納入患者的數(shù)量較少,還有待大樣本數(shù)據(jù)驗(yàn)證,SPON2在胃癌細(xì)胞中的具體作用機(jī)制還有待研究。