周瑩 古展鑫 盧夢(mèng)月 劉華盛 劉銳

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200;2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種復(fù)雜的慢性進(jìn)展性病理生理過(guò)程,與脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)和免疫功能障礙等危險(xiǎn)因素密切相關(guān)〔1〕。當(dāng)單核細(xì)胞被受損血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的多種因子吸引募集到動(dòng)脈壁上分化成巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞再經(jīng)受體介導(dǎo),吞噬大量氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為泡沫細(xì)胞,泡沫細(xì)胞導(dǎo)致的一系列炎癥反應(yīng)將是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵〔2〕。阿托伐他汀是當(dāng)前臨床上用于治療冠心病的主要藥物之一。研究表明阿托伐他汀不僅通過(guò)調(diào)控免疫細(xì)胞水平抑制炎癥反應(yīng),同時(shí)降低膽固醇調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來(lái)改善患者的臨床癥狀體征,減緩疾病進(jìn)展〔3,4〕。微小RNA(miRNA)是一種小片段非編碼RNA,長(zhǎng)度為18～25 nt,它可通過(guò)堿基對(duì)與相關(guān)靶基因結(jié)合,調(diào)控轉(zhuǎn)錄后在AS進(jìn)程中參與調(diào)控脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)的靶基因及目的蛋白的表達(dá)〔5～7〕。有研究證實(shí)〔8～10〕,阿托伐他汀通過(guò)調(diào)控相關(guān)miRNA影響靶基因與靶蛋白的表達(dá)進(jìn)而對(duì)心血管疾病發(fā)揮治療作用,但其對(duì)泡沫細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響尚未可知。本研究旨在比較阿托伐他汀干預(yù)THP-1源性泡沫細(xì)胞模型前后miRNA表達(dá)譜并篩選出差異miRNA,繪制miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析相關(guān)信號(hào)通路,以期為后續(xù)臨床應(yīng)用和研發(fā)防治AS新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 SPF級(jí)健康SD大鼠20只,雌性,體質(zhì)量(180±20)g,統(tǒng)一購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔SCXK(湘)2018-0002〕。自然晝夜光照,進(jìn)食飲水自由,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房〔SYXK(桂)2019-0001〕;人急性白血病單核細(xì)胞系THP-1,源于ATCC,購(gòu)于卓一生化技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 阿托伐他汀鈣片20 mg/粒(生產(chǎn)批號(hào):H20051408)購(gòu)自輝瑞制藥有限公司。以超純水為溶劑,研磨粉碎后置于超聲振蕩器震蕩混勻,配制成每毫升含阿托伐他汀鈣片0.2 mg備用。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào):C11875-500BT)與澳洲進(jìn)口胎牛血清(FBS,貨號(hào):10099141C)皆購(gòu)于Gibco公司;ox-LDL(貨號(hào):H7950)、佛波酯(PMA,貨號(hào):SP9830-1 mg)、飽和油紅O染色液(G1260-500 ml)、甘油明膠封片劑(S2150-10 ml)、4%組織細(xì)胞固定液(P1110-500 ml)和磷酸鹽緩沖液(PBS,貨號(hào):P1020-500 ml)皆購(gòu)于北京Solarbio公司;異丙醇(CAS:67-63-0)購(gòu)于廣東西隴化工;總RNA 提取試劑盒(LS1040)購(gòu)于上海Progmega公司;RNA 分析試劑盒(DNF-471)購(gòu)于美國(guó)AATI公司。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器 HR1200-ⅡB2生物安全柜(青島海爾),MCO-18AIC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司),ST16R22高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司),DMI3000B倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司),BCD-268WBCS普通儲(chǔ)存海爾冰箱(青島),IQ7000 Milli-Q1純水儀系統(tǒng)(德國(guó)Merck公司),ND-2000 NanoDrop(Thermo Scientific),安捷倫2100生物分析儀(美國(guó)Agilent公司),FA-12 Fragment Analyzer分析儀(美國(guó)AATI公司),BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)(深圳華大基因)。

1.5含藥血清的制備 將20只SD大鼠隨機(jī)分為阿托伐他汀(西藥組)與空白對(duì)照組,連續(xù)7 d定時(shí)灌胃1次。灌胃1 w后對(duì)大鼠進(jìn)行禁食處理,次日早晨再對(duì)大鼠灌胃1次。末次灌胃1 h后,以3.5 ml/kg劑量的10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射,于無(wú)菌環(huán)境采集大鼠腹主動(dòng)脈血。將各組全血標(biāo)本于4 ℃環(huán)境下靜置3 h后,以4 ℃ 3 000 r/min條件在離心機(jī)中離心15 min,血清分離后對(duì)同組血清進(jìn)行混勻操作,再進(jìn)行56 ℃滅活30 min處理。最后使用0.22 μm濾菌器對(duì)血清過(guò)濾除菌后EP管分裝,-80 ℃超低溫冰箱冷凍備用。

1.6誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞 取生長(zhǎng)狀態(tài)較佳的THP-1細(xì)胞以含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基與終濃度為320 mmol/L的PMA混勻共同培養(yǎng),在設(shè)定為37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出細(xì)胞,在顯微鏡下觀察細(xì)胞分化狀態(tài)。

1.7建立泡沫細(xì)胞模型并鑒定 待THP-1細(xì)胞被成功刺激,分化成巨噬細(xì)胞之后,替換終濃度為80 mg/L的ox-LDL完全培養(yǎng)基,于37 ℃,5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行油紅O染色鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后將其取出培養(yǎng)箱,棄舊培養(yǎng)基,使用PBS沖洗兩次細(xì)胞,加4%多聚甲醛進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為20 min的固定后棄液,用60%異丙醇沖泡1 min,再按3∶2油紅O染色液與PBS比例配液并著色20 min,加入異丙醇分化10～15 s,PBS洗滌兩遍。取出細(xì)胞爬玻片,用濾紙吸干多余液體后滴加甘油明膠,蓋上載玻片輕按排氣泡后置于顯微鏡下觀察鑒定是否成功建立泡沫細(xì)胞模型。

1.8含藥血清干預(yù) 取狀態(tài)優(yōu)良的THP-1細(xì)胞重懸濃度至1×106個(gè)/ml,于6孔板內(nèi)每孔加入2 ml種板,經(jīng)PMA誘導(dǎo)24 h后貼壁,再經(jīng)80 mg/L的ox-LDL刺激48 h轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞,將細(xì)胞分為模型組與西藥組,分別加入終濃度為10%的大鼠空白血清及西藥組血清予以37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)干預(yù)48 h。

1.9總RNA 提取 干預(yù)時(shí)間結(jié)束后,棄原培養(yǎng)基,用PBS對(duì)細(xì)胞緩慢沖洗兩次,直接在6孔板中加RNA裂解液裂解2～3 min后轉(zhuǎn)移至無(wú)核酶EP管稀釋混勻,室溫以12 000 r/min離心5 min。離心后,細(xì)胞沉淀物沉于底部,轉(zhuǎn)移上清至新無(wú)核酶EP管加0.5倍體積無(wú)水乙醇混合均勻,將混合液吸取至新過(guò)濾柱,12 000 r/min離心1 min,棄去濾液后,向過(guò)濾柱加600 μl RNA洗液以12 000 r/min離心45 s,再棄去濾液,室溫條件下加50 μl DNA酶Ⅰ孵育液靜置孵育15 min。孵育結(jié)束后,加600 μl RNA洗液,12 000 r/min離心2 min,重復(fù)洗2次。將過(guò)濾柱置于洗脫管加60 μl無(wú)核酶水室溫靜置2 min,12 000 r/min離心1 min,最后提取分離出的液體即各組細(xì)胞總RNA,將RNA保存在-80 ℃冰箱備用。

1.10miRNA高通量測(cè)序 先將總RNA樣品用Agilent Bioanalzyer 2100生物分析儀進(jìn)行濃度和完整度的檢測(cè),并用NanoDrop檢測(cè)是否存在鹽離子污染。對(duì)品控合格的總RNA分離出小RNA并富集后連接單鏈DNA雜交擴(kuò)增,使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)去除副產(chǎn)物并回收PCR后的目的條帶構(gòu)建文庫(kù)。使用Agilent Bioanalzyer 2100生物分析儀對(duì)構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行定量,將雙鏈PCR產(chǎn)物變性為單鏈后加環(huán)化引物,經(jīng)phi29酶作用形成DNA納米球,采用聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)使DNA分子錨和熒光探針與DNA納米球聚合并通過(guò)BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)完成miRNA測(cè)序。

1.11數(shù)據(jù)分析處理與差異基因篩選 對(duì)測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和標(biāo)準(zhǔn)化處理,用AASRA比對(duì)軟件將處理后數(shù)據(jù)與參考基因組和其他小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比,且對(duì)小RNA的表達(dá)水平用每百萬(wàn)條reds的轉(zhuǎn)錄本(TPM)算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)均一化處理后,默認(rèn)差異表達(dá)基因篩選條件為差異倍數(shù)絕對(duì)值|log2(fold change)|≥2、Q值<0.01進(jìn)行篩選,對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行層次聚類分析。

1.12數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析 通過(guò)6個(gè)不同靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(miRDB、Targetscan、miRWalk、miRPathDB、miRTarBase、microT-CDS)對(duì)篩選出的差異miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),最終選取靶基因在數(shù)據(jù)庫(kù)里的交集≥3并且被miRNA調(diào)控≥2的靶基因作為預(yù)測(cè)結(jié)果,根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行基因本體論(GO)、京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析,進(jìn)一步了解差異基因所影響的信號(hào)通路和生物學(xué)功能。

2 結(jié) 果

2.1THP-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞 經(jīng)過(guò)濃度為320 mmol/L的PMA刺激誘導(dǎo)分化24 h后,THP-1細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察,可見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)由漂浮狀態(tài)變成貼壁狀態(tài)生長(zhǎng),其形態(tài)表現(xiàn)為圓形或梭形或帶有較長(zhǎng)偽足的不規(guī)則形,說(shuō)明THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo),分化為巨噬細(xì)胞成功。見(jiàn)圖1。

圖1 PMA誘導(dǎo)分化后的巨噬細(xì)胞形態(tài)(×10)

2.2泡沫細(xì)胞模型建立 油紅O染色結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞因大量吞噬了ox-LDL而引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積,細(xì)胞內(nèi)脂滴被染為紅色,而巨噬細(xì)胞在無(wú)ox-LDL情況下紅色脂滴少見(jiàn)或未見(jiàn),證明泡沫細(xì)胞模型成功建立。見(jiàn)圖2。

圖2 巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積情況(油紅O染色,×10)

2.3差異miRNA篩選與聚類分析 篩選出的差異miRNA有56條,其中有37個(gè)上調(diào),19個(gè)下調(diào)。為排除假陽(yáng)性,進(jìn)一步提高篩選條件為|log2(fold change)|≥2、P值<0.01、且在模型組或西藥組的其中一組或兩組同時(shí)miRNA表達(dá)量>1,篩選出8個(gè)差異miRNA。差異倍數(shù)顯著且表達(dá)量豐富的上、下調(diào)miRNA分別為hsa-miR-3184-3p與hsa-miR-423-5p。見(jiàn)表1,圖3。

表1 模型組與西藥組miRNA差異表達(dá)

圖3 差異基因聚類熱圖

2.4差異 miRNA 靶基因 的GO 與 KEGG 分析 對(duì)上述8個(gè)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)并排除重復(fù)后得到1 713個(gè)靶基因,使用Cytoscape 3.8.0設(shè)定條件為Degree≥5以構(gòu)建miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其中調(diào)控靶基因最多的miRNA為hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-5581-3p,被顯著調(diào)控關(guān)聯(lián)的基因?yàn)镻OU域類2轉(zhuǎn)錄因子(POU2F)1,N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基(GRIN2B)、RNF217。見(jiàn)圖4。

圖4 miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將預(yù)測(cè)所得的靶基因通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析,分析結(jié)果顯示,這些靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄DNA模板、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白分解過(guò)程、細(xì)胞因子產(chǎn)生過(guò)程等18種生物學(xué)過(guò)程(BP),有染色質(zhì)結(jié)合劑、鋅離子結(jié)合劑、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性DNA結(jié)合等15種分子功能(MF),細(xì)胞組分(CC)分析顯示,共含早期內(nèi)膜體、核質(zhì)、細(xì)胞核等7種組分類型,見(jiàn)圖5。通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn),有20條信號(hào)通路參與,其中MAPK信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路差異較顯著(P<0.01),其交集基因數(shù)量分別為35、25、22個(gè)。

圖5 GO富集分析

3 討 論

近年來(lái)測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅猛,因高通量測(cè)序技術(shù)能準(zhǔn)確檢測(cè)出低表達(dá)的基因,具有成本低重復(fù)率高的優(yōu)點(diǎn),對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究起到極大助力作用〔11〕。本實(shí)驗(yàn)中37個(gè)上調(diào)的miRNA中hsa-miR-3184-3p上調(diào)最為突出。關(guān)于miR-3184的研究大多與癌癥相關(guān)〔12～16〕,且其反向互補(bǔ)序列miR-3184-5p研究較多。有研究表明,乳腺癌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的相互作用會(huì)增加促炎細(xì)胞因子分泌,而miR-3184-5p下調(diào)與miR-181c過(guò)表達(dá)可以通過(guò)靶向叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子(FOX)P4和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)來(lái)抑制脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移〔13〕。作為miR-3184的直接靶點(diǎn),磷脂酶Cβ(PLCB)1過(guò)表達(dá)會(huì)對(duì)肝細(xì)胞癌起促進(jìn)作用,而PLCB1在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大,并可能通過(guò)干擾促炎細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥〔14,15〕。目前未有miR-3184-3p與心血管疾病相關(guān)的研究,相關(guān)炎癥機(jī)制如何參與AS進(jìn)程有待進(jìn)一步探討。本研究中19個(gè)下調(diào)的差異miRNA里hsa-miR-423-5p下調(diào)最為明顯。研究證明miR-423-5p是早期心肌壞死〔17〕和冠狀動(dòng)脈患者風(fēng)險(xiǎn)分層〔18〕的生物標(biāo)志物,循環(huán)miR-423-5p可以反映患者心臟缺血狀態(tài)〔19〕。在AS的進(jìn)程中,過(guò)表達(dá)miR-423-5p會(huì)引起心肌損傷,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,但miR-423-5p可以通過(guò)抑制靶向心肌細(xì)胞中的成髓細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄因子第2亞型(MYBL2)來(lái)激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號(hào)通路,減少缺氧再?gòu)?fù)氧環(huán)境下誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔20〕。AS發(fā)病機(jī)制中,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致AS的經(jīng)典機(jī)制之一。研究認(rèn)為,miR-423會(huì)在缺氧和腫瘤壞死因子(TNF)-α炎癥因子處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)〔21〕。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-423-5p被過(guò)表達(dá)的分化拮抗非蛋白編碼RNA靶向下調(diào),由此減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,減少炎癥因子分泌〔22〕,而miR-423-5p靶向下調(diào)ALDH2也可以通過(guò)減輕脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡來(lái)改善AS〔23〕。以上研究皆表明miR-423-5p對(duì)心血管疾病具有一定調(diào)節(jié)作用。

KEGG通路分析顯示,所預(yù)測(cè)靶基因富集于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等通路。由于目前對(duì)miRNA的研究尚未全面發(fā)展,大部分研究多偏向于癌癥領(lǐng)域,所以miRNA的靶基因和功能富集也會(huì)產(chǎn)生偏向,導(dǎo)致癌癥相關(guān)途徑會(huì)在KEGG通路富集結(jié)果中占有一席之地〔24〕,故應(yīng)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行挑選。有研究表明,巨噬細(xì)胞會(huì)被ox-LDL刺激產(chǎn)生活性氧從而激活MAPK信號(hào)通路,加重脂質(zhì)沉積引起巨噬細(xì)胞泡沫化,王不留行黃酮苷可以通過(guò)減少脂質(zhì)沉積改善AS〔25〕。另一研究認(rèn)為,細(xì)胞增殖和凋亡可以被MAPK信號(hào)通路所調(diào)節(jié),通過(guò)降低p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)1/2的磷酸化水平來(lái)阻斷MAPK信號(hào)通路,減少人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞被棕櫚酸所刺激引起的脂毒性損傷〔26〕。Hippo信號(hào)通路可以控制細(xì)胞增殖和凋亡,其下游因子Yes相關(guān)蛋白(YAP)過(guò)表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-1β募集巨噬細(xì)胞進(jìn)而加速AS發(fā)展,抑制YAP表達(dá)可以改善由ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥進(jìn)展〔27,28〕。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)家族成員中,激活STAT1會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng),激活STAT3會(huì)抑制免疫反應(yīng),缺乏Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子β-catenin會(huì)使STAT1激活并促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)加劇AS,而Wnt信號(hào)通路激活劑Wnt3a可以激活STAT3并聯(lián)合IL-4共同作用消退炎癥反應(yīng)以改善AS〔29,30〕。

綜上所述,高通量測(cè)序篩選阿托伐他汀含藥血清干預(yù)THP-1源性泡沫細(xì)胞模型的差異表達(dá)miRNA 為hsa-miR-3184-3p與hsa-miR-423-5p,富集顯著的關(guān)鍵通路為MAPK信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路與Wnt信號(hào)通路。由于miRNA可以調(diào)控的靶基因較多,加上AS機(jī)制的復(fù)雜,具體作用于AS的靶基因?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)尚未完全,因此仍需對(duì)阿托伐他汀干預(yù)泡沫細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行深入研究。