王玉文 周雅琪 宋宗義 趙云龍

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中占比高達(dá)80%以上,有生長(zhǎng)慢、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散晚的特點(diǎn)[1]。近年來(lái),NSCLC五年生存率仍無(wú)重大突破,從分子生物學(xué)方向?qū)ふ腋咛禺愋?、高敏感度的?biāo)志物用于NSCLC早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè),已成為醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)[2]。前期經(jīng)第二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)三結(jié)構(gòu)域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)和真核翻譯起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2,EIF5A2)等在癌組織中表達(dá)升高,對(duì)NSCLC轉(zhuǎn)移分化有促進(jìn)作用。Shen等[3]報(bào)道TRIM59是一種癌基因,在膽管癌發(fā)生和增殖等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。EIF5A2為癌細(xì)胞增殖過(guò)程中的上游調(diào)控因子之一,可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。但關(guān)于TRIM59、EIF5A2在NSCLC中表達(dá)水平是否能作為患者腫瘤轉(zhuǎn)移分化的預(yù)估標(biāo)志物,相關(guān)報(bào)道鮮見(jiàn),故開(kāi)展本次實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 病例材料

選取2018年1月至2019年1月經(jīng)我院病理確診的NSCLC組織與正常肺組織標(biāo)本各80例,同時(shí)收集相應(yīng)患者完整的臨床資料。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測(cè)NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達(dá) 將組織樣本液氮研磨,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用qRT-PCR試劑盒(日本TAakara公司)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。20 μL反應(yīng)體系:cDNA 2 μL,上下游引物各2 μL,無(wú)酶水3.6 μL,ROX 0.4 μL,SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL。反應(yīng)步驟:預(yù)變性95 ℃ 6 min,變性95 ℃ 30 s,退火65 ℃ 35 s,延伸72 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置重復(fù)3次,以GAPDH為內(nèi)參基因,計(jì)算TRIM59、EIF5A2 mRNA相對(duì)表達(dá)量,用2-△△Ct公式計(jì)算。TRIM59引物:上游5′-TTGATCTCGTGGTTTGGGGG-3′,下游5′-ACTGTGTTGGTGTTTGTGGC-3′;EIF5A2引物:上游5′-TGGGCCCGTTATTTCTGCAT-3′,下游5′-CAGGTTCTGTTACCCCGCAT-3′;GAPDH引物:上游5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′,下游5′-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3′。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 蛋白表達(dá) 將組織用10%甲醛固定,石蠟包埋,制作4 μm厚的切片,脫蠟至水,浸于乙二胺四乙酸溶液中,微波抗原修復(fù)10 min,冷卻至室溫,水洗,PBS浸洗,滴加山羊血清封閉液,室溫封閉18 min,甩去多余液體,加入鼠抗人TRIM59、EIF5A2一抗(ABcam),4 ℃過(guò)夜,PBS清晰,滴加SP 900通用型生物素標(biāo)記二抗(Thermo Fisher Scientific),37 ℃下孵育1 h。二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。對(duì)照設(shè)置為正常小鼠血清取代一抗進(jìn)行替代對(duì)照,用PBS作空白對(duì)照。染色陽(yáng)性結(jié)果判斷:TRIM59、EIF5A2在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)彌漫性分布的棕色、棕黃色顆粒即陽(yáng)性細(xì)胞,按半定量積分法根據(jù)染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分:染色強(qiáng)度分為未著色、淺著色、重度著色、深度著色,依次評(píng)分為0、1、2、3分;陽(yáng)性細(xì)胞百分率:高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算腫瘤細(xì)胞平均陽(yáng)性百分率,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為≤5%、>5%～25%、>25%～49%、≥50%,依次評(píng)分為0、1、2、3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加,0～1分、2分、3～4分、5～6分依次為(-)、(+)、(++)、(+++),(-)表示陰性,(+)～(+++)表示陽(yáng)性。將兩項(xiàng)計(jì)分相乘,≤3分為低表達(dá),>3分為高表達(dá)。

1.3 隨訪及研究方法

經(jīng)門診復(fù)查和電話隨訪,獲得患者預(yù)后情況,隨訪時(shí)間為3年,期間無(wú)脫落病例。根據(jù)患者是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移分化分為轉(zhuǎn)移分化組、未轉(zhuǎn)移分化組,收集患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤位置、臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況,比較組間差異,并選取有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的參數(shù)進(jìn)行多因素logistic回歸分析;繪制受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic,ROC)及曲線下面積(Area Under Curve,AUC),分析TRIM59、EIF5A2 蛋白表達(dá)水平對(duì)肺癌患者轉(zhuǎn)移分化的預(yù)估價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達(dá)水平

NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達(dá)水平高于正常組織,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達(dá)水平

2.2 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 蛋白表達(dá)水平

NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2蛋白高表達(dá)率高于正常組織,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 NSCLC組織與正常組織中TRIM59、EIF5A2 蛋白表達(dá)水平(例,%)

2.3 轉(zhuǎn)移分化組與未轉(zhuǎn)移分化組患者臨床資料比較

80例肺癌患者經(jīng)隨訪發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)移分化15例。

轉(zhuǎn)移分化組與未轉(zhuǎn)移分化組患者之間的TRIM59、EIF5A2蛋白表達(dá)情況、腫瘤分化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),性別、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤直徑等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 轉(zhuǎn)移分化組與未轉(zhuǎn)移分化組患者臨床資料比較/例

2.4 多因素Logistic回歸分析

以TRIM59、EIF5A2蛋白表達(dá)情況和腫瘤分化程度為自變量,以患者是否發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移分化為因變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0),進(jìn)行多因素logistic回歸分析,結(jié)果提示TRIM59、EIF5A2蛋白高表達(dá)和腫瘤低分化為NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移分化的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 NSCLC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移分化的影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 TRIM59、EIF5A2 蛋白表達(dá)水平對(duì)肺癌患者轉(zhuǎn)移分化的預(yù)估價(jià)值

NSCLC組織中TRIM59聯(lián)合EIF5A2 蛋白表達(dá)水平預(yù)估腫瘤轉(zhuǎn)移分化的AUC及特異度均明顯高于單獨(dú)檢測(cè),而敏感度與TRIM59單獨(dú)檢測(cè)無(wú)差異。詳見(jiàn)表5、圖1。

圖1 TRIM59、EIF5A2 蛋白表達(dá)水平對(duì)肺癌組患者轉(zhuǎn)移分化的預(yù)估價(jià)值

表5 TRIM59、EIF5A2 蛋白表達(dá)水平與肺癌組患者腫瘤轉(zhuǎn)移分化的預(yù)估價(jià)值

3 討論

NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確,主要采取手術(shù)、化療以及放療等控制腫瘤遷移分化,但上述傳統(tǒng)療法效果欠佳,患者往往因轉(zhuǎn)移分化等原因死亡[5]。因此,分析腫瘤轉(zhuǎn)移分化的分子機(jī)制,探索其潛在治療靶點(diǎn)十分關(guān)鍵,對(duì)改善NSCLC療效有重要意義。

TRIM家族蛋白為E3泛素連接酶重要成員,已被證明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中參與了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控腫瘤相關(guān)分子表達(dá)等作用,這為研究TRIM家族蛋白在NSCLC中的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)[6]。TRIM59蛋白是TRIM59基因編碼的蛋白質(zhì),有RING結(jié)構(gòu)域、E3泛素連接酶活性,在多個(gè)病理生理過(guò)程中扮演了角色[7]。Tong等[8]報(bào)道TRIM59基因擴(kuò)增在卵巢癌組織中普遍存在,且其擴(kuò)增與較差的總體生存率顯著相關(guān)。Liu等[9]表明TRIM59對(duì)食管癌進(jìn)展有促進(jìn)作用。EIF5A2是參與多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯和核質(zhì)互換等過(guò)程的蛋白,在膽囊癌[10]、前列腺癌[11]等多種人類腫瘤中表達(dá)異常升高。在本研究中,經(jīng)qRT-PCR檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NISCLC組織中TRIM59、EIF5A2 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組織;免疫組織化學(xué)染色觀察樣本切片TRIM59蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),EIF5A2蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核,二者蛋白均呈高表達(dá)狀態(tài),提示TRIM59、EIF5A2在NSCLC組織中表現(xiàn)為異常高表達(dá)。Yang等[12]報(bào)道EIF5A2過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致癌癥進(jìn)展,并證明EIF5A2可能是FIGOⅠ～Ⅱ期宮頸癌的一種新的潛在預(yù)后標(biāo)志物。Liu等[13]表明TRIM59過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān),Guo等[14]報(bào)道通過(guò)薈萃分析評(píng)估TRIM59與肺癌預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)TRIM59有預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

了解TRIM59、EIF5A2在NSCLC組織中表達(dá)譜后,本研究進(jìn)一步探索其對(duì)預(yù)后評(píng)估的作用。由于腫瘤轉(zhuǎn)移分化是患者治療失敗、死亡的主要原因,因此將NSCLC組織對(duì)應(yīng)患者按是否發(fā)生轉(zhuǎn)移分化進(jìn)行分組,并比較2組患者臨床資料,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)移分化組患者中TRIM59、EIF5A2蛋白高表達(dá)者和腫瘤低分化者占比高于未轉(zhuǎn)移分化組。將TRIM59、EIF5A2蛋白表達(dá)以及腫瘤分化作為自變量,代入logistic回歸模型分析發(fā)現(xiàn)TRIM59、EIF5A2蛋白高表達(dá)及腫瘤低分化是NSCLC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移分化的危險(xiǎn)因素,初步確立了TRIM59、EIF5A2蛋白表達(dá)水平在NSCLC轉(zhuǎn)移分化發(fā)生過(guò)程中的作用。關(guān)于腫瘤低分化是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素這一點(diǎn)已有相關(guān)研究證明[15]。Lou等[16]認(rèn)為TRIM59作為預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的新型分子生物標(biāo)志物,He等[17]報(bào)道EIF5A2 的過(guò)表達(dá)是Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者生存的不良預(yù)后標(biāo)志物,上述研究表明NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2表達(dá)水平可能作為用于評(píng)估患者預(yù)后的標(biāo)志物,本研究結(jié)果與上述研究存在一致性。因本研究進(jìn)行單因素與多因素Logistic回歸分析時(shí)納入因素相對(duì)較少,樣本量較小,分析結(jié)果可能存在誤差,因而該結(jié)論有必要進(jìn)行進(jìn)一步證實(shí)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2蛋白表達(dá)情況對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移分化有一定預(yù)估價(jià)值,二者聯(lián)合用于評(píng)估轉(zhuǎn)移分化的AUC以及敏感度、特異度高于單獨(dú)檢測(cè),這一點(diǎn)可為臨床評(píng)估NSCLC患者預(yù)后提供指導(dǎo)。

綜上所述,NSCLC組織中TRIM59、EIF5A2表達(dá)水平異常升高,是NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移分化的危險(xiǎn)因素,可作為患者預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)志物。但二者具體價(jià)值仍需將來(lái)納入更多可能的影響因素和擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。