劉增振 牛秋霞 孟慶澤 陳曉增 石 峰 董新強(qiáng)

膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿生殖系統(tǒng)常見腫瘤,發(fā)病率居全球第11位[1]。由于吸煙和職業(yè)接觸各種化學(xué)致癌物等因素,BC發(fā)病率逐年上升,目前手術(shù)、免疫治療、放療和輔助化療為BC治療的主要方法,但其預(yù)后總體不佳,BC患者5年相對(duì)生存率約為70%[2-3],因此,深入探索BC發(fā)病分子機(jī)制,積極尋找安全、有效的替代療法,對(duì)于遏制BC惡性進(jìn)展、提高患者治愈率和生存率具有重要意義。

據(jù)報(bào)道,氧化還原失衡與BC發(fā)生和發(fā)展有關(guān),細(xì)胞抗氧化酶的破壞或抑制會(huì)增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,從而引發(fā)惡性細(xì)胞的凋亡[4]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1/核因子E2相關(guān)因子2(Kelch like epichlorohydrin associated protein-1/nuclear factor E2 associated factor 2,Keap1/Nrf2)通路在細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用,其中Nrf2是細(xì)胞抗氧化劑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可防止ROS積累,在多種類型的腫瘤中被激活[5],提示該通路可能參與調(diào)節(jié)BC細(xì)胞的惡性增殖及抗凋亡特性。據(jù)報(bào)道,紫草素可抑制BC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,并促進(jìn)凋亡[6],但紫草素對(duì)BC細(xì)胞的增殖及凋亡干預(yù)作用是否與調(diào)控Keap1/Nrf2通路有關(guān),目前報(bào)道較少,故本研究擬通過體外培養(yǎng)BC細(xì)胞株T24并加以紫草素培養(yǎng)作用,探討紫草素對(duì)T24細(xì)胞增殖及凋亡的影響及可能作用機(jī)制,以期為BC治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 T24人BC(CL-0227)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 紫草素(純度98%)(517-89-5)購自南京道斯夫生物科技有限公司;AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(KGA106)購自南京凱基生物科技公司;ROS熒光探針DCFH-DA(KM0062)購自北京百奧萊博科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒(S0131S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)檢測(cè)試劑盒(BC1170)購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗Nrf2多克隆抗體(ab92946),兔抗Keap1(ab227828)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)(ab52947)及醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)(ab80588)單克隆抗體均購自美國Abcam公司;ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司;550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司;Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng) 含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液復(fù)蘇T24細(xì)胞,于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代2～3次。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)不同濃度紫草素對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制作用 收集細(xì)胞沉淀,利用含0(對(duì)照組)、10、20、40及80 μmoL/L紫草素(實(shí)驗(yàn)組)培養(yǎng)液重懸,于96孔板每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞并培養(yǎng)。48 h后各孔均加入10 μL CCK8溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2 h,利用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定各孔吸光度(OD)值,細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。重復(fù)3次。

1.2.3 克隆形成測(cè)定細(xì)胞集落形成能力 利用含0、10、20、40、80 μmoL/L紫草素的完全培養(yǎng)液重懸對(duì)數(shù)期T24細(xì)胞并接種至6孔板中(每孔1×103個(gè)細(xì)胞),每3天更換一次培養(yǎng)液,培養(yǎng)2周,4%多聚甲醛溶液固定30 min,0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min,鏡下對(duì)超過50個(gè)細(xì)胞的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 利用含0、10、20、40、80 μmoL/L紫草素的完全培養(yǎng)液重懸對(duì)數(shù)期T24細(xì)胞并接種至6孔板中(每孔1×106個(gè)細(xì)胞),連續(xù)培養(yǎng)48 h。胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,結(jié)合緩沖液重懸,后與5 μL Annexin V-FITC在4 ℃下孵育15 min,5 μL PI避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,重復(fù)3次。

1.2.5 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平 收集T24細(xì)胞,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。10 μM DCFH-DA重懸并于37 ℃下避光染色30 min,后利用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次,熒光顯微鏡下觀察利用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長為488 nm和發(fā)射波長為525 nm下檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度以評(píng)估ROS生成水平,ROS生成水平計(jì)算為實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度,此處對(duì)照組為0 μmoL/L紫草素作用下的細(xì)胞。

1.2.6 比色分析法檢測(cè)細(xì)胞MDA及GSH含量 利用含0、10、20、40、80 μmoL/L紫草素的完全培養(yǎng)液調(diào)整對(duì)數(shù)期T24細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,接種5 mL至75 cm2培養(yǎng)中,連續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞,12000 r/min離心10 min后取上清,BCA法檢測(cè)蛋白濃度,后加入MDA檢測(cè)工作液,于沸水中保持15 min并冷卻至室溫,最后測(cè)量532 nm處的吸光度并標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白質(zhì)濃度來評(píng)估MDA水平;收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,將細(xì)胞樣品用液氮和37 ℃水浴快速冷凍和解凍2次,12000 r/min離心10 min后取上清,用供試液處理,最后測(cè)量412 nm處的吸光度,根據(jù)吸光度和濃度做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,并評(píng)估GSH水平。

1.2.7 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平 Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,制備RT-qPCR反應(yīng)體系,上機(jī)進(jìn)行RT-qPCR定量檢測(cè)。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s 、60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì),序列如下:Keap1:F:5'-GGAGGCGGAGCCCGA-3',R:5'-GATGCCCTCAATGGA CAACCA-3';Nrf2:F:5'-ACACGGTCCACAGCTCATC-3',R:5'-TGTCAATCAAAT CCATGTCCTG-3';β-actin:F:5'-CCCACACTGTGCCCATCTAC-3',R:5'-GGAACC GCTCATTGCCAATG-3'。

1.2.8 WB檢測(cè)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)情況 收集各組細(xì)胞沉淀,RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳凝膠分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,后與一抗(均1∶1000稀釋)4 ℃孵育過夜,洗膜,辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶10000稀釋)室溫孵育1 h,洗膜,ECL發(fā)光液可視化條帶,化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)曝光,Image J分析條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)T24細(xì)胞增殖、集落形成及凋亡的影響

T24細(xì)胞存活率、集落形成數(shù)隨紫草素作用濃度增加而降低,細(xì)胞凋亡率隨紫草素作用濃度增加而升高(P<0.05)。見圖1、2,表1。

表1 不同濃度紫草素培養(yǎng)下T24細(xì)胞存活率、凋亡率及集落形成數(shù)比較

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)紫草素各濃度下T24細(xì)胞凋亡情況

2.2 紫草素對(duì)T24細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平及MDA、GSH含量的影響

T24細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平、MDA含量隨紫草素作用濃度增加而升高,GSH含量隨紫草素作用濃度增加而降低(P<0.05)。見圖3,表2。

表2 不同濃度紫草素培養(yǎng)下T24細(xì)胞ROS生成水平及MDA、GSH含量比較

圖3 不同濃度紫草素作用下的T24細(xì)胞DCF熒光觀察(×200)

2.3 紫草素對(duì)T24細(xì)胞Keap1、Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

T24細(xì)胞中Keap1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平隨紫草素作用濃度增加而升高,Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平隨紫草素作用濃度增加而降低(P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度紫草素作用下T24細(xì)胞Keap1、Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4 紫草素對(duì)T24細(xì)胞Keap1/Nrf2相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

T24細(xì)胞中Keap1蛋白相對(duì)表達(dá)量隨紫草素作用濃度增加而升高,Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量均隨紫草素作用濃度增加而降低(P<0.05)。見圖4,表4。

表4 不同濃度紫草素作用下T24細(xì)胞Keap1、Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注:A:0 μmoL·L-1紫草素;B:10 μmoL·L-1紫草素;C:20 μmoL·L-1紫草素;D:40 μmoL·L-1紫草素;E:80 μmoL·L-1紫草素。

3 討論

紫草素是從紫草干燥根中提取分離而來的一種天然萘醌化合物[7],越來越多的證據(jù)表明,紫草素可抑制多類型腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[8-10]。凋亡是最常見的程序性細(xì)胞死亡形式,但癌細(xì)胞常見細(xì)胞凋亡抗性,因此抑制癌細(xì)胞惡性增殖并促進(jìn)其凋亡常為癌癥治療的重要靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道,紫草素可通過多種生物學(xué)途徑和靶點(diǎn)抑制BC細(xì)胞遷移及侵襲等惡性進(jìn)展,并可發(fā)揮順鉑耐藥抗性[11-12],本研究經(jīng)不同濃度紫草素作用BC細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),其可呈濃度依賴性降低T24細(xì)胞存活率及集落形成數(shù),并提高細(xì)胞凋亡率,提示紫草素可有效抑制BC細(xì)胞惡性增殖并促進(jìn)凋亡,為BC治療的潛力藥物之一。

與正常細(xì)胞相比,由于遺傳不穩(wěn)定性、慢性炎癥增加和代謝異常,許多類型的癌細(xì)胞傾向于提高氧化物質(zhì)水平,氧化性物質(zhì)反過來誘導(dǎo)基因突變和炎癥,導(dǎo)致更多氧化性物質(zhì)產(chǎn)生,該循環(huán)最終導(dǎo)致持續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng),而在氧化應(yīng)激中存活的癌細(xì)胞通過增強(qiáng)抗氧化能力來調(diào)動(dòng)一系列適應(yīng)性機(jī)制,這種適應(yīng)性將有助于腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移及對(duì)ROS介導(dǎo)的腫瘤治療的抗性[13],因此,破壞腫瘤氧化還原穩(wěn)態(tài)對(duì)癌癥治療至關(guān)重要。ROS主要在線粒體氧化代謝過程中產(chǎn)生,直接影響氧化還原穩(wěn)態(tài),其積累對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出雙重作用,一般來說,ROS上調(diào)會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生,但越來越多的證據(jù)表明ROS過度積累可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。過量產(chǎn)生ROS可導(dǎo)致細(xì)胞器功能障礙、氧化還原穩(wěn)態(tài)紊亂,并通過ROS相關(guān)的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,大多數(shù)抗癌劑是通過增加ROS產(chǎn)生和消耗GSH水平來抑制癌細(xì)胞活力的[15-16]。Liang等[17]研究發(fā)現(xiàn),紫草素可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生觸發(fā)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;Tsai等[18]研究結(jié)果顯示,紫草素可通過升高不同類型腎癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平減少腫瘤細(xì)胞增殖并引發(fā)程序性細(xì)胞死亡;另有研究表明,紫草素可通過激活ROS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖和腫瘤生長[19]。GSH是細(xì)胞內(nèi)最豐富的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)劑,可保護(hù)細(xì)胞免受ROS生成介導(dǎo)的氧化損傷,其消耗可使細(xì)胞對(duì)凋亡刺激敏感或促進(jìn)線粒體透化而使細(xì)胞易于死亡[20],MDA可反映質(zhì)膜的氧化損傷程度。本研究結(jié)果顯示,紫草素可呈濃度依賴性提高T24細(xì)胞內(nèi)的ROS及MDA水平,降低GSH含量,提示紫草素可能是通過介導(dǎo)BC細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡進(jìn)而抑制BC細(xì)胞惡性增殖并誘導(dǎo)凋亡。

Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)維持氧化還原穩(wěn)態(tài)并在正常細(xì)胞中發(fā)揮抗炎和抗癌活性,但據(jù)報(bào)道,Nrf2在癌癥中被異常激活,增強(qiáng)的Nrf2表達(dá)可保護(hù)腫瘤細(xì)胞DNA免受ROS介導(dǎo)的損傷并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成,同時(shí)提高化學(xué)和放射抗性,與預(yù)后不良相關(guān)[21]。生理?xiàng)l件下,Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)并依賴Keap1介導(dǎo)的蛋白酶體快速降解,組成性地維持在低蛋白水平;氧化損傷期間,Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合并激活其下游靶基因,包括HO-1、NQO-1及參與GSH合成的酶等[22]。研究發(fā)現(xiàn),通過增加Keap1表達(dá),促進(jìn)Nrf2泛素化降解,可抑制卵巢腫瘤生長[23];Nrf2沉默可抑制細(xì)胞增殖,提高細(xì)胞凋亡率,提高癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平[24],另有研究結(jié)果顯示,激活Nrf2依賴性抗氧化反應(yīng)可保護(hù)BC細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷并促進(jìn)BC生長[25]。本研究結(jié)果顯示,紫草素呈濃度依賴性提高Keap1 mRNA及蛋白表達(dá),降低Nrf2 mRNA和蛋白及其下游抗氧化靶基因HO-1、NOQ1蛋白表達(dá),提示紫草素可能通過抑制Keap1/Nrf2抗氧化通路激活,提高T24細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,促使癌細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡而達(dá)到細(xì)胞損傷作用,即促進(jìn)癌細(xì)凋亡并抑制其惡性增殖。

綜上所述,紫草素可抑制BC細(xì)胞的惡性增殖并促進(jìn)其凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制Keap1/Nrf2抗氧化通路激活,降低抗氧化因子水平,促進(jìn)癌細(xì)胞內(nèi)ROS過度積累有關(guān)。