田鳳鳴，陳強，何九軍，王瀚，卓平清，王讓軍

（1.隴南師范高等專科學校 農(nóng)林技術(shù)學院，甘肅隴南 742500；2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅隴南 742500）

由腐皮鐮孢菌（Fusariumsolani）[1]引起的花椒根腐病會導致花椒根系腐爛，葉片變小、枝條發(fā)育不全，嚴重時會引起整株枯死，給花椒產(chǎn)量和品質(zhì)帶來了嚴重影響，造成極大的經(jīng)濟損失．花椒根腐病的防治一直是生產(chǎn)上難以解決的問題，由于花椒病蟲害多發(fā)，農(nóng)藥和化肥的使用量大，導致花椒生產(chǎn)存在較大的生態(tài)和食品安全隱患．生物農(nóng)藥因?qū)Νh(huán)境和人畜無害且對植物病原菌會產(chǎn)生持續(xù)的抑制效果，所以在發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用上逐漸受到科研學者的關(guān)注．田鳳鳴等[2-3]針對腐皮鐮孢菌篩選出了5 種高效、污染小、低毒的農(nóng)藥，并發(fā)現(xiàn)綠色木霉和哈茨木霉的復(fù)配使用對花椒根腐有著良好的拮抗作用．當前，真菌、細菌、放線菌和病毒等具有抑制病原菌生長和抗逆能力強等特點[4-5]的生防菌已成為研究重點，其中貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）T-1[6]是一株在花椒根腐病的防治中具有較大生防潛力的細菌．

環(huán)境中的各種因素，如pH、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量等，都會嚴重影響微生物的生長，合理的發(fā)酵條件試驗設(shè)計會提高微生物的菌體濃度[7]．響應(yīng)面法（Response Surface Methodology, RSM）用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析獲取最優(yōu)工藝參數(shù)[8-9]，其試驗設(shè)計具有簡單、快速、準確的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用在食品、生物學、農(nóng)學、化學等領(lǐng)域．本研究以pH、培養(yǎng)溫度、接種量、搖床轉(zhuǎn)速為自變量，在前期單因素綜合試驗基礎(chǔ)上，開展響應(yīng)面設(shè)計分析，優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌T-1 的發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)，確定該菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件，進一步提高該菌的菌體濃度，以期為研究開發(fā)防治花椒根腐病的生物菌劑及應(yīng)用提供可靠理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1）供試菌株．貝萊斯芽孢桿菌T-1，花椒根腐病病原菌腐皮鐮孢菌均由本校微生物實驗室分離鑒定獲得并保存．

2）供試培養(yǎng)基配制．①NA 液體培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，5.0 g 牛肉膏，1.5 g NaCl，1000 mL 蒸餾水，pH 值調(diào)至6.5～7.5．②PDB 培養(yǎng)基：20.0 g 葡萄糖，200.0 g 馬鈴薯，1000 mL 蒸餾水，pH 值調(diào)至7.0～7.5．③LB 培養(yǎng)基：10.0 g 胰蛋白胨，5.0 g 酵母浸粉，5.0 g NaCl，1000 mL 蒸餾水，pH 值調(diào)至7.0～7.5．④BPY培養(yǎng)基：5.0 g 牛肉浸粉，10.0 g 蛋白胨，5.0 g 酵母浸粉，5.0 g NaCl，10.0 g 葡萄糖，1000 mL 蒸餾水，pH值調(diào)至7.0～7.5．⑤YSP 培養(yǎng)基：5.0 g 酵母浸粉，10.0 g 蛋白胨，10.0 g 蔗糖，1000 mL 蒸餾水，pH 值調(diào)至7.0～7.5．⑥NYBD 培養(yǎng)基：10.0 g葡萄糖，8.0 g牛肉浸膏，5.0 g 酵母浸粉，1000 mL 蒸餾水，pH 值調(diào)至7.0～7.5．⑦改良的BPY 培養(yǎng)基：5.0 g 牛肉浸粉，10.0 g 蛋白胨，5.0 g 酵母浸粉，5.0 g KH2PO4，10.0 g葡萄糖，1000 mL蒸餾水，pH值調(diào)至7.0～7.5．

1.2 試驗方法

1）種子液的制備．將貝萊斯芽孢桿菌T-1 單菌落接種于LB 固體培養(yǎng)基中，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h．挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)12 h 后，再次轉(zhuǎn)接于LB 液體培養(yǎng)基中．通過測定其生長曲線，確定最佳對數(shù)生長期時間為21 h 的菌體發(fā)酵液為種子液．

2）前期試驗結(jié)果．綜合考慮成本的基礎(chǔ)上確定該菌最適的培養(yǎng)基為改良的BPY 培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/150 mL 錐形瓶．菌T-1 利用的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母粉、牛肉粉、蛋白胨，最佳無機鹽為KH2PO4．

3）拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素試驗．試驗按種子液制備的方法進行培養(yǎng)，發(fā)酵液利用分光光度計測量其濁度，OD600值的大小表示其菌體的濃度，每次試驗3 次重復(fù)，逐步篩選出各條件下最優(yōu)的發(fā)酵參數(shù)．

①pH 值對貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的影響．在綜合考慮成本和前期試驗的基礎(chǔ)上，用1mol/L HCl 或NaOH 溶液將改良的BPY 培養(yǎng)液的pH 調(diào)為2.5～11.5，pH 段之間以1 為梯度，接種量為1%，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min，進行培養(yǎng)21 h 后，測定OD600值，每次試驗3 次重復(fù)，篩選出最佳pH．

②培養(yǎng)溫度對貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的影響．以最佳pH 值，設(shè)置培養(yǎng)溫度為28、30、32、34、36、40 ℃六個梯度，接種量為1%，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min，進行培養(yǎng)21 h 后，測定OD600值，每次試驗3次重復(fù)，確定最適培養(yǎng)溫度．

③接種量對貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的影響．以最優(yōu)pH 值，最適溫度，設(shè)置接種量為1%、2%、3%、4%、5%、6%六個梯度，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min，進行培養(yǎng)21 h 后，測定OD600值，每次試驗3次重復(fù)，確定最佳接種量．

④搖床轉(zhuǎn)速對貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的影響．以最優(yōu)pH值，最適溫度，最佳接種量，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為140、160、180、200 r/min、4 個條件，進行培養(yǎng)21 h 后，測定OD600值，每次試驗3 次重復(fù)，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速．

4）貝萊斯芽孢桿菌T-1 菌體濃度的測定．取部分1.2.1 中發(fā)酵液利用分光光度計測定OD600值，每次試驗3次重復(fù)．

5）響應(yīng)面設(shè)計．在單因素試驗的基礎(chǔ)上，綜合考慮對菌株濃度的影響，選定A（pH）、B（培養(yǎng)溫度）、C（接種量）、D（搖床轉(zhuǎn)速）作為4 個主要考察因素并以1、0、-1表示四個因素的高低水平，以菌T-1發(fā)酵液OD600為響應(yīng)值進行響應(yīng)面組合試驗，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)、試驗因素和水平（見表1）．用Design Expert 11 采用4 因素3 水平29 組試驗進行響應(yīng)面設(shè)計，確定最佳發(fā)酵條件．

表1 優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌T-I發(fā)酵培養(yǎng)條件因素與水平的響應(yīng)面設(shè)計Table 1 Response surface design for optimizing factors and levels of B. velezensis T-I fermentation culture conditions

6）數(shù)據(jù)處理．通過SPSS 分析數(shù)據(jù)，得出結(jié)果，用“平均值±標準差”表示，顯著性差異比較通過單因素方差分析得出，p＜0.05 為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著；用Excel作圖；所有試驗重復(fù)3次．

7）發(fā)酵條件驗證試驗．采用上述最佳發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)進行試驗?zāi)Ｐ偷尿炞C，測定菌體濃度OD600值，所得結(jié)果與理論值相比，計算相對誤差，證實模型的有效性，以此驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性．

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

1）貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳pH值．由圖1可知：貝萊斯芽孢桿菌T-1對pH 的適應(yīng)范圍較為廣泛，在4.5～9.5 之間均能生長，但強酸、強堿的環(huán)境明顯阻礙了該菌株的生長，pH 值小于4.5時，生長極其緩慢，OD600值低至0.053，pH值大于9.5時，生長也明顯受到了阻礙，OD600值僅為0.018，強酸強堿條件下，其發(fā)酵液澄清，幾乎無菌體生長，綜合分析，隨著pH 的升高OD600出現(xiàn)先升后降的趨勢，在pH 為6.5 時OD600最大，吸光值達1.869，因此選用6.5為最佳pH，用于后續(xù)試驗．

圖1 pH對貝萊斯芽孢桿菌T-1發(fā)酵培養(yǎng)的影響Fig.1 Effects of pH on fermentation culture of B. velezensis T-1

2）貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)溫度．在最佳pH基礎(chǔ)上，不同的培養(yǎng)溫度對拮抗菌T-1 的生長影響較大（如圖2），在28℃ ～ 34℃間均能很好地生長，溫度過高或過低都不利于該菌株的生長，溫度為30℃時生長最好，OD600可達1.811，此時的OD600均高于其他6 個溫度，p＜0.05，因此選30℃為該菌培養(yǎng)的最佳溫度，用于后續(xù)的實驗．

圖2 溫度對貝萊斯芽孢桿菌T-1發(fā)酵培養(yǎng)的影響Fig.2 Effects of temperature on fermentation culture of B. velezensis T-1

3）貝萊斯芽孢桿菌T-I 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳接種量．在最佳pH和最適溫度的基礎(chǔ)上，篩選最佳的接種量對拮抗菌T-1 的發(fā)酵培養(yǎng)的影響，由圖3 可知：接種量對拮抗菌T-1 的影響較大，隨著接種量的增加，拮抗菌T-1 的OD600出現(xiàn)由升后降的現(xiàn)象，從經(jīng)濟和綜合考慮4%為該菌的最佳接種量，OD600可達1.926．

圖3 接種量對貝萊斯芽孢桿菌T-1發(fā)酵培養(yǎng)的影響Fig.3 Effects of inoculum size on fermentation culture of B. velezensis T-1

4）貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳搖床轉(zhuǎn)速．由圖4 可知，發(fā)酵液OD600隨著轉(zhuǎn)速的增加表現(xiàn)為先升后降，轉(zhuǎn)速在180 r/min 時，OD600可達1.883，在200 r/min 時，其發(fā)酵液OD600結(jié)果次之，可達1.868，因此，將180 r/min確定為最佳搖床轉(zhuǎn)速．

圖4 轉(zhuǎn)速對貝萊斯芽孢桿菌T-1發(fā)酵培養(yǎng)的影響Fig.4 Effects of rotational speed on fermentation culture of B. velezensis T-1

2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果

拮抗菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化工藝在前期試驗基礎(chǔ)上考察A（pH）、B（溫度）、C（接種量）、D（搖床轉(zhuǎn)速）單因素試驗基礎(chǔ)上開展，按照4因素3水平的二次回歸擬合及方差分析，結(jié)果見表2、表3．研究各試驗因子對拮抗菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的影響，通過響應(yīng)面統(tǒng)計分析得出的回歸模型為：

表2 貝萊斯芽孢桿菌T-1發(fā)酵培養(yǎng)條件響應(yīng)面模型及方差分析Table 2 Response surface model and variance analysis of B. velezensis T-1 fermentation conditions

表3 貝萊斯芽孢桿菌T-1響應(yīng)面設(shè)計及實驗結(jié)果Table 3 Response surface design and experimental results of B. velezensis T-1

由發(fā)酵條件模型分析及方差分析結(jié)果可知，回歸模型極顯著（p＜0.01），說明模型對響應(yīng)值擬合良好．A一次項（A）、B一次項（B）、二次項（A2、B2、C2、D2）和A、B、C、D的交互項（AB、AC、AD、BD、CD）都達到極顯著水平（p＜0.01），一次項D對拮抗菌T-1 的OD600具有顯著水平（p＜0.05），說明OD600的變化復(fù)雜，各試驗因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，試驗結(jié)果表明：pH、溫度、轉(zhuǎn)速三個因素對拮抗菌T-1 的發(fā)酵培養(yǎng)工藝影響顯著．失擬度為0.1666，大于0.05，說明試驗點均能用模型描述．拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝模型決定系數(shù)分別為R2=0.9971，說明模型的相關(guān)性很好，并能較好地進行響應(yīng)值的變化分析，確定最佳發(fā)酵條件．經(jīng)擬合檢驗后校正系數(shù)R2adj= 0.9981，兩者非常接近，說明拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)響應(yīng)面二次回歸擬合度很好．信噪比RAdeqPrecision= 129.207，大于4，說明該模型的試驗設(shè)計可靠，可信度高，預(yù)測較準確．F值的大小表明各因子對試驗指標的重要性，F(xiàn)值越大，說明該因子越重要．由表2 可知，F(xiàn)B＞FA＞FD＞FC，即對貝萊斯芽孢桿菌T-1 菌株發(fā)酵的影響程度： 溫度＞pH＞搖床轉(zhuǎn)速＞接種量．

根據(jù)響應(yīng)面法分析數(shù)據(jù)，利用Design Expert 11繪制出的響應(yīng)曲面（圖5-10）的陡峭與平緩直觀地反映了pH 值、溫度、接種量、轉(zhuǎn)速四種試驗因子對OD600的影響，即四個因素對花椒根腐病拮抗菌T-1發(fā)酵培養(yǎng)的影響．由圖可見，響應(yīng)曲面均為開口朝下的凸型曲面，表明響應(yīng)值有著極高值；曲面坡度都比較陡峭，說明其因子之間交互作用復(fù)雜；各因素之間的交互作用對拮抗菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的影響程度由大到小的順序為：pH 值與轉(zhuǎn)速—接種量與轉(zhuǎn)速—pH 值與溫度—pH 值與接種量—溫度與轉(zhuǎn)速—溫度與接種量，其中除了溫度與接種量，其余其他因素之間的交互因素對拮抗菌T-1 的OD600影響顯著，這與之前的方差分析結(jié)果相符合．

圖5 pH值和溫度交互作用對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of the effect of pH and temperature interaction on the growth of B. velezensis T-1

圖6 pH值和接種量交互作用對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of the effect of the interaction between pH and inoculum on the growth of B. velezensis T-1

圖7 pH值和轉(zhuǎn)速交互作用對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot of the effect of pH and rotational speed interaction on the growth of B. velezensis T-1

圖8 轉(zhuǎn)速和溫度的交互作用對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot of the interaction of rotational speed and temperature on the growth of B. velezensis T-1

圖9 溫度和接種量的交互作用對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot of the interaction of temperature and inoculum size on the growth of B. velezensis T-1

圖10 轉(zhuǎn)速和接種量的交互作用對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plots of the interaction of rotational speed and inoculum size on the growth of B. velezensis T-1

根據(jù)拮抗菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)條件響應(yīng)曲面模型分析和方差分析結(jié)果，可以確定拮抗菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳工藝參數(shù)：pH 值為7.14、溫度為30.8℃、接種量為4.01%、搖床轉(zhuǎn)速為180.8 r/min，拮抗菌T-1發(fā)酵培養(yǎng)OD600達到1.912 8．結(jié)合生產(chǎn)實際情況及操作的可行性，將拮抗菌T-1 的最佳發(fā)酵條件修正為pH 7.0、培養(yǎng)溫31 ℃、接種量4%、搖床轉(zhuǎn)速181 r/min．

2.3 貝萊斯芽孢桿菌T-1發(fā)酵參數(shù)驗證實驗

為了再次確定該模型的后期的可靠性，對優(yōu)化后的發(fā)酵參數(shù)進行了3 次驗證，測定貝萊斯芽孢桿菌T-1 的OD600值分別為：1.897、1.908、1.910，平均值為1.905，與預(yù)測值1.9128 非常接近，因此，本文建立的模型效果良好，優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)可靠，在后期生產(chǎn)中具有應(yīng)用價值．

3 結(jié)果與討論

利用生防細菌對植物病害進行防治已成為當今的一個研究熱點[10]． 拮抗菌中將芽孢桿菌（Bacillusspp.）作為研究的重點對象．其生長迅速，能夠產(chǎn)生抑菌的有效成分，諸如抗菌蛋白、肽等，不會污染環(huán)境，對人體也無毒害[11-12]．菌株所處的生長環(huán)境會影響活性菌的抗菌性，利用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵參數(shù)能提高該菌株的抗菌能力[13]．2016 年以來，貝萊斯芽孢桿菌受到了研究者的關(guān)注，相關(guān)研究論文、專利呈現(xiàn)快速增長態(tài)勢[14]，尤其是在抑制病原菌和生物防治方面的研究占據(jù)優(yōu)勢．

發(fā)酵培養(yǎng)基是微生物繁殖、代謝的基礎(chǔ)，微生物數(shù)量和抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量受到其培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的影響[15-16]．李姝江[17]等人利用響應(yīng)面法對貝萊斯芽孢桿菌ZJ20 發(fā)酵參數(shù)進行了優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)條件為：pH 7.2、轉(zhuǎn)速160 rpm/min、溫度28℃．甄新武[18]等人優(yōu)化了貝萊斯芽孢桿菌z27 菌株培養(yǎng)參數(shù)，獲得最佳培養(yǎng)基組分：豆餅粉為1.5%，MnSO4.H2O 0.07%，玉米粉為2.0%，這與本試驗對貝萊斯芽孢桿菌T-1 發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果有所不同，可能不同地域篩選出的不同菌株對培養(yǎng)基成分的需求和生長環(huán)境有差異．

響應(yīng)面法在微生物發(fā)酵中被越來越多的應(yīng)用，它是一種試驗次數(shù)少、周期短、精度高，研究多種因素交互作用的試驗分析方法[19-20]．本試驗以改良的BPY 為培養(yǎng)基，裝液50 mL/150 mL，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定pH、溫度、接種量、搖床轉(zhuǎn)速為自變量，以拮抗菌T-1 的OD600為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面的分析，結(jié)合生產(chǎn)實際得到優(yōu)化的最佳發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)為：pH 7.0，溫度30℃，接種量4%，搖床轉(zhuǎn)速181 r/min．在此條件下發(fā)酵液OD600值達到1.9128．在后期的實驗中利用此模型進行了驗證，得到的OD600值為1.905，與模型預(yù)測值得到的結(jié)果相近，說明模型可用于后期的生產(chǎn)實踐．在優(yōu)化前菌落數(shù)為43.8×107CFU/mL，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)后菌落數(shù)可達83.6×108CFU/mL，與優(yōu)化前相比提高了19.08 倍．此結(jié)果證明響應(yīng)面法在提高優(yōu)化效率、增加菌量、降低成本等方面具有優(yōu)良的作用，本文優(yōu)化后的貝萊斯芽孢桿菌T-1 為后期生物菌劑的研發(fā)提供了新的生物資源，有望投入工業(yè)化生產(chǎn)中．