劉雯雯，胡連清，牟嘉勇，蒙昌廷，張淑瑤，舒豪，馮瑞章，魏琴，周萬海

（1.宜賓學(xué)院 四川省油樟工程技術(shù)研究中心，四川宜賓 644000；2.宜賓學(xué)院 農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000）

植物內(nèi)生真菌是指長期或生活史某一個階段定殖于健康植物內(nèi)部而不引起宿主明顯病理癥狀的微生物，利用組織學(xué)方法可從表面嚴(yán)格消毒植物組織中分離純化出來[1-2]．研究表明，內(nèi)生真菌種類和數(shù)量會因不同宿主或同一宿主的不同地域、季節(jié)或器官等而不同[3]，同時內(nèi)生真菌與宿主長期共存條件下已建立互利共生關(guān)系，促進(jìn)植物生長、增強宿主抗病性和環(huán)境適應(yīng)的能力．部分內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)，對植物的種群結(jié)構(gòu)、健康狀態(tài)和生存具有重大影響，現(xiàn)已證實它在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、發(fā)酵工程、生物防治等方面具有較大潛力[4]．近年來，已對丹參[5]、蘆葦[6]、黃芪[7]等不同生境植物內(nèi)生真菌展開了研究．內(nèi)生真菌可作為新的資源來替代短缺的藥用植物并保護瀕臨滅絕的天然植物物種[8]，故研究內(nèi)生真菌多樣性對了解其與宿主的生態(tài)演化、發(fā)掘活性功能菌株等具有重要意義．

油樟（Cinnamomumlongepaniculatum）屬樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum），是我國特有的香料林業(yè)資源，主要分布于四川省宜賓市，面積達(dá)3.13×104hm2，已成為當(dāng)?shù)刂鲗?dǎo)產(chǎn)業(yè)之一．油樟根、莖、葉中富含松油烯4-醇、1,8-桉葉油素和α-松油醇等重要化學(xué)成分，可用于香精香料、食品添加劑、醫(yī)藥等行業(yè)，具有重要經(jīng)濟價值．關(guān)于油樟內(nèi)生菌的多樣性和功能性已有許多研究，如馮瑞章等[4]從油樟中篩選到3 株具有溶磷作用的內(nèi)生細(xì)菌，對植物的生長、抗性和生物防治具有應(yīng)用效果；嚴(yán)寬等[9]的研究顯示利用油樟內(nèi)生真菌孢子懸浮液能顯著提高葉片的揮發(fā)油含量；譚韻雅等[10]發(fā)現(xiàn)YY26、YG42油樟內(nèi)生真菌可促進(jìn)1,8-桉葉油素等成分的積累物質(zhì)，但會抑制YG71 菌株中代謝產(chǎn)物的分泌．目前內(nèi)生菌的研究主要集中在油樟葉和根部位，而未見關(guān)于不同季節(jié)油樟莖內(nèi)生真菌的分布情況與多樣性的分析，基于此，本研究以四川宜賓地區(qū)不同生長季節(jié)油樟莖為材料，分析莖部內(nèi)生真菌的分布情況與多樣性，并對分離純化菌株進(jìn)行產(chǎn)黃酮、抗氧化、產(chǎn)酶等功能挖掘，以期為油樟內(nèi)生真菌功能的深度挖掘、內(nèi)生真菌資源多樣性及提供可應(yīng)用的功能菌株奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)更有效地保護和開發(fā)油樟資源，從而緩解油樟資源匱乏和生態(tài)環(huán)境惡化．

1 材料與方法

1.1 材料

油樟采自四川省宜賓市高縣（28°47'77″N、104°59'76″E）油樟優(yōu)良品系譜，根據(jù)前期不同株系產(chǎn)樟油量的評價，選取5 株產(chǎn)油性能差異大的株系為材料，分別于春、夏、秋、冬各季于此5 株油樟樹體上、中、下部隨機采摘足夠的莖，混合均勻后，用冰盒立刻帶回實驗室，存于4℃冰箱．馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、卵磷脂吐溫80 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌分離純化．

1.2 方法

（1）油樟莖部內(nèi)生真菌的分離純化．將不同季節(jié)油樟莖分別進(jìn)行消毒，消毒步驟為：無菌水沖洗3次，其次用95%酒精浸泡1 min，再用4%次氯酸鈉浸泡5 min 后，用95%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗4 ～6 次，最后用無菌剪刀將莖剪成2 ～ 3 mm 小段．取最后一次沖洗液0.1 mL 涂布于PDA 培養(yǎng)基平板上，26℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，檢測表面消毒效果．將剪好的莖段接種到培養(yǎng)基中，需均勻地接種5 個莖段．置于恒溫培養(yǎng)箱中26℃ 5d 培養(yǎng)，觀察空白培養(yǎng)基，若未出現(xiàn)菌落，則開始進(jìn)行純化．根據(jù)不同菌株生長周期的不同，分別一段時間內(nèi)先后進(jìn)行3 次挑菌．通過形態(tài)學(xué)分析法，挑選形態(tài)、顏色、大小不同的菌落用三點法（一個平板上等距離接種三個地方，大致呈三角形狀）挑至對應(yīng)的培養(yǎng)基上，直至得到三個純的單菌落的平板，封好置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）內(nèi)生真菌的ITS 序列分析．利用真菌DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA，以真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')為引物，擴增ITS 保守區(qū)域．PCR 反應(yīng)體系包括： 2 μL DNA模板、1 μL ITS1（10 mM）、1 μL ITS4（10 mM）、25 μL 2×Taq PCR MasterMix、21 μL ddH2O．PCR 擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性35 s，58℃退火55 s，72℃延伸45 s，共45 個循環(huán)，72℃再延伸10 min．PCR 產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測．然后送檢公司為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序．將所得序列信息提交至NCBI 網(wǎng)站BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對．

（3）油樟莖內(nèi)生真菌多樣性分析．選用4 個指標(biāo)評價油樟莖內(nèi)生真菌的多樣性，即物種豐富度S、Shannon-Weiner 多樣性H'、Simpson 優(yōu)勢度D、均勻度E，計算公式為：

式中：N為樣本全部屬數(shù)之和，Pi為屬相對頻率，指樣本中分離某屬的菌株數(shù)占分離總菌株數(shù)的百分比．

（4）內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮菌株的篩選和形態(tài)學(xué)鑒定．參考柯樹煒等[11]方法對菌株發(fā)酵液和菌絲體中次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，4℃保存?zhèn)溆茫x擇氯化鋁溶液、氫氧化鈉溶液、氯化鐵溶液和鹽酸-鎂粉溶液[12]顯色反應(yīng)初步篩選產(chǎn)黃酮菌株，并利用紫外分光光度法[13]測定黃酮產(chǎn)量．

（5）產(chǎn)黃酮菌株的其他功能分析．采用福林酚法測定菌株菌絲體和發(fā)酵液中多酚的含量[14]．參考潘峰等[15]的方法測定菌株的抗氧化活性（總抗氧化活性測定（ABTS 法）和DPPH 自由基清活性試驗）；采用平板對峙法測定菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、米根霉和橘青霉的抑制功能[16]；參考胡宇玲等[17]方法測定菌株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶的功能．

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)油樟莖內(nèi)生真菌的分離及群落組成

通過培養(yǎng)技術(shù)共獲得98 株內(nèi)生真菌，其中春、夏、秋、冬季分別分離得到27、20、28、23 株菌，秋季獲得的內(nèi)生真菌數(shù)量最多，占內(nèi)生真菌總菌株數(shù)的28.57%．由表1 可知，春季油樟莖分離的27 株內(nèi)生真菌隸屬于13 個屬22 種，其中附球菌屬（Epicoccum）與鏈格孢屬（Alternaria）為春季油樟莖中的優(yōu)勢菌屬．春季分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1．由表2 可知，夏季油樟莖獲得的20 株內(nèi)生真菌隸屬于8 屬19種，其中Diaporthe為第1 優(yōu)勢菌屬，Alternaria與Neofusicoccum均為第2 優(yōu)勢菌屬，夏季分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示．由表3可知，秋季油樟莖分離的28株內(nèi)生真菌隸屬于13個屬22種，其中Alternaria為優(yōu)勢菌屬．秋季分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3．由表4可知冬季油樟莖分離的23株內(nèi)生真菌隸屬于14 個屬22 種，其中Alternaria為優(yōu)勢菌屬，冬季分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示．

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的春季油樟莖內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的夏季油樟莖內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的秋季油樟莖內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的冬季油樟莖內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 不同季節(jié)油樟莖內(nèi)生真菌屬類Venn圖

表1 春季油樟莖內(nèi)生真菌分布

表2 夏季油樟莖內(nèi)生真菌分布

表4 冬季油樟莖內(nèi)生真菌分布

對油樟莖部內(nèi)生真菌進(jìn)行生物分類學(xué)統(tǒng)計可知，98 株內(nèi)生真菌隸屬于2 門3 綱8 目21 科30 屬，子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢門，座囊菌綱（Dothideomycetes）為優(yōu)勢綱，格孢腔菌目（Pleosporales）為優(yōu)勢目，格孢菌科（Pleosporineae）為優(yōu)勢科，Alternaria為優(yōu)勢屬．春季27 株內(nèi)生真菌隸屬于1 門2 綱6 目10科13屬，夏季20株內(nèi)生真菌隸屬于1門2綱6目7科8屬19種，秋季28株內(nèi)生真菌隸屬于1門2綱5目11科13 個屬22 種，冬季23 株內(nèi)生真菌隸屬于2 門3 綱7 目12 科14 個屬22 種．由圖1 可知，4 個季節(jié)共有屬2 個，為Alternaria和Colletotrichum．春、夏、秋、冬特有屬分別為5、2、5、7 個，其中Arthrinium、Calonectria、Epicoccum、Paraphaeosphaeria、Phoma為春季特有屬；Eutypella、Guignardia為夏季特有屬；Austropleospora、Didymella、Periconia、Shiraia、Pyrenochaetopsis為秋季特有屬；Bjerkandera、Didymocyrtis、Microsphaeropsis、Ophiosphaerella、Pestalotiopsis、Plectosphaerella和Trametes為冬季特有屬．

2.2 不同季節(jié)油樟莖內(nèi)生真菌的多樣性

香農(nóng)-維納指數(shù)H'和辛普森指數(shù)D均反映物種的豐富度，均勻度指數(shù)E用于分析內(nèi)生真菌群落分布的均勻程度，通過表6 的多樣性分析可知，不同季節(jié)油樟莖內(nèi)生真菌S指數(shù)、H'指數(shù)、D指數(shù)和均勻度指數(shù)E均表現(xiàn)為： 冬季＞春季 ≈ 秋季＞夏季，因此，冬季油樟莖內(nèi)生真菌群落的多樣性相對最豐富，夏季最低．

表6 不同季節(jié)油樟莖內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)

2.3 內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮功能篩選

通過顯色反應(yīng)初篩，98 株內(nèi)生真菌中Q73、C18、Q32、Q13、D20、C5、C80、X32、X44、X120、X224、X225、C34、D79 和D97 菌株具有較好的產(chǎn)黃酮能力， 其中4 株分離于春季， 5 株分離于夏季，3 株分離于秋季， 3 株分離于冬季， 共歸類于1 門2綱5 目8 科11 屬，分別是Alternaria、Microsphaeropsis、Epicoccum、Phoma、Paraconiothyrium、Colletotrichum、Diaporthe、Eutypella、Pestalotiopsis、Paraphaeosphaeria和Neofusicoccum． 其中Q73 顯色反應(yīng)最好，屬于Alternaria，4 種顯色試劑均顯色．通過紫外分光光度計法測定可得Q73 菌絲體產(chǎn)黃酮量3.29 mg/g，發(fā)酵液產(chǎn)黃酮量為0.04 mg/mL．

2.4 Q73內(nèi)生真菌其他功能的篩選

ABTS 自由基清除試驗通常用于評價化合物總抗氧化活性，DPPH 是一種穩(wěn)定自由基組成的深藍(lán)色結(jié)晶粉末，通常用于天然產(chǎn)物對自由基清除活性的評價．由實驗結(jié)果可以看出，菌株Q73 均具有較好的抗氧化活性，其中菌絲體ABTS 的清除活性為（72.93±2.31）%，發(fā)酵液ABTS 清除率為（56.00±0.98）%，對DPPH 清除活性分別為（82.60±1.58）%、（27.68±0.63）%．在多酚含量測定中可得，Q73 菌株菌絲體多酚含量為2.114 mg/g，發(fā)酵液多酚含量為104.82 ug/ml．通過產(chǎn)酶功能篩選發(fā)現(xiàn)，Q73 在果膠酶鑒別培養(yǎng)基上產(chǎn)生了光暈，說明Q73 具有產(chǎn)果膠酶的功能，其他鑒別培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)透明圈．在抑菌功能測定中顯示，Q73菌株對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有較強的抑菌活性，對其他病原菌無拮抗作用．

3 討論

內(nèi)生真菌是參與宿主植物生長、發(fā)育及代謝等過程的重要因子，極具研究價值并涵蓋豐富的微生物資源，為開發(fā)潛在菌株并分析與宿主功能相關(guān)性具有重要意義，其定殖于植物體內(nèi)受到內(nèi)部因子（宿主植物種類）和外部因子（氣候條件、地理位置、溫度等）因素的影響[18]．目前對植物莖中內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究較多，而內(nèi)生真菌相對較少．辛赫文等[19]從河南小麥莖部分離獲得100 株內(nèi)生真菌，其中子囊菌是小麥內(nèi)生真菌的主要類群，優(yōu)勢屬為Penicillium，相對分離頻率為66.70%．寧祎等[20]對桃兒七莖部內(nèi)生真菌研究也發(fā)現(xiàn)，子囊菌門占絕對優(yōu)勢，但優(yōu)勢屬為擬青霉屬．本研究從不同季節(jié)油樟莖組織共獲得98株內(nèi)生真菌，隸屬于2門3綱8目21科30 屬，其中優(yōu)勢門為Ascomycota，優(yōu)勢屬為Alternaria．優(yōu)勢門與上述研究相同，但優(yōu)勢屬存在差異，這正是因為宿主植物種類不同而呈現(xiàn)不同的內(nèi)生真菌組成．Alternaria隸屬于真菌界、子囊菌門、座囊菌綱、格孢腔菌目、格孢菌科，廣泛存在于禾本植物中[21]，研究表明該屬類大多數(shù)菌種寄生在植物中，少數(shù)菌株可侵染人和動物，同時發(fā)現(xiàn)Alternaria具有應(yīng)用潛力的生物資源，如長柄鏈格孢部分菌株的分生孢子可制備生防制劑，用于防治煙草的赤星病[22]，且鏈孢霉菌絲體能提取得到蛋白質(zhì)、糖分、淀粉等產(chǎn)物，用于飼料中可提高營養(yǎng)價值，促進(jìn)精飼料的形成[23]．Shahid 等[24]研究表明Alternaria、Epicoccum和Fusarium在許多植物組織的定殖率均最高，與本試驗相同，從油樟莖中均分離到以上屬類菌株，但相比于宏基因組技術(shù)，利用傳統(tǒng)組織分離法無法分離到油樟莖中不可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，因此后續(xù)還將利用高通量技術(shù)實現(xiàn)莖部內(nèi)生真菌的分析．

按季節(jié)看，春季27 株內(nèi)生真菌隸屬于1 門2 綱6目10 科13 屬，夏季20 株內(nèi)生真菌隸屬于1 門2 綱6目7科8屬19種，秋季28株內(nèi)生真菌隸屬于1門2綱5 目11 科13 個屬22 種，冬季23 株內(nèi)生真菌隸屬于2門3 綱7 目12 科14 個屬22 種．通過多樣性指數(shù)和均勻度結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌數(shù)量和種屬隨季節(jié)不同而不同，冬季油樟莖內(nèi)生真菌群落的多樣性相對最豐富，夏季最低．呂立新[25]對不同季節(jié)茅蒼術(shù)內(nèi)生真菌群落多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌群落會隨著季節(jié)變化呈現(xiàn)出一定演化規(guī)律，其中夏季內(nèi)生真菌的多樣性高于春季和秋季．羅鑫等[26]采用組織分離法對30 年生健康馬尾松不同季節(jié)內(nèi)生真菌的分離，表明秋季馬尾松內(nèi)生真菌最為豐富，其次為夏季，而冬季與夏季相似．崔文霞等[27]對不同季節(jié)魚腥草內(nèi)生真菌分離中發(fā)現(xiàn)，交鏈孢屬Alternaria和鐮孢菌屬Fusarium為優(yōu)勢菌群，且夏季分離得到的內(nèi)生真菌最多．與本試驗結(jié)果不同，說明不同季節(jié)內(nèi)生真菌的差異性可能與菌株對營養(yǎng)需求的特殊性有關(guān)[28]，且不同植物內(nèi)生真菌存在季節(jié)性變化的差異．

植物內(nèi)生真菌對植物的生長具有積極作用，并能代謝產(chǎn)生與宿主相同或相似的天然產(chǎn)物[3]．研究發(fā)現(xiàn)在野生大豆內(nèi)生真菌Y2-2 和檉柳內(nèi)生真菌菌株C1T2-4 菌株的代謝產(chǎn)物中可檢測出脂肪酸[29]；Yang 等[30]從大豆中分離出了一株脂質(zhì)含量高達(dá)56%、脂肪酸甲酯含量高達(dá)98%的內(nèi)生菌株，且可用作生產(chǎn)生物柴油；Jagannath 等[31]發(fā)現(xiàn)從斑籽根、葉、莖、花和種子組織中分離的內(nèi)生真菌具有產(chǎn)纖維素酶的功能．關(guān)于油樟的研究主要集中在活性成分提取、組織栽培和成分的功能性研究，對內(nèi)生菌的研究也多數(shù)局限于內(nèi)生細(xì)菌，因此，油樟莖部內(nèi)生真菌生物活性代謝產(chǎn)物的研究具有較大開發(fā)利用空間．目前有麻花艽[32]、青錢柳[33]、番木瓜[11]分離內(nèi)生真菌篩選產(chǎn)黃酮功能，且產(chǎn)黃酮能力各有差異．青錢柳[33]中內(nèi)生真菌Alternaria產(chǎn)黃酮含量為3.61 mg/L；明日葉MRY-1 內(nèi)生真菌菌絲體黃酮產(chǎn)量為1.194 mg/g[34]；荷葉中篩選的棘孢曲霉Aspergillusaculeatus內(nèi)生菌總黃酮為8.2 mg/g[35]，本文篩選得到Q73 菌絲產(chǎn)黃酮量3.29 mg/g，發(fā)酵液產(chǎn)黃酮量為0.04 mg/mL，說明Q73 產(chǎn)黃酮能力中等，后期將進(jìn)一步優(yōu)化黃酮類物質(zhì)的提取方法,提高黃酮獲得量，同時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液活性物質(zhì)的產(chǎn)量低于菌絲體含量，對菌絲體和發(fā)酵液中多酚物質(zhì)的測定也證明了此結(jié)論．

據(jù)報道一定自由基對于維持正常生命活動所必需，但若自由基過多會加速機體衰老，誘發(fā)人類心腦血管疾病、腫瘤、阿爾茨海默等多種疾病的發(fā)生[36]，因此天然高效的抗氧化劑越發(fā)受到重視．本試驗通過菌株菌絲體和發(fā)酵液的ABTS 和DPPH 抗氧化能力的測定，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力與黃酮和多酚含量成正比，與其他研究結(jié)果相同，潘峰[15]證實不同溶劑提取物的黃酮和多酚含量與抗氧化活性成正相關(guān)關(guān)系；Ye 等[37]從銀杏（Ginkgo biloba）分離獲得一株內(nèi)生真菌ChaetomiumglobosumCDW7 能產(chǎn)黃酮且具有很強抗氧化活性，同時顯示黃酮物質(zhì)為菌株主要的抗氧化活性成分．本試驗還測定了Q73菌株具有產(chǎn)果膠酶、抗枯草芽孢桿菌和抗大腸桿菌的能力，值得后續(xù)進(jìn)一步研究．

目前國內(nèi)外還未見關(guān)于油樟莖內(nèi)生真菌多樣性的研究，大量的內(nèi)生真菌資源還有待挖掘和開發(fā)，為了更好地研究油樟莖內(nèi)生真菌種群多樣性，有必要采集更多不同地區(qū)樣品，以獲得更多可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌,從而為今后深入探討不同地域油樟莖內(nèi)生真菌多樣性提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步闡明油樟莖與內(nèi)生真菌相互關(guān)系、發(fā)掘活性菌株奠定基礎(chǔ)，同時為生物活性物質(zhì)篩選和油樟資源的開發(fā)提供依據(jù)．