周萬(wàn)海，胡連清，劉雯雯，蔡意鳳，馮瑞章，魏琴，趙鑫，陳露

（1.宜賓學(xué)院 農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000；2.香料植物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000；3.自貢市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川自貢 643000）

豆科植物（Legμminosae）因富含油脂、蛋白質(zhì)、 淀粉和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義[1]．近年來(lái)，由于酸雨和酸性肥料的使用，土壤酸化趨勢(shì)逐步增加，嚴(yán)重影響豆科作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量．酸化土壤中，限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的因素多種多樣[2]，除氮（N）、磷（P）等必需營(yíng)養(yǎng)元素外，鋁（Al）影響最大，是限制作物生產(chǎn)的最關(guān)鍵因素之一，研究表明，酸化土壤中鋁常以不同形式存在，其中離子態(tài)[Al3+、Al(OH)2+]對(duì)植物毒害最重，鋁毒對(duì)植物的傷害首先表現(xiàn)于破壞根尖結(jié)構(gòu)，抑制根系生長(zhǎng)，進(jìn)而影響植物的產(chǎn)量與品質(zhì)[3]．一氧化氮（NO）是一種普遍存在于生物體中的信號(hào)分子，廣泛參與生物體內(nèi)各種反應(yīng)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[4]．一定濃度的NO 對(duì)植物側(cè)根、不定根和根毛的發(fā)育有促進(jìn)作用[5]；鹽脅迫下外源添加亞硝基鐵氰化鈉（SNP）提高了苜蓿根系活力，促進(jìn)了苜蓿幼苗根系生長(zhǎng)[6]；外源添加SNP 能減輕鋁脅迫下西瓜根系氧化損傷，并通過(guò)影響根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收來(lái)緩解鋁毒作用[7-8]．因此，研究NO 對(duì)植物抗逆性的調(diào)控效應(yīng)及作用機(jī)制不僅具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值，而且對(duì)保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和探究受損環(huán)境的生物修復(fù)途徑也具有重要意義．

豆科飼草絳三葉（T.incarnatum）為車(chē)軸草屬一年生優(yōu)質(zhì)牧草，因莖葉富含蛋白質(zhì)且還可與根瘤菌共生固氮來(lái)促進(jìn)自身生長(zhǎng)和提高土壤肥力，目前已成為南方地區(qū)冬閑田的主栽牧草之一[9-10]，但受土壤酸化影響，鋁毒害已成為限制絳三葉生產(chǎn)的主要土壤環(huán)境因子之一，目前有關(guān)NO 對(duì)絳三葉耐鋁的緩解效應(yīng)研究未有報(bào)道．為進(jìn)一步闡明NO 在鋁中的作用，本文擬從豆科植物適應(yīng)鋁脅迫的限度以及探究外源NO 對(duì)鋁脅迫下的豆科作物生理影響出發(fā)，探究絳三葉耐鋁毒害的能力以及外源NO 緩解鋁脅迫的機(jī)制，為進(jìn)一步理解鋁脅迫對(duì)豆科植物生長(zhǎng)抑制的作用機(jī)制及調(diào)控方法提供依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

絳三葉種子由河南世紀(jì)天緣生態(tài)科技有限公司提供，外源NO 供體為亞硝基鐵氰化鈉（SNP），鋁離子來(lái)源為分析純AlCl3．

1.2 試驗(yàn)方法

①鋁脅迫對(duì)絳三葉種子萌發(fā)的影響．配置試驗(yàn)處理液： CK（無(wú)菌水）、500、1 000、2 000、3 000、3 500、4 000、5 000、10 000 μM 的AlCl3溶液（均含有0.5 mM 的CaCl2溶液，pH4.0），選取飽滿均勻的絳三葉種子均勻置于墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入20 mL 處理液，每個(gè)處理組3 次重復(fù)，然后將培養(yǎng)皿置于25℃，12 h 光照/12 h 黑暗，濕度為60%的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽生長(zhǎng)，處理4 d 后測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，處理10 d后測(cè)定根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、生物量和發(fā)芽率．將該試驗(yàn)結(jié)果得出的適宜鋁脅迫處理濃度記錄為FA．

②外源NO 對(duì)鋁脅迫下絳三葉種子萌發(fā)的影響．根據(jù)方法①的結(jié)果選取適宜的鋁脅迫處理濃度FA．試驗(yàn)設(shè)置CK（無(wú)菌水）、FA、FA+100 μmol/L SNP、FA+150 μmol/L SNP、FA+200 μmol/L SNP、FA+300 μmol/L SNP 共6 個(gè)處理，選取均勻飽滿無(wú)損傷的種子，每皿放置50 粒，加入20 ml 處理液，每個(gè)處理3 次重復(fù)，之后每?jī)商旒? ml 處理液，10 d 后測(cè)定發(fā)芽率、側(cè)根數(shù)、主根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)以及生物量．根據(jù)該結(jié)果選取添加外源SNP的適宜濃度記錄為FB．

③外源NO 對(duì)絳三葉幼苗生長(zhǎng)及理化特性的影響．根據(jù)方法①②的結(jié)果采用沙培法，選取飽滿均勻的種子，消毒后播種于營(yíng)養(yǎng)缽，發(fā)芽后，每3 d澆灌一次GS營(yíng)養(yǎng)液，生長(zhǎng)40 d后進(jìn)行鋁脅迫處理．試驗(yàn)設(shè)置如下處理：CK（Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液）、FB、FA、FA+FB 溶液4 個(gè)處理，每組處理重復(fù)3 次，培養(yǎng)條件為24 ℃/14 h，夜間20 ℃/10 h，相對(duì)濕度為60%～70%，處理10天后，剪取真葉，分裝于錫箔紙袋中，用液氮速凍后置于超低溫冰箱保存，用于后續(xù)理化指標(biāo)測(cè)定．

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

（1）發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的測(cè)定．發(fā)芽勢(shì)：絳三葉種子萌發(fā)第4 d測(cè)定，以露出種皮的胚根長(zhǎng)度達(dá)到種子自身長(zhǎng)度為發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)，以百分比表示，即發(fā)芽勢(shì)（%） = 4 d發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%．

發(fā)芽率：絳三葉種子萌發(fā)10 d后測(cè)定，以突出種皮的胚根長(zhǎng)度達(dá)到種子自身長(zhǎng)度為發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)，以百分比表示，即發(fā)芽率（%） = 10 d 發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%．

（2）主根、芽、側(cè)根及生物量指標(biāo)測(cè)定．每個(gè)試驗(yàn)處理組隨機(jī)抽取10 株幼苗，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量其主根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)量，最后取平均值．從每個(gè)試驗(yàn)處理組中隨機(jī)抽取20 株幼苗，在分析天平上稱(chēng)重，取其平均值得到每株幼苗的鮮重；再在105 ℃下殺青15 min，恒溫烘箱中75 ℃條件下烘干1 h；最后稱(chēng)重，取平均值得到每株幼苗干重．

（3）生理指標(biāo)測(cè)定．葉綠素定量測(cè)定采用乙醇提取比色法；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 方法[11]；膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[11]；羥自由基含量測(cè)定采用Halliwell 的方法[12]；過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)活性測(cè)定參考Beers和Sizer的方法[13]；抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定參考Nakano and Asada 的方法[14]；愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶（GPX）活性測(cè)定參考Mrbanek的方法[15]．

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010 軟件與Origin 2018 軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁脅迫對(duì)絳三葉種子萌發(fā)生長(zhǎng)狀況影響

由表1 可知，隨鋁離子濃度的增加，絳三葉種子萌發(fā)逐步受到抑制，Al3+濃度升高到2000 μmol/L時(shí)，絳三葉種子的發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照無(wú)差異，但發(fā)芽率比對(duì)照降低4.0%，根芽長(zhǎng)、鮮重和干重分別降低2.942 cm、0.694 g和0.013 g，表明絳三葉受到鋁毒害，因此后期試驗(yàn)選取其為鋁脅迫處理濃度FA．當(dāng)Al3+濃度為3500～5000 μmol/L 時(shí)，絳三葉發(fā)芽速度明顯緩慢，發(fā)芽率顯著下降；5000 μmol/L 處理下，發(fā)芽率比對(duì)照降低40%．

表1 不同濃度酸鋁脅迫下絳三葉生長(zhǎng)狀況的影響Tab.1 Effects of different concentrations of aluminum stress on the growth of T. incarnatum

2.2 外源NO對(duì)酸鋁脅迫下絳三葉種子萌發(fā)的影響

由表2可知，在2 000 μmol/L Al3+脅迫下絳三葉種子萌發(fā)的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)明顯受到抑制，其幼苗干重、鮮重、根系以及胚芽長(zhǎng)與CK 相比明顯降低．而在2 000 μmol/L Al3+脅迫下添加外源NO后，絳三葉受鋁脅迫作用明顯緩解，外源添加100 μmol/L 與150 μmol/L SNP，絳三葉種子的發(fā)芽率與側(cè)根數(shù)量升高；從絳三葉幼苗根系及芽長(zhǎng)來(lái)看，鋁脅迫明顯抑制絳三葉種子萌發(fā)后的根系與芽的生長(zhǎng)，與對(duì)照（單一2 000 μmol/L Al3+脅迫）相比，添加100 μmol/L、150 μmol/L 和200 μmol/L 的SNP 提高了絳三葉種子萌發(fā)后的根芽的生長(zhǎng)指標(biāo)．從絳三葉幼苗干、鮮重分析，添加100 μmol/L SNP 提高了絳三葉幼苗的干重與鮮重．綜合來(lái)看，外源添加100 μmol/L SNP處理對(duì)鋁脅迫下絳三葉的促生效應(yīng)最明顯，后期試驗(yàn)采用此添加外源NO處理方式（FB）．

表2 SNP對(duì)鋁脅迫下絳三葉生長(zhǎng)狀況的影響Tab.2 Effect of SNP on growth condition of T. incarnatum under aluminum stress

2.3 外源NO對(duì)鋁脅迫下絳三葉幼苗理化特性的影響

（1）外源NO 對(duì)絳三葉幼苗葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素含量影響．由圖1 可知，單獨(dú)用100 μmol/L SNP處理的實(shí)驗(yàn)組，葉片的葉綠素a、b 和類(lèi)胡蘿卜素含量無(wú)明顯變化．2 000 μmol/L-1Al3+處理下與CK 相比絳三葉幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b 與類(lèi)胡蘿卜素的含量分別下降了15.8%、19.6%、18.8%．2 000 μmol/L Al3+處理下添加100 μmol/L SNP，與單一鋁脅迫處理相比，絳三葉幼苗葉片中葉綠素a 含量上升了13%；葉綠素b 的含量上升了6.5%；類(lèi)胡蘿卜素含量上升了7.7%．結(jié)果表明，在鋁脅迫下，絳三葉幼苗葉片中的葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素含量降低．在添加SNP 后絳三葉幼苗葉片中的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量有明顯升高，表明NO 對(duì)鋁脅迫造成的光合色素降解有一定的緩解效應(yīng)．

圖1 SNP對(duì)絳三葉幼苗色素含量的影響Fig.1 Effect of SNP on pigment content of T. incarnatum seedling under aluminum stress

（2）外源NO 對(duì)絳三葉幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響．單獨(dú)用100 μmol/L SNP 處理的實(shí)驗(yàn)組，葉片的可溶性蛋白含量與空白對(duì)照組CK 差異不大，2 000 μmol/L Al3+溶液處理使絳三葉幼苗葉片中可溶性蛋白含量上升了27.6%，在此條件下添加100 μmol/L 的SNP 溶液后，與單一用Al3+處理的絳三葉相比，葉片中可溶性蛋白含量下降了15.8% （圖2）．

圖2 SNP對(duì)絳三葉幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of SNP on soluble protein content of T. incarnatum seedling under aluminum stress

（3）外源NO 對(duì)絳三葉幼苗葉片羥自由基含量的影響．用100 μmol/L SNP 處理的葉片中羥自由基含量與CK 相比差別不明顯，在鋁脅迫下絳三葉幼苗葉片中羥自由基與CK 相比增加了103.5%，在添加100 μM SNP 后絳三葉幼苗葉片內(nèi)羥自由基含量下降了31%（圖3）．這表明鋁脅迫會(huì)使絳三葉幼苗葉片中羥自由基大量累積，外源添加NO 能緩解鋁脅迫對(duì)絳三葉造成的毒害．

圖3 SNP對(duì)絳三葉葉片羥自由基含量的影響Fig.3 Effect of SNP on Hydroxyl radical content of Crimson T. incarnatum under aluminum stress

（4）外源NO 對(duì)絳三葉幼苗葉片抗氧化酶活性的影響．由圖4 可知，單獨(dú)用100μmol/L SNP 處理的實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組CK 相比，葉片中CAT 活性降低不明顯，GPX 和APX 活性分別上升了6.9%和13.7%．與CK 相比在鋁脅迫下絳三葉幼苗中GPX活性上升了18.3%，CAT 和APX 活性分別下降了24.7%、51.4%；在添加SNP 溶液處理后，絳三葉幼苗葉片中，CAT、GPX、APX 分別升高了60.4%、60.5%、166.2%．結(jié)果表明，鋁脅迫能引起絳三葉氧化反應(yīng)和酶系統(tǒng)活性改變，而外源NO 對(duì)鋁脅迫下絳三葉幼苗的抗氧化系統(tǒng)有一定的激活作用，能增加絳三葉抗氧化酶活性，緩解氧化脅迫對(duì)植物造成的傷害．

圖4 SNP對(duì)絳三葉幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of SNP on activities of APX、GPX and CAT in T. incarnatum leaf under aluminum stress

（5）外源NO 對(duì)絳三葉幼苗葉片膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物（MDA）含量的影響．由圖5 可知，單獨(dú)用100 μmol/L SNP 處理的實(shí)驗(yàn)組，葉片MDA 含量比CK降低16.2%．鋁脅迫下絳三葉植株葉片MDA 含量則比CK 增加17.8%．與單一鋁脅迫處理相比，添加100 μmol/L SNP，降三葉幼苗中膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物含量下降了12.1%．這表明鋁脅迫會(huì)致使絳三葉片膜脂過(guò)氧化程度加深，而外源添加SNP 能緩解鋁對(duì)植物造成的毒害．

圖5 SNP對(duì)絳三葉葉片MDA含量的影響Fig.5 Effect of SNP on MDA content of T. incarnatum leaf under aluminum stress

3 討論

南方地區(qū)酸性土壤中富含大量的活性鋁離子[16]，抑制作物生長(zhǎng)發(fā)育，影響作物品質(zhì)及產(chǎn)量，對(duì)作物產(chǎn)生嚴(yán)重毒害作用．在實(shí)際生產(chǎn)中，鋁毒對(duì)作物生產(chǎn)最初的影響是種子萌發(fā)，梅文君等[17]發(fā)現(xiàn)在酸脅迫下，楚雄南苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)等都隨著pH 值的降低而降低，在強(qiáng)酸性環(huán)境下，楚雄南苜蓿幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)等顯著低于其他處理；許光德等[18]發(fā)現(xiàn)鋁脅迫明顯對(duì)向日葵產(chǎn)生毒害作用，促使細(xì)胞膜脂過(guò)氧化加重，抑制了種子的萌發(fā)以及幼苗的生長(zhǎng)；張雅茹等[19]發(fā)現(xiàn)鋁脅迫使油菜幼苗的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，油菜的生物量降低．研究表明，添加適量的外源NO 可以有效提高植物種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)[20]；適當(dāng)濃度的外源NO 可以有效促進(jìn)蘿卜種子萌發(fā)，減弱鋁脅迫下對(duì)蘿卜幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬產(chǎn)生的副作用[21]；張漢林等[22]發(fā)現(xiàn)外源NO 能夠促進(jìn)鋁脅迫下黑麥草的生長(zhǎng)和生物量的積累．本研究中，較低濃度的鋁脅迫，對(duì)絳三葉種子萌發(fā)及生長(zhǎng)影響不大，表明其有一定程度的耐鋁能力，但高濃度鋁脅迫處理則明顯抑制了絳三葉種子萌發(fā)，且明顯降低了種子的發(fā)芽率和幼苗生物量積累，這與前人研究結(jié)果相一致[8,23-24]；在鋁脅迫下對(duì)降三葉外源添加100 mM SNP，其發(fā)芽率以及幼苗鮮、干重增加，說(shuō)明NO 可以緩解鋁毒對(duì)絳三葉種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制．

葉綠素參與植物光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，類(lèi)胡蘿卜素參與植物光能的吸收、傳遞，二者是反映植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)．光合作用為植物進(jìn)行碳同化、有機(jī)物積累、為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供能量的過(guò)程[25]．鋁離子會(huì)破壞植物的光合系統(tǒng)，降低葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的含量，抑制植物體的光合作用[26]．研究表明，鋁脅迫下西瓜葉片的葉綠素含量明顯降低，西瓜的生長(zhǎng)與產(chǎn)量受到較大的影響[8]．適量的外源NO 可增加植物體內(nèi)葉綠素的含量，從而增強(qiáng)植物的光合作用[27]．有研究表明，外源NO 處理可顯著增加黑麥草幼苗葉綠素a 的含量，提高葉綠素總含量[22]．本試驗(yàn)中，高鋁脅迫下（2 000 μmol/L）絳三葉葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素含量明顯降低，光合色素的降低會(huì)直接影響植物的光合能力，從而影響植物的生長(zhǎng)，降低作物的產(chǎn)量；添加一定外源NO 促進(jìn)了絳三葉葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素的合成，從而提高其光合作用能力，促進(jìn)其生長(zhǎng)，增加有機(jī)物的積累．該結(jié)果說(shuō)明外源NO 可以逆轉(zhuǎn)高鋁脅迫下絳三葉光合作用能力的降低，并緩解鋁對(duì)作物的毒害作用．

逆境脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基并積累，破壞活性氧自由基與抗氧化酶之間的代謝平衡，若活性氧不能及時(shí)被清除，則會(huì)引起細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，從而影響植物生理狀態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育，植物膜脂過(guò)氧化過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脅迫程度越高，其含量越高[23]．CAT、GPX、APX 等抗氧化酶能夠有效地清除活性氧[28]．NO 為調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)分子，其具有抗氧化作用，并能阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、保護(hù)植株免受超氧化損傷以及增強(qiáng)植物細(xì)胞中抗氧化酶活性，從而緩解金屬離子對(duì)植物造成的毒害作用[29]．研究表明，NO 可通過(guò)提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及抗氧化能力來(lái)增強(qiáng)植物的抗逆性，同時(shí)顯著降低MDA 含量，緩解逆境造成的損傷[30]．在鋁脅迫下蘿卜幼苗葉片中的CAT 和APX 活性顯著下降，根尖的O-2產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著上[21]．肖家昶[8]等發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下西瓜根系可溶性糖與脯氨酸含量顯著上升，可溶性蛋白的含量無(wú)顯著差異，CAT 等抗氧化酶活性顯著降低，MDA含量增加，添加外源NO 增加了鋁脅迫下西瓜根系中脯氨酸含量顯著積累，促進(jìn)西瓜根系抗氧化酶的合成，從而減少活性氧損傷，緩解鋁脅迫下生理?yè)p傷；鋁脅迫下外源添加NO 西瓜幼苗的CAT 等抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量提高，MDA 減少，從而減輕質(zhì)膜過(guò)氧化的損傷[23]．本試驗(yàn)中，鋁脅迫下絳三葉幼苗和可溶性蛋白含量升高，CAT、GPX、APX 活性明顯降低，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 明顯積累，該結(jié)果表明絳三葉受到嚴(yán)重鋁毒害；在添加100 mM SNP 后，絳三葉幼苗葉片中CAT、GPX 和APX抗氧化酶活性明顯提高，羥自由基含量和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 積累明顯降低，從而緩解鋁脅迫下絳三葉幼苗的生理?yè)p傷，該結(jié)果與前人研究一致[8,23,30]．但外源添加NO 后可溶性蛋白的含量降低，這可能是因降三葉幼苗是通過(guò)調(diào)節(jié)自身其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵抗逆境脅迫所致．

本研究表明，在2 000 μML 鋁脅迫下對(duì)絳三葉種子進(jìn)行添加100 μM NO 處理，其光合色素含量提高，抗氧化酶活性提高，膜脂過(guò)氧化程度降低，其生長(zhǎng)指標(biāo)變好，絳三葉能更好地生長(zhǎng)．結(jié)果表明，添加NO 提高了絳三葉對(duì)鋁脅迫的適應(yīng)能力，緩解了鋁脅迫對(duì)絳三葉的毒害作用．該結(jié)果能為進(jìn)一步理解鋁脅迫對(duì)豆科植物生長(zhǎng)抑制的作用機(jī)制及調(diào)控方法提供參考依據(jù)．