嚴(yán)寬，李翔宇，張建，王玉潔，劉思岑，Manzar Abbas，李俊強(qiáng)

（宜賓學(xué)院 農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000）

黑茶是我國六大基本茶類之一，加工原料一般較為粗老．其初加工主要有4 道工序，其中渥堆是最重要的一步．渥堆進(jìn)行的好壞直接決定了黑茶最終的品質(zhì)，在這一過程中，由于微生物的參與，它們?cè)谄渲羞M(jìn)行代謝活動(dòng)產(chǎn)生了很多特殊物質(zhì)，這些物質(zhì)造就了黑茶獨(dú)特的色、香、味[1]．因云南、湖南和四川等地的黑茶原料不同及生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的差異性，造成微生物群落在黑茶生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的特征風(fēng)味也有所不同．周紅杰[2]發(fā)現(xiàn)：黑茶渥堆有許多的微生物的參與，以黑曲霉最多，酵母次之．研究者發(fā)現(xiàn)在六堡茶的茶堆中存在著大量的細(xì)菌、酵母、霉菌；而雅安藏茶的渥堆中的真菌種群主要是黑曲霉、塔賓曲霉、總狀枝毛霉、炭黑曲霉、根霉等；在茯磚茶渥堆過程中普遍存在的微生物主要是假單胞菌和克雷伯氏菌[3-5]．茶葉的品質(zhì)受微生物的影響非常大，在發(fā)酵的不同的階段中將其中的微生物的配比調(diào)整為最適比例，將會(huì)極大地縮減發(fā)酵所需的時(shí)間．如果將黑茶的發(fā)酵過程的微生物種類、溫度和酸堿度加以控制和規(guī)范，可以使黑茶有穩(wěn)定的品質(zhì)[6]．另外，由于有害雜菌（如曲霉屬、青霉屬等[7]）對(duì)黑茶品質(zhì)造成影響，在黑茶的生產(chǎn)過程中不但要注意有益菌的生長代謝活動(dòng)，同時(shí)也要時(shí)刻關(guān)注有害菌的生長活動(dòng)，及時(shí)排除其對(duì)茶品質(zhì)的威脅．加強(qiáng)對(duì)黑茶發(fā)酵中的有益菌以及有害雜菌的研究，將對(duì)黑茶的生產(chǎn)、品質(zhì)的把控以及風(fēng)味的形成至關(guān)重要．

四川作為中國黑茶的主要產(chǎn)區(qū)，所生產(chǎn)的黑茶產(chǎn)品因其原料生長區(qū)域有著特殊的氣候條件，且在渥堆過程中的特殊環(huán)境條件和黑茶加工技術(shù)的差異，可能存在著與其它地區(qū)的黑茶完全不同的潛在微生物資源．目前對(duì)四川黑茶的研究主要針對(duì)其活性成分功能等的研究，鮮有對(duì)其渥堆發(fā)酵過程中有關(guān)微生物的報(bào)道．因此，本研究利用高通量測(cè)序研究黑茶渥堆過程的整個(gè)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性研究黑茶堆制過程中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，分析其中細(xì)菌的種類和作用機(jī)制，為改進(jìn)黑茶加工工藝和提高黑茶質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑茶樣品是由四川省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供夏秋季采摘的茶樹鮮葉．在發(fā)酵過程中，將茶樹的葉子徹底混合以確保均質(zhì)，并以適量的自來水噴灑以保持65%～75%（w/v）的固體含量和45～71°C的溫度．在發(fā)酵過程中重復(fù)三次并在以下時(shí)間間隔收集樣品：第0(YC)、8(W1)、16(W2)、24(W3)和32(W4)天．每天記錄每個(gè)發(fā)酵茶堆中心40 cm 深度的溫度情況．

1.2 DNA提取

將5 g 黑茶樣品在無菌條件下懸浮在50 mL Tween-NaCl 緩沖液[0.9% (w/v) NaCl、0.05% (v/v)Tween 20、2% (w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮]中，將勻漿在4 ℃的超聲儀中放置30 min．懸浮液過無菌紗布，4 ℃條件下，2000 r/min 離心2 min，去除顆粒物和上清液，在4 ℃ 12000 r/min 離心10 min，得到微生物沉淀．用E.Z.N.A.TM HP Plant DNA Kit（Omega Bio-Tek Inc., GA, USA）從沉淀物中提取微生物基因組DNA，用E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit進(jìn)一步純化DNA制劑以去除可能的PCR抑制劑．

1.3 PCR擴(kuò)增和克隆文庫的建立

利用引物338F 和806R（5'-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3' , 5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得細(xì)菌16S rRNA 基因的V3+V4 區(qū)域[8-9]．PCR 反應(yīng)條件為：95 °C 3 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min；10 °C 10 min．PCR 反應(yīng)體系為：加入5×PCR buffer (with Mg2+) 4 μL、2.5 mmol/L 的dNTP 2 μL、0.8 μL 的5 μmol/L P1 (338F)及0.8 μL 的5 μmol/L P2 (806R)，再加入0.4 μL 5 U/μL的Taq酶、2 μL DNA 模板和10 μL ddH2O．將PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再通過使用AxyPrep-DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠來回收PCR 產(chǎn)物，并用Tris_HCl 洗脫；再用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建和評(píng)估，再利用Ilumina Miseq PE300 測(cè)序．根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將reads 拼接(merge)成一條序列，同時(shí)對(duì)reads 的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，對(duì)序列方向進(jìn)行校正[10]．

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Uparse OTU 聚類軟件工具在97%的身份閾值下進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析，以識(shí)別具有代表性的操作分類單元序列(OTUs)[11]．采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)97%識(shí)別閾值下的OTU 進(jìn)行分類學(xué)分析．在界、門、綱、目、科、屬和種水平上創(chuàng)建每個(gè)樣本的群落組成和科學(xué)分類[12]．稀釋曲線是以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線，需從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并利用Mothur 做稀釋曲線分析，利用R 語言工具制作曲線圖[13]．使用Chao 1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)計(jì)算每個(gè)樣品的α-多樣性，以評(píng)估測(cè)序深度和覆蓋率，并比較不同微生物群落的豐度和多樣性[14]．統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，構(gòu)建韋恩(Venn)圖[15]；根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，對(duì)單個(gè)或多個(gè)樣本在各分類水平上進(jìn)行比對(duì)，并使用R 語言工具構(gòu)建群落結(jié)構(gòu)圖[16-17]．

采用標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的均值對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋，并采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析．在p＜0.05 顯著性水平下，采用Duncan 多重比較檢驗(yàn)檢測(cè)所有樣本均數(shù)之間的變異．所有相關(guān)和路徑系數(shù)分析均使用和Excel 2019進(jìn)行．

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

表1 為5 個(gè)組的測(cè)序統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)．YC-W4 五個(gè)時(shí)期的有效序列分別為62456 條、46909 條、40399條、43362 條、60400 條；檢測(cè)總堿基數(shù)分別為26118006 bp、19638346 bp、17285142 bp、18361869 bp、25535185 bp；序列平均長度分別為418.59 bp、420.24 bp、427.75 bp、423.51 bp和422.57 bp．

表1 5個(gè)組樣品的測(cè)序統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

稀釋曲線(Rarefaction curve)反映了樣品取樣的深度．從圖1 可知，這5 個(gè)組的曲線基本趨于平緩，說明取樣基本合理．四川黑茶內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的置信度較高，能比較真實(shí)地反映黑茶樣本的內(nèi)生細(xì)菌群落．

圖1 所有樣品的稀釋曲線

2.2 OTU聚類分析

對(duì)97%相似水平下的OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)一步繪制Venn圖（圖2），以直觀反映樣本在不同分類水平上的組成相似性和重疊情況．對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類總共得到2 948 個(gè)OTU，分為42 個(gè)門、98 個(gè)綱、247 個(gè)目、461 個(gè)科、1 052 個(gè)屬和1 888個(gè)種．各個(gè)時(shí)期的樣本OTU 分別為2 082、2 116、381、399 和580 個(gè)．其中，YC 與W1 階段共有的OTU 為1 211 個(gè)，YC 與W2 階段共有的OTU 為15個(gè)，YC 與W3 階段共有的OTU 為25 個(gè)，YC 與W4階段共有的OTU 為50 個(gè)．各個(gè)時(shí)期的樣本獨(dú)有的OTU 分別為360、399、70、94、151 個(gè)，分別占各自總數(shù)的17.3%、18.9%、18.4%、23.6%和26.0%．而5 個(gè)時(shí)期樣品共有的OTU 數(shù)量為103 個(gè)，占所有樣本OTU 總數(shù)的3.6%，說明在進(jìn)行渥堆發(fā)酵后，四川黑茶的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化．

圖2 OTU的Venn圖分析

圖3 屬水平下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)柱狀圖

2.3 Alpha多樣性分析

五個(gè)樣本測(cè)序深度均在0.9984 以上，能較好地代表不同渥堆發(fā)酵時(shí)期的黑茶樣本中細(xì)菌群落的真實(shí)情況(表2)；一般Shannon 指數(shù)越高，Simpson 指數(shù)越低，說明樣本中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)越高[18]．YC和W4 兩個(gè)時(shí)期的樣品細(xì)菌群落多樣性高，W1 和W2 時(shí)期的次之，W2 時(shí)期樣品的細(xì)菌群落多樣性最低．Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)反映了樣本細(xì)菌群落的豐富度．YC時(shí)期樣品的細(xì)菌群落豐富度最高，其次為W4 和W1 時(shí)期樣品，W2 和W3 時(shí)期樣品的細(xì)菌群落豐富度最低，這說明不同渥堆發(fā)酵時(shí)期四川黑茶樣品的細(xì)菌豐富度和多樣性有較大差異．

表2 四川黑茶真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)

2.4 不同時(shí)期黑茶渥堆細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在屬水平上注釋到明確分類地位的有18 個(gè)屬，其他相對(duì)豐度較低的合并為一類(others)，其中相對(duì)豐度較高的為假單胞菌、未分類腸桿菌(unclassified_f_Enterobacteriacea)、芽孢桿菌、考克氏菌屬（Kocuria）、青枯菌屬（Ralstonia）、乳酸桿菌、葡萄球菌、未分級(jí)葉綠體菌（norank_f_norank_o_Chloroplast）等．YC 時(shí)期，優(yōu)勢(shì)菌為未分類腸桿菌(26.38%)，相對(duì)豐度較高的為考克氏菌屬(15.72%)，未分級(jí)葉綠體菌(8.32%)，鏈霉菌(5.92%)、假單胞菌(5.02%)、芽孢桿菌(4.73%)、葡萄球菌(4.19%)等．W1時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌為未分類腸桿菌(26.38%),相對(duì)豐度較高的有未分級(jí)葉綠體菌(5.93%),假單胞菌(4.91%)、乳桿菌(3.18%)、雙歧桿菌(2.90%)、擬桿菌(2.10%)等．W2 時(shí)期中相對(duì)豐度最高的仍然是未分類腸桿菌(51.55%)，其次是假單胞菌(41.50%)，未分類細(xì)菌(unclassified_k_norank_d_Bacteria)(2.15%)，其他類細(xì)菌屬相對(duì)豐度均低于1%．W3 時(shí)期中假單胞菌(61.61%)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度較高的有未分類腸桿菌(8.98%),考克氏菌屬(6.86%)，未分類細(xì)菌(6.97%)等．W4 時(shí)期中的芽孢桿菌(33.20%)相對(duì)豐度最高，其次是考克氏菌屬(18.63%)，乳桿菌(13.74%)、葡萄球菌(7.92%),青枯菌屬(7.39%)等．可以發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬和未分類腸桿菌在YC、W1、W2 和W4 時(shí)期中均有較高的豐度，而W4 時(shí)期主要以芽孢桿菌、考克氏菌屬和葡萄球菌相對(duì)豐度較高(圖4)，這說明四川黑茶中細(xì)菌屬的豐度隨不同渥堆發(fā)酵時(shí)期的不同而存在明顯差異．

圖4 屬水平下的群落結(jié)構(gòu)熱圖

2.5 黑茶渥堆細(xì)菌群落組成對(duì)活性成分的影響

RDA 分析即冗余分析，是環(huán)境因子約束化的PCA 分析，將樣本和環(huán)境因子反映在同一個(gè)二維排序圖上，可以用來反映菌群與環(huán)境因子之間關(guān)系．從圖5 可以看出，在四川黑茶的4 個(gè)活性成分中，多糖（PO）與總黃酮(FL)呈正相關(guān)關(guān)系，而咖啡因(CA)與氨基酸(AA)均呈正相關(guān)關(guān)系．進(jìn)一步對(duì)黑茶活性成分、細(xì)菌分類單元和不同渥堆時(shí)期之間的相關(guān)性分析表明，咖啡因、氨基酸的有效形成主要在YC、W1、W2 時(shí)期，且與未分級(jí)葉綠體菌和未分類腸桿菌有不同程度的正相關(guān)；多糖和總黃酮的含量增加主要在W4 時(shí)期，其中芽孢桿菌、青枯菌屬、糖多孢菌與總黃酮的形成相關(guān)性較高，而考克氏菌屬與多糖的形成密切相關(guān)；假單胞菌是W3 時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌，但與以上四種黑茶的活性成分沒有相關(guān)關(guān)系，這表明渥堆細(xì)菌群落組成在一定程度上影響著四川黑茶活性成分的合成．

圖5 屬水平下的細(xì)菌RDA分析

3 討論

四川黑茶在渥堆過程中發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化，其渥堆周期的長短和風(fēng)味特征的形成主要取決于微生物群落結(jié)構(gòu)的組成及變化．傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且有很多微生物無法培養(yǎng)出來．本實(shí)驗(yàn)共得到高質(zhì)量細(xì)菌序列253 526條，平均長度為422.53 bp．聚類后總共得到2 948 個(gè)OTU，分為42 個(gè)門、98 個(gè)綱、247 個(gè)目、461 個(gè)科、1 052 個(gè)屬、1 888 個(gè)種．這些數(shù)據(jù)表明渥堆中的活性細(xì)菌來自與渥堆相關(guān)的環(huán)境中，并且在整個(gè)發(fā)酵過程中將環(huán)境細(xì)菌接種到了茶堆中．因此本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)探究了四川黑茶渥堆過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成及變化特征，有助于準(zhǔn)確反映微生物種群數(shù)量．

近年來，對(duì)于黑茶中微生物群落組成的研究主要集中于以冠突散囊菌等為主的真菌，而對(duì)于黑茶中細(xì)菌群落組成的研究較少．Liu[19]等發(fā)現(xiàn)黑茶中細(xì)菌種類較為豐富．在發(fā)花早期，由于冠突散囊菌的生長，細(xì)菌的生長受到一定抑制，而在發(fā)花后期細(xì)菌總數(shù)量呈上升趨勢(shì)，與冠突散囊菌保持共生關(guān)系．Zhao[20]等發(fā)現(xiàn)不同地域黑茶細(xì)菌群落多樣性存在一定的差異．本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)四川黑茶渥堆中細(xì)菌群落多樣性的研究，獲得了大量的細(xì)菌資源．結(jié)果表明，在屬的水平上，由YC 到W3時(shí)期的樣品中檢測(cè)到了2 個(gè)相對(duì)豐度較高的屬，分別是未分類腸桿菌屬和假單胞菌，其中未分類腸桿菌屬在W2 時(shí)期樣品中的相對(duì)豐度最高，達(dá)51.55%．腸桿菌屬在自然界中分布廣泛（例如在土壤、水、植物、昆蟲和動(dòng)物中），腸桿菌屬在黑茶渥堆發(fā)酵的前期占主導(dǎo)地位，且大多是無害的．黑茶中含有的假單胞菌、弧菌、葡萄球菌等通常被認(rèn)為屬于條件致病菌[21]，其中假單胞菌對(duì)人體有一定的壞處，如通過感染傷口進(jìn)入人體后，通過血液循環(huán)導(dǎo)致人類得菌血癥．在渥堆中產(chǎn)生或者某個(gè)時(shí)期生長比較旺盛的有害菌，他們?cè)陔S著渥堆的不斷進(jìn)行導(dǎo)致茶堆的環(huán)境發(fā)生變化，抑制其的生長，能夠在一定程度上保證茶葉品質(zhì)．假單胞菌在W3 時(shí)期樣品中的相對(duì)豐度最高，為61.61%．且在各個(gè)時(shí)期的黑茶樣品中均有較高豐度，為確定它們是否是病原體，其在黑茶中的作用和安全性還有待進(jìn)一步研究．

本研究發(fā)現(xiàn)W4 時(shí)期的細(xì)菌群落多樣性程度較高，是四川黑茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期．W3 時(shí)期的樣品中芽孢桿菌是優(yōu)勢(shì)菌，豐度達(dá)到33.20%．這可能是因?yàn)闇囟戎饾u降低，利于其生長．結(jié)果表明，在發(fā)酵的最后階段，溫度降低，細(xì)菌多樣性增加，細(xì)菌群落的組成可能與發(fā)酵溫度有關(guān)，這表明我們可以通過控制黑茶渥堆的溫度來控制微生物的分布．例如，通過在最后階段保持50℃，然后對(duì)茶磚進(jìn)行快速干燥，可以將芽孢桿菌的豐度保持在高水平．有趣的是，芽孢桿菌屬中有許多是益生菌，對(duì)動(dòng)物和人類的腸道環(huán)境，糞便頻率和特征以及皮膚特性均顯示出有益的作用[22]．其中凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus.coagulans)已作為一種食品成分進(jìn)行了安全性評(píng)估，并被歐洲食品安全局添加到其合格安全性推定(QPS)清單中,并獲得批準(zhǔn)美國食品藥品監(jiān)督管理局公認(rèn)的安全標(biāo)準(zhǔn)(GRAS)．由于凝結(jié)芽孢桿菌是黑茶發(fā)酵過程中的主要細(xì)菌，又是一種安全的益生菌，可以用以改善某些食品的風(fēng)味和保質(zhì)期．

本研究發(fā)現(xiàn)四川黑茶中部分活性成分如多糖、黃酮、咖啡因、氨基酸的含量和一些細(xì)菌屬豐度的相關(guān)性較高．在渥堆的YC、W1、W2 階段氨基酸和咖啡因的含量大大增加，未分類腸桿菌和未分級(jí)葉綠體菌是這一時(shí)期主要菌種，它們與氨基酸和咖啡因的形成有關(guān)，W3 階段假單胞菌是其中的優(yōu)勢(shì)菌，在W4 階段多糖和總黃酮的含量增加，其中總黃酮與芽孢桿菌、青枯菌屬、糖多孢菌的形成相關(guān)性較高，而多糖與考克氏菌屬的形成密切相關(guān)．有研究表明，黑茶的活性成分的產(chǎn)生與細(xì)菌的代謝有著密不可分的關(guān)系，渥堆過程中多糖、總黃酮、氨基酸等活性成分存在一定程度的下降，這是由于微生物代謝的結(jié)果，普洱茶中也存在類似的現(xiàn)象[23]．微生物代謝所分泌的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等對(duì)主要代謝產(chǎn)物具有催化作用[24]．在后續(xù)的研究中還需要進(jìn)一步探究黑茶的活性成分以及微生物的多樣性，明確微生物在渥堆過程中的代謝機(jī)制，為日后對(duì)渥堆不同階段的調(diào)控提供依據(jù)，最終提升黑茶生產(chǎn)工藝和品質(zhì)．

4 結(jié)語

四川黑茶因其獨(dú)特的香氣而在經(jīng)濟(jì)上占有重要地位．微生物在其獨(dú)特的香氣、營養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)的發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用．對(duì)渥堆階段特定細(xì)菌組成的深入了解將為精確接種益生菌以進(jìn)行生物強(qiáng)化提供標(biāo)準(zhǔn)．細(xì)菌16S rRNA 基因的高通量測(cè)序顯示，未分類腸桿菌的某些成員在YC、W1和W2早期渥堆階段占優(yōu)勢(shì)；假單胞菌在W3 階段占優(yōu)勢(shì)；最高的細(xì)菌多樣性在W4 階段．我們觀察到益生菌菌屬，如芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和糖多孢菌屬在W4 的最后渥堆階段大量存在．總之，在黑茶中有效接種這些細(xì)菌屬的成員可能會(huì)提高其營養(yǎng)價(jià)值．