于玉鳳,何振瑞,喬紹俊,范秀玲,王 珊,王 建

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV),是一種蚊媒傳播的、有包膜、單股正鏈的RNA病毒,與登革病毒(Dengue virus,DENV)、黃病毒(Yellow virus,YFV)、西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV))等同屬于黃病毒科黃病毒屬病毒。1947年,科學家首次在寨卡森林恒河猴體內分離得到[1]。2007年以前,ZIKV只零星感染人類,而從2007年開始,出現ZIKV暴發(fā)感染。截止2017年3月份,全球約80多個國家或部落報道了ZIKV的蚊媒傳播感染[1]。ZIKV基因組只有一個開放閱讀框,其編碼區(qū)的長度約為10.8 kb,依次編碼3種結構蛋白(衣殼蛋白,capsid protein,C;膜蛋白及其前體membrane protein and its precursor membrane,M/PrM;包膜蛋白,envelope protein,E蛋白)和7 種非結構蛋白(nonstructural proteins,即NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[2]。遺傳進化分析顯示,ZIKV在1947年至2007年間通過病毒RNA的多次核苷酸改變快速進化,尤其是在“流行沉默期”,最終進化為ZIKV的兩大譜系:非洲系以及亞洲系(包括美洲系)[3]。

ZIKV感染人類,通常情況下只引起低熱、斑丘疹、關節(jié)疼痛、結膜炎等癥狀,但其感染孕婦,會導致胎兒腦部先天性發(fā)育畸形,產生小頭癥[4-6],WHO將ZIKV列為國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。Sutarjono B從146篇研究ZIKV感染人腦類器官的文獻中篩選出13篇進行分析,發(fā)現非洲系和亞洲系的ZIKV均增強細胞的凋亡,引起人腦類器官體積變小[7]。Cugola等報道由亞洲系ZIKV引起的細胞凋亡率高于非洲系ZIKV[8],而Gabriel E等研究發(fā)現非洲系ZIKV比亞洲系ZIKV更易誘導細胞的凋亡[9]。但只有來自巴西、波多黎各和法屬波利尼西亞屬于亞洲系的ZIKV被證實可引起人類胎兒小頭癥[10]。不同譜系間ZIKV核酸的相似性約為88.8%,氨基酸的相似性約為97%[11],其中的差異可能對ZIKV的毒力有較大影響。此外,1947年至2007年,60年的進化可能提升了病毒對神經細胞的感染性和對外界環(huán)境的穩(wěn)定耐受性,使其更易感染人類,并快速傳播,但目前缺乏相關的研究。

本研究將選擇ZIKV亞洲系SZ01和非洲系MR766病毒株,通過比較分析其在不同溫度對神經膠質細胞的感染性及自身增殖能力、游離狀態(tài)對高溫和反復凍融的耐受性,比較兩株病毒的感染性和穩(wěn)定性差異,最終為不同譜系致病性差異提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒 BHK21、Vero、U251、T98G細胞使用DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清、氨芐青霉素和鏈霉素)在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),待其在T75培養(yǎng)瓶中長成單層,使用EDTA-胰酶消化后用于后續(xù)實驗。U87細胞使用MEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清、氨芐青霉素和鏈霉素)在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),待其在T75培養(yǎng)瓶中長滿即可用于后續(xù)實驗。Vero、BHK21細胞由復旦大學姜世勃教授課題組饋贈;U87、T98G、U251細胞購買自上海中喬新舟生物科技有限公司。SZ01 (GenBank號: KU866423),2016年在由薩摩亞返回深圳的病人身上分離獲得[12];MR766 (#VR1838) 購買自ATCC,1947年由烏干達恒河猴體內分離獲得[13]。

1.2 病毒培養(yǎng) 待Vero細胞長成單層后,吸掉細胞培養(yǎng)液,將ZIKV接種于細胞培養(yǎng)瓶中,每瓶T75 200 μL病毒/10 mL病毒稀釋液(DMEM培養(yǎng)基),在37 ℃、5% CO2條件下吸附1.5 h,隨后吸棄病毒稀釋液,加入20 mL病毒維持液(含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基),每日觀察細胞,約感染5 d左右,細胞出現明顯病變,收取上清進行病毒空斑實驗以測定病毒滴度。

1.3 CCK8實驗 首先將生長狀態(tài)良好的U251、U87或T98G細胞鋪96孔板,每孔1×104個,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后使用含2%FBS的DMEM或MEM培養(yǎng)基稀釋MR766及SZ01,使其最終的感染濃度為1、0.1、0.01 MOI。隨后吸棄細胞培養(yǎng)上清,每孔加入上述稀釋后的病毒液100 μL,每個濃度設置6個復孔。每塊96孔板設置無病毒感染組,即含細胞但無病毒,每孔加入2%FBS的DMEM或MEM培養(yǎng)基100 μL;同時,每塊96孔板設置空白組,即無細胞無病毒,用于后續(xù)細胞成活率計算。待病毒與細胞孵育1.5 h后,將病毒液吸棄,每孔加入2%FBS的DMEM或MEM培養(yǎng)基100 μL。將500 μL CCK8溶液加入10 mL無血清DMEM或MEM培養(yǎng)基中顛倒混勻。統(tǒng)一于感染48 h、72 h后,小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基,將CCK8反應液加入96孔板中,每孔100 μL。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h后,使用酶標儀測定各孔的OD450吸光度值。計算不同滴度病毒對細胞毒性的影響,計算公式為:細胞成活率=(病毒孔-空白孔)×100%/(無病毒孔-空白孔)。

1.4 病毒空斑實驗 將生長狀態(tài)良好的BHK21細胞鋪12孔板,每孔2×105個,約16～24 h后在鏡下觀察,若無細胞生長空隙,則開始病毒滴度的測定。首先將病毒樣品進行倍比稀釋,每個稀釋度設置3個復孔,每孔加入0.5 mL含病毒的稀釋液。待病毒與細胞吸附2 h 后,將病毒上清液吸棄,加入已預熱的含有1%低熔點瓊脂糖和2% FBS的DMEM 培養(yǎng)基1 mL。待瓊脂糖凝固后,倒置放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d左右,在燈光下看到細胞噬斑時,加入含有1% 結晶紫的4%多聚甲醛固定細胞過夜。隨后每孔加入適量自來水浸泡約15 min,棄去孔中瓊脂糖,即可進行空斑計數。

1.5 ZIKV RNA拷貝數檢測 為檢測病毒上清中ZIKV RNA拷貝數,使用TIANamp病毒RNA抽提試劑盒(天根生物)抽提病毒RNA。隨后使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Takara Bio)和QuantStudio 5 PCR儀(ABI)檢測病毒拷貝數。引物序列如下:

ZIKV-E-F-Taq (5′-GGTCAGCGTCCTCTCT-AATAAACG-3′),

ZIKV-E-R-Taq (5′-GCACCCTAGTGTCCA-CTTTTTCC-3′),

探針(5′-6-FAM-AGCCATGACCGACACCACACCGT-BHQ1-3′)。

標準品為含ZIKV E蛋白的質粒。

1.6 病毒游離狀態(tài)在不同溫度下的穩(wěn)定性檢測 為檢測游離狀態(tài)的ZIKV在37 ℃和40 ℃下的穩(wěn)定性,首先分別將1 mL SZ01和MR766病毒液分別在37 ℃和40 ℃條件下放置0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h,放置時間結束后將病毒轉移-80 ℃待用。使用1.5中qRT-PCR法檢測殘留病毒基因組;使用1.4中病毒空斑實驗法檢測殘留病毒感染性顆粒。

1.7 病毒在不同溫度下感染性檢測 為檢測ZIKV在不同溫度下感染性,分別使用0.1 MOI 的SZ01、MR766感染細胞U87,使用0.5 MOI的SZ01、MR766分別感染細胞T98G,設置溫度為37 ℃和40 ℃,以模擬正常和發(fā)燒人體溫。在感染12 h、24 h、48 h、72 h、96 h后,收集病毒感染上清,通過1.4所述病毒空斑實驗檢測病毒的增殖情況;分別于48 h、72 h使用顯微鏡觀察細胞的病變情況。

1.8 病毒對反復凍融的耐受檢測 為檢測反復凍融對病毒感染性的影響,設置擴增后未解凍病毒為0次凍融。隨后取病毒液室溫放置30 min,待其完全解凍后設置為1次凍融,將其分裝為200 μL每管,分裝4管;將分裝后病毒液放置-80 ℃,2 h后,取3管,室溫放置30 min,設置為2次凍融;重復此操作,至獲得反復凍融4次的病毒液。隨后使用病毒空斑實驗檢測經過不同凍融次數后病毒液,設置0次凍融病毒液具有100%感染性。

1.9 統(tǒng)計學方法 本文主要比較單一時間點或單一因素處理后,SZ01組與MR766組之間是否存在統(tǒng)計學差異,因此選擇單因素分析統(tǒng)計方法。根據是否滿足方差齊性和正態(tài)性決定使用未配對兩尾t-test或非參數曼-惠特尼秩和檢驗(Mann-Whitney test)。數據使用 SPSS 13.0 軟件或GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計分析。*,P<0.05; **,P<0.01;***,P<0.001,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SZ01對星形神經膠質細胞的感染性強于MR766 為比較兩株病毒對神經膠質細胞感染性的差異,分別使用1、0.1、0.01MOI 的SZ01和MR766感染人星形神經膠質細胞U251、U87和人膠質母細胞瘤細胞T98G。隨后分別于感染48 h、72 h通過CCK8法檢測細胞活性。如圖1A 和1B所示,SZ01感染U251或U87 細胞后,其與MR766相比,顯著降低細胞的活性,SZ01導致的細胞活性降低較MR766更為快速、明顯。由圖1C可知,SZ01和MR766感染T98G細胞后,當病毒MOI為1時,SZ01比MR766可更顯著地降低細胞活性,但在MOI為0.1或0.01時則無此效果,甚至在72 h出現MR766更顯著降低細胞活性的現象,但整體上細胞活性維持在85%以上。綜上,SZ01對星形神經膠質細胞U87和U251的感染性強于MR766,在高感染滴度(MOI為1)時,SZ01對T98G細胞的感染性強于MR766。

注:A. CCK8法檢測兩株ZIKV感染星形膠質細胞U251結果(n=6);B.CCK8法檢測兩株ZIKV感染星形膠質細胞U87結果(n=6);C. CCK8法檢測兩株ZIKV感染人膠質母細胞瘤細胞T98G結果(n=6)。

2.2 游離SZ01對溫度耐受能力高于MR766 為分析游離ZIKV在37 ℃及40 ℃的熱穩(wěn)定性,分別將SZ01和MR766在37 ℃及40 ℃孵育0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h,隨后收集病毒,使用qRT-PCR和病毒空斑實驗分別檢測殘留病毒基因組和殘留病毒感染性。結果如圖2所示,在37 ℃及40 ℃孵育6 h或12 h后,病毒殘留基因組處于較高值,但病毒的殘留感染性卻快速下降。在37 ℃孵育6 h及12 h后,MR766病毒的殘留基因組和感染性均顯著低于SZ01(圖2A和圖2C)。在40 ℃孵育2 h 后,MR766的殘留基因組和感染性均顯著低于SZ01(圖2B和圖2D)。綜上,ZIKV對40 ℃的耐受低于37 ℃;SZ01對40 ℃的耐受能力高于MR766。

注:A/B.qRT-PCR法檢測兩株ZIKV對37 ℃及40 V的耐受能力(n=3);C/D.病毒空斑實驗檢測兩株ZIKV對37 ℃及40 ℃的耐受能力(n=3)。

2.3 ZIKV可耐受40 ℃高溫在神經膠質細胞內增殖 由圖2可知,游離狀態(tài)下的ZIKV在40 ℃下孵育3 h后,病毒感染性明顯降低。那么,在40 ℃下,ZIKV能否感染神經膠質細胞并在其中增殖呢?為回答上述問題,我們使用SZ01、MR766分別在37 ℃和40 ℃下感染星形神經膠質細胞U87(0.1 MOI)和神經膠質母細胞瘤細胞T98G(0.5 MOI),隨后分別于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h收集病毒感染上清,通過病毒空斑實驗,檢測病毒的增殖情況;分別于48 h、72 h使用顯微鏡觀察細胞的病變情況。結果如圖3A和3B可知,SZ01在37 ℃和40 ℃下誘導的細胞病變均強于MR766,SZ01感染細胞組出現更多的變圓、懸浮細胞。兩株病毒在40 ℃溫度下的增殖均明顯低于37 ℃(圖3C和圖3D)。由圖3C可知,在U87細胞中,不同感染溫度下,SZ01的增殖速度均快于MR766,優(yōu)先到達感染峰值。由圖3D可知,在T98G細胞中,SZ01在37 ℃和40 ℃下的增殖速度也均快于MR766。此外,T98G細胞對溫度的耐受較弱,40 ℃下培養(yǎng)72 h后,各組細胞的形態(tài)均發(fā)生明顯變化。綜上,ZIKV可耐受40 ℃高溫在神經膠質細胞內增殖,且SZ01的增殖速度快于MR766。

注:A/B.顯微鏡觀察兩株ZIKV在不同溫度感染U87/T98G細胞介導的細胞病變(×200);C/D.病毒空斑實驗檢測兩株ZIKV在不同溫度感染U87/T98G細胞后病毒的增殖情況(n=3)。

2.4 SZ01對于病毒反復凍融的耐受性高于MR766 為分析SZ01與MR766對反復凍融耐受的差異性,我們分別對SZ01與MR766病毒株凍融1、2、3、4次,隨后通過病毒空斑實驗,檢測反復凍融對兩株病毒的影響。結果如圖4所示,隨著病毒凍融次數的增加,兩株病毒的感染性均出現了降低現象,其中MR766降低更為明顯。在凍融第3次、第4次時,MR766的殘留感染性顯著低于SZ01。綜上,SZ01對于病毒反復凍融的耐受性高于MR766。

圖4 SZ01對反復凍融的耐受性高于MR766(n=3))

3 討 論

本研究首先比較了兩個不同譜系ZIKV病毒株SZ01和MR766對神經膠質細胞U251、U87及膠質母細胞瘤細胞T98G的感染性。結果顯示,SZ01對兩株星形膠質細胞的感染性均強于MR766(圖1A和1B)。但是在T98G中,只有在高感染滴度(MOI為1)情況下,SZ01的感染性強于MR766,在本研究中的其他情況下,即使感染時間超72 h,T98G細胞依然維持85%以上活性(圖1C)。研究表明酪氨酸蛋白激酶受體AXL的表達量與ZIKV的感染呈正相關,而星形膠質細胞作為腦中樞神經系統(tǒng)含量最多的細胞大量表達AXL[14]。AXL是否為ZIKV的受體目前存在爭議[14-15],但較為明確的是AXL通過下調干擾素信號通路促進ZIKV感染[14]。U251與U87細胞AXL的表達水平高于T98G[14],這或許是ZIKV對T98G感染性低于U251與U87的原因。

由于ZIKV第一宿主蚊子特殊的免疫系統(tǒng),ZIKV可在蚊子體內持續(xù)性感染但不致病[16],符合蟲媒病毒特點。令人意外的是,ZIKV在其動物模型,如小鼠、豚鼠、豬、非人靈長類中均出現持續(xù)性感染[17-21]。ZIKV感染孕婦,可在出生胎兒體內檢測到ZIKV RNA[22]。ZIKV在胎盤和大腦中的持續(xù)感染或致嬰兒小頭畸形[23-25]。ZIKV可在男性生殖系統(tǒng)中持續(xù)存在長達6個月[26],導致睪丸和生育能力受損[27-28],在其他組織中也存在持續(xù)性感染。ZIKV在全血中持續(xù)存在長達73.5 d,在血細胞中持續(xù)存在長達95.4 d[29]。此外,ZIKV與其他黃病毒的不同之處,還在于其不僅可以通過蚊蟲叮咬傳播,還可以通過性傳播、母嬰傳播、輸血及血液制品傳播[30-31]。上述現象提示,ZIKV在人體37 ℃溫度處于感染細胞或游離狀態(tài)下均較為穩(wěn)定,甚至在人體處于發(fā)燒狀態(tài)(40 ℃)時仍具有存活能力。因此,在本研究中選擇37 ℃和40 ℃分別研究了ZIKV亞洲系SZ01與非洲系MR766在游離狀態(tài)(圖2)及感染細胞狀態(tài)(圖3)下的穩(wěn)定性。結果顯示,SZ01在37 ℃、40 ℃游離狀態(tài)時的穩(wěn)定性均高于MR766,在37 ℃下放置12 h后,SZ01殘留12.4%的感染性,而MR766為4.7%;在40 ℃下放置3 h后,SZ01仍殘留14.7%感染性,而MR766則僅剩余0.63%。病毒感染進入細胞的時間小于2 h,3 h足夠其進行下一輪細胞的感染。那么在40 ℃,ZIKV是否具有擴增能力呢?我們在U87和T98G神經膠質細胞(圖3)中觀察到,雖然病毒在40 ℃的感染性比37 ℃的感染性明顯下降,但其依然可感染細胞并進行擴增。此外,成熟的ZIKV病毒顆粒與DENV病毒顆粒類似,二十面體,球形,直徑約為50 nm,以180對M-E蛋白二聚體覆蓋于病毒表面,但是比DENV2/4表面蛋白排布更加緊密,上述原因或可解釋其為何能夠耐受40 ℃高溫,以及在極性環(huán)境如精液、尿液、唾液中存活[32-34]。

綜上,亞洲系SZ01對星形神經膠質細胞的感染性強于非洲系MR766。在游離狀態(tài)或感染細胞狀態(tài),亞洲系SZ01對40 ℃高溫的耐受能力均高于非洲系MR766。同時,亞洲系SZ01對于病毒反復凍融的耐受性高于非洲系MR766(圖4)。ZIKV暴發(fā)后,迅速在全球80多個國家或部落流行[35],造成小頭畸形嬰兒出生比例上升[36],或與亞洲系ZIKV經過長達60多年的進化,其感染性與穩(wěn)定性顯著提升有關。后期選擇亞洲系SZ01及非洲系MR766病毒株,通過比較分析其主要病毒蛋白及關鍵motif或氨基酸位點,闡明蛋白位點突變如何調控ZIKV感染性與穩(wěn)定性,以及ZIKV蛋白如何參與調控小頭癥基因表達,對于明確亞洲系ZIKV的致病機制具有重要作用。

利益沖突：無