佘婷婷，鐘晨輝，林 琪*，唐隆晨，宦忠艷，周文發(fā)

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.莆田市正洋水產(chǎn)發(fā)展有限公司，福建 莆田 351100)

鹽度是調(diào)控海藻生長(zhǎng)發(fā)育的重要生態(tài)因子之一，也決定著海藻的自然分布[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，河海交匯區(qū)鹽度變化對(duì)腸滸苔(Enteromorpha intestinalis)的分布和生長(zhǎng)速率產(chǎn)生了顯著影響[2]。高鹽脅迫下鼠尾藻(Sargassum thunbergii)的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)顯著降低，但轉(zhuǎn)移至正常鹽度海水中培養(yǎng)后又可迅速恢復(fù)至正常水平[3]。一定范圍內(nèi)鹽度的增加可以促進(jìn)條斑紫菜(Pyropiayezoensis)葉狀體的甘露醇積累[4]。低滲處理羊棲菜(Sargassum fusiforme)不會(huì)降低其光合生理指標(biāo)，且經(jīng)過短時(shí)淡水處理后不僅可以清除養(yǎng)殖網(wǎng)簾上的雜藻，還將增強(qiáng)羊棲菜的光合活性[5]。值得注意的是，一些潮間帶的產(chǎn)膠藻類時(shí)常經(jīng)歷陸源徑流的淡水匯入、退潮干出后的突發(fā)降雨及漲潮后的復(fù)水等鹽度變化過程，表現(xiàn)出了對(duì)短時(shí)低滲脅迫的適應(yīng)性。相關(guān)研究表明，壇紫菜(P.haitanensis)在鹽度5 的低滲脅迫下可以維持較高的K+水平，進(jìn)而維持較高的K+/Na+，保證了光合作用的正常進(jìn)行[6]。過低的鹽度也可維持細(xì)基江蘺繁枝變型(Gracilaria tenuistipitatavar.liui)的瓊膠合成[7]。在正常鹽度26 和低鹽16 的環(huán)境下栽培提克江蘺(G.tikvahiae)，二者的生長(zhǎng)速率也不存在差異[8]。其次，由于河水的注入，生長(zhǎng)在河口區(qū)的真江蘺(G.vermiculophylla)經(jīng)常遭遇低滲脅迫，雖然其最適生長(zhǎng)鹽度為15～30，但是在鹽度0.5 條件下仍可以存活數(shù)周[9-10]。

龍須菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是一種生長(zhǎng)在潮間帶的產(chǎn)膠紅藻，也是在我國南北方海區(qū)被廣泛栽培的一種重要的大型經(jīng)濟(jì)藻類。目前龍須菜的人工栽培主要依靠營養(yǎng)繁殖的方式來進(jìn)行。營養(yǎng)體繁殖雖然生長(zhǎng)快，栽培過程操作簡(jiǎn)單，但是我國南方夏季高溫期漫長(zhǎng)，適宜的藻體生長(zhǎng)期偏短，難以進(jìn)行龍須菜的周年化栽培。如何在有限的適養(yǎng)時(shí)間里，通過優(yōu)化苗種擴(kuò)繁方式，加快龍須菜的營養(yǎng)生長(zhǎng)，提高龍須菜產(chǎn)量具有重要的產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義。在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，利用淡水沖洗或短時(shí)間浸泡龍須菜可以加快藻體的生長(zhǎng)，縮短單茬養(yǎng)殖時(shí)間，提高經(jīng)濟(jì)效益[11]。然而這一操作過程中低滲脅迫處理對(duì)藻體的促生長(zhǎng)效應(yīng)和生理適應(yīng)策略仍不清楚。鑒于此，本研究以福建海區(qū)主要栽培的龍須菜新品種“魯龍1 號(hào)”(品種登記號(hào)：GS-04-001-2014)作為實(shí)驗(yàn)材料[12]，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，探究了龍須菜藻體切段在不同鹽度和不同處理時(shí)間下的出芽生長(zhǎng)和光合生理指標(biāo)的變化情況，以期篩選出最適的低滲處理方式，為建立龍須菜苗種的快速擴(kuò)繁技術(shù)提供新參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用龍須菜為“魯龍1 號(hào)”新品種，采自福建省莆田市南日島的人工栽培海域，在低溫避光條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將新鮮的龍須菜置于滅菌海水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗以清除表面附著雜藻，清理完畢后置于滅菌海水中培養(yǎng)2 周。培養(yǎng)條件：溫度 (22.0±0.5) °C，光照強(qiáng)度15 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，鹽度26.000，培養(yǎng)液為Provasoli’s Enriched Seawater (PES)[13]，每3 天更換1 次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

藻段制備 選擇完整、健康的龍須菜藻體，再次用滅菌海水清洗以去除附生雜藻。用消毒刀片切取藻體的主枝部分，且剔除側(cè)枝，切成長(zhǎng)度為1.5 cm 的藻段。

低滲培養(yǎng)液配置 以龍須菜養(yǎng)殖海區(qū)的海水鹽度26.000 作為正常鹽度，取用PES 培養(yǎng)基(對(duì)照，鹽度 26.000)加入無菌蒸餾水(鹽度0.000)，二者分別按3∶1、1∶1 和1∶3 的比例，將培養(yǎng)液鹽度稀釋至 19.500、13.000 和6.500。鹽度0.000的淡水為滅菌超純水。

脅迫設(shè)計(jì) 將預(yù)先制備的藻段按同等數(shù)量和重量[20 根，總重量(0.465±0.010) g]分別轉(zhuǎn)入含有150 mL PES 培養(yǎng)液的燒杯中，依次進(jìn)行低鹽脅迫(鹽度 0.000、6.500、13.000 和19.500)處理，處理時(shí)間分別設(shè)置為1、3、6、12 和20 h，脅迫結(jié)束后立即轉(zhuǎn)移至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)(鹽度26.000)。未進(jìn)行鹽度脅迫的實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照組(鹽度26.000)，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。后續(xù)培養(yǎng)期間的培養(yǎng)條件：溫度 (22±0.5) °C，光照強(qiáng)度30 μmol/(m2·s)，光照周期12 L︰12 D，每3 天更換1 次PES 培養(yǎng)液。

生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 低滲脅迫處理后恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)，每隔3 天測(cè)定1 次藻段的生長(zhǎng)指標(biāo)，包括總出芽數(shù)(TB)和鮮重(FW)，并記錄藻段的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)周期為28 d。測(cè)定龍須菜藻段在恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)過程中的生物量變化，以評(píng)估其生長(zhǎng)。相對(duì)生長(zhǎng)速率(RGR)的計(jì)算公式：

式中，W0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)藻段的鮮重(g)；Wt為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)藻段的鮮重(g)；t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

光系統(tǒng) PSⅡ最大光化學(xué)效率測(cè)定 分別測(cè)定了淡水(鹽度 0.000)脅迫1、3 和20 h 后恢復(fù)正常鹽度(鹽度 26.000)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(鹽度 26.000)的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，各組均隨機(jī)測(cè)量7 根藻段。利用超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMINI-PAM-Ⅱ(德國 WALZ 公司)測(cè)定藻段未脅迫前(OS)、脅迫結(jié)束時(shí)(ST)、恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d (R2)、恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d (R6)、恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)11 d (R11)、恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 d(R16)以及恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)21d(R21)時(shí)的Fv/Fm。

主要光合色素含量測(cè)定 分別對(duì)淡水(鹽度 0.000)脅迫3 和20 h 和對(duì)照組(鹽度 26.000)的藻段進(jìn)行取樣，測(cè)定ST、R2、R6 和R11 組藻段的光合色素含量。具體操作流程參考Sampath-Wiley 等[14]的方法。精確稱取0.1 g 藻段放入研缽中，在液氮下充分研磨至細(xì)粉狀。用1.5 mL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 6.8)分3 次沖洗細(xì)粉狀樣本，將沖洗液充分收集后裝入2.0 mL 聚丙烯離心管中，在4 °C 下，以11 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心30 min。離心結(jié)束，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，然后吸取1 mL 上清液稀釋3 倍，使用紫外分光光度計(jì)(UV-3200)分別測(cè)量在波長(zhǎng)564、618 和730 nm處的吸光度值，以PBS 作為空白組，剩余藻膽蛋白上清液置于4 °C 保存。另外，將離心沉淀物取出，加入5 mL DMF (N,N-二甲基甲酰胺)，在4 °C 下萃取24 h。萃取結(jié)束后6 000 r/min冷凍離心10 min，將含有葉綠素的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，使用分光光度計(jì)分別讀取625、647、664 和750 nm 處的吸光度值，且以DMF 作為參照。藻紅蛋白(PE)含量(mg/g)、葉綠素a(Chl.a) 含量(mg/g)計(jì)算公式：

式中，N為稀釋倍數(shù)，Ve為萃取液(DMF)的體積(5 mL)，I為比色皿的光徑(3.5 cm)，W為所取藻體的鮮重(g)。

細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 分別切取淡水(鹽度 0.000)脅迫3 和20 h 以及對(duì)照組(鹽度 26.000)藻段在ST 和R2 時(shí)藻段兩端處的薄片(1～2 mm3)。將切取的離體樣本取下，采用2.5%戊二醛(pH 7.5)冷固定，抽氣至樣本沉入2.5 mL EP 管底，室溫放置2 h 固定后置于4 °C 保存。再用PBS (pH 7.4)漂洗樣本3 次，每次15 min。之后用1%鋨酸(pH 7.4)在室溫下暗固定7 h，同樣用PBS (pH 7.4)漂洗3 次。再經(jīng)系列脫水、滲透包埋、聚合和超薄切片，最后用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色法進(jìn)行染色。在日立HT7800 型透射電鏡(TEM)下觀察，采集圖像并進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)分析 使用 Excel 2007 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 19.0 軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05 作為差異顯著性水平，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 最適低滲濃度與時(shí)間組合的選擇及其對(duì)龍須菜切段再生的影響

觀察了實(shí)驗(yàn)周期(28 d)內(nèi)龍須菜藻段的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，短于12 h 的低滲脅迫均可以促進(jìn)龍須菜切段在恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)后的出芽，藻段的出芽數(shù)增加明顯，總出芽數(shù)均高于對(duì)照組。其中，淡水(鹽度 0.000)脅迫3 和6 h 后藻段的出芽數(shù)最多。而淡水脅迫超過20 h，藻體恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)后第3 天開始發(fā)白、碎裂，全部消亡(圖1，圖版Ⅰ)。

圖1 龍須菜藻段經(jīng)不同低滲脅迫處理后恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)28 d 時(shí)的出芽數(shù)Fig.1 Number of regenerated buds of the algal fragments during 28 days of normal salinity culture after different treatments of hypo-osmotic stress in G. lemaneiformis

圖版Ⅰ 低滲脅迫后恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)28 d 的龍須菜藻段的形態(tài)1.對(duì)照組；2～5.淡水(鹽度 0.000)分別處理1、3、6 和12 h；6～10.鹽度 6.500 海水分別處理1、3、6、12 和20 h；11～15.鹽度 13.000 海水分別處理1、3、6、12 和20 h；16～20.鹽度 19.500 海水分別處理1、3、6、12 和20 h；21.藻段淡水脅迫20 h，藻體在4 d 內(nèi)全部死亡。Plate Ⅰ Morphology of 28 days old algal fragments cultured at normal salinity after different treatments with hypo-osmotic stress in G. lemaneiformis1.control group;2-5.freshwater (S 0.000) treatment for 1,3,6 and 12 h,respecitively;6-10.seawater (S 6.500) treatment for 1,3,6,12 and 20 h,respecitively;11-15.seawater (S 13.000) treatment for 1,3,6,12 and 20 h,respecitively;16-20.seawater (S 19.500) treatment for 1,3,6,12 and 20 h,respecitively;21.the algal fragments under freshwater for 20 h,all of them died within 4 days.

龍須菜藻段在低滲脅迫后恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)28 d 后，藻段FW 的增加情況存在差異(表1)。淡水脅迫時(shí)間小于6 h 的藻段增重較多，其對(duì)應(yīng)的RGR 較高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。培養(yǎng)28 d 時(shí)，淡水脅迫3 h的藻段FW增加最多，生長(zhǎng)速率最快，RGR 高達(dá)0.91%/d，較對(duì)照組提高了61.27% (圖2)。淡水脅迫時(shí)間超過12 h 的藻段FW 則出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，藻體顏色逐漸褪去、潰爛，最終消亡。淡水脅迫20 h 藻段受脅迫最嚴(yán)重，相對(duì)生長(zhǎng)速率為-8.62 %/d，藻段短時(shí)間內(nèi)全部死亡，僅剩有部分殘?jiān)?。表明小? h的低滲脅迫對(duì)恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)過程的龍須菜切段再生具有促進(jìn)作用，以淡水脅迫3 h 的效果最佳。

表1 龍須菜藻段低鹽脅迫后再恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)28 d 時(shí)的鮮重變化Tab.1 Changes of fresh weight in the fragments of G. lemaneiformis cultured at normal salinity after different treatments of hypo-osmotic stress g

圖2 龍須菜藻段淡水脅迫后再恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)28 d 內(nèi)的相對(duì)生長(zhǎng)率1～6.分別為淡水處理0、1、3、6、12 和20 h。不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05)。Fig.2 Relative growth rate of G. lemaneiformis fragments cultured in normal salinity medium for 28 days after treatment of hypo-osmotic stress with freshwater1-6.freshwater treatment time within 0,1,3,6,12 and 20 h,respectively.Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.2 淡水脅迫對(duì)龍須菜藻段Fv/Fm 的影響

比較了龍須菜藻段在耐受不同時(shí)間的淡水(鹽度 0.000)脅迫后恢復(fù)至正常鹽度(鹽度 26.000)培養(yǎng)過程中Fv/Fm的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，經(jīng)1 h和3 h 淡水脅迫，藻段Fv/Fm出現(xiàn)略微下降，但仍與對(duì)照組相接近，轉(zhuǎn)移至正常鹽度培養(yǎng)后能迅速恢復(fù)至對(duì)照組水平，甚至高于對(duì)照組(圖3-a)。這表明龍須菜可以適應(yīng)短時(shí)的極限低滲脅迫，短時(shí)低鹽脅迫對(duì)龍須菜的光合生理活性無明顯的負(fù)面影響。然而淡水脅迫20 h 時(shí)，藻段Fv/Fm值迅速下降至接近0，轉(zhuǎn)入正常鹽度培養(yǎng)后不能恢復(fù)生長(zhǎng)(圖3-b)，說明龍須菜藻段在長(zhǎng)時(shí)間的淡水脅迫下受到了不可逆的損傷。

圖3 淡水脅迫對(duì)龍須菜切段再生過程中Fv/Fm 的影響(a) 淡水脅迫1 和3 h 后的Fv/Fm 變化；(b)淡水脅迫20 h 后的Fv/Fm 變化。OS.未脅迫前，ST.脅迫結(jié)束時(shí)，R2、R6、R11、R16、R21 分別為藻段恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)2、6、11、16 和 21 d，下同。Fig.3 Effects of hypo-osmotic stress with freshwater on Fv/Fm during the regeneration of algal fragments in G. lemaneiformis(a) changes of Fv/Fm after treatments of hypo-osmotic freshwater stress within 1 h and 3 h,respectively;(b) changes of Fv/Fm after treatment of hypoosmotic freshwater stress within 20 h.OS.before hypo-osmotic stress;ST.after hypo-osmotic stress;R2,R6,R11,R16,R21.sampling at the fragments restored to culture at normal salinity for 2,6,11,16 and 21 days,respectively.The same below.

2.3 光合色素含量檢測(cè)

單因素方差分析顯示，與對(duì)照組相比較，經(jīng)淡水(鹽度 0.000)脅迫后恢復(fù)至正常鹽度(鹽度26.000)培養(yǎng)的龍須菜藻段在同一取樣時(shí)間點(diǎn)的PE 含量差異顯著(P<0.05)，Chl.a含量差異顯著(P<0.05) (圖4)。與對(duì)照組相比較，淡水處理后龍須菜體內(nèi)PE、Chl.a含量下降明顯(P<0.05)。然而恢復(fù)至正常鹽度海水培養(yǎng)后，經(jīng)淡水脅迫3 h的藻段的PE、Chl.a含量升高，且隨著恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間的增加而持續(xù)升高。藻段PE 含量在R6 組超過對(duì)照組水平，較對(duì)照組提高2.33%。Chl.a累積相對(duì)較慢，在R11 組才檢測(cè)到其含量超過對(duì)照組水平，超過對(duì)照組2.78%。然而，經(jīng)淡水脅迫20 h的藻段PE、Chl.a含量極速下降，且在第6 天取樣時(shí)藻體全部死亡，未能測(cè)定其含量。

圖4 3 和20 h 淡水脅迫后恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)的龍須菜切段的藻紅蛋白和葉綠素a 含量變化(a)葉綠素a 含量變化；(b)藻紅蛋白含量變化。不同小寫字母表示同一取樣時(shí)間點(diǎn)下不同時(shí)間處理組間差異顯著(P<0.05)。Fig.4 Changes of contents of phycoerythrin and chlorophyll a during the regeneration of algal fragments of G. lemaneiformis cultured at normal salinity after 3 h and 20 h treatments with hypo-osmotic freshwater stress(a) changes of contents of Chl. a;(b) changes of contents of phycoerythrin.Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

通過透射電鏡觀察，對(duì)照組(鹽度 26.000)龍須菜藻段的表皮層細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器排列整齊，清晰可見，呈現(xiàn)典型的紅藻內(nèi)部結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi)充滿豐富的色素體，色素體內(nèi)包含的類囊體片層結(jié)構(gòu)清晰，排列有序、間隔均勻，且少量的質(zhì)體小球嵌合在類囊體內(nèi)，一些紅藻淀粉顆粒和少量的脂質(zhì)體分布于胞漿內(nèi)(圖版Ⅱ-1,2)。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，層次分明(圖版Ⅱ-3)。

圖版Ⅱ 淡水脅迫3 和20 h 后及經(jīng)過脅迫后恢復(fù)正常鹽度培養(yǎng)的龍須菜藻段表皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)1～2.培養(yǎng)第1 天的對(duì)照組藻段表皮細(xì)胞，含有完整的細(xì)胞壁、少量的紅藻淀粉顆粒和質(zhì)體小球、零星的脂質(zhì)體、豐富的色素體；3.對(duì)照組藻段的細(xì)胞壁；4～5.淡水處理3 h 藻段細(xì)胞內(nèi)聚集著豐富的紅藻淀粉、質(zhì)體小球以及體積增大的脂質(zhì)體；6.龍須菜藻段淡水處理3 h 后再經(jīng)過2 d 的恢復(fù)培養(yǎng)，細(xì)胞含有的紅藻淀粉顆粒、質(zhì)體小球減少，脂質(zhì)體逐漸消失；7～8.淡水脅迫20 h 藻段細(xì)胞變形，細(xì)胞膜受損、胞內(nèi)細(xì)胞器排列混亂、有明顯的腫脹現(xiàn)象；9.對(duì)照組藻段培養(yǎng)至第3 天的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。cw.細(xì)胞壁，c.色素體，s.紅藻淀粉粒，p.質(zhì)體小球，ld.脂質(zhì)體，thy.類囊體，n.細(xì)胞核，nu.核仁。Plate Ⅱ Ultrastructure of epidermal cell of algal fragments in G. lemaneiformis after 3 and 20 h treatments with hypo-osmotic freshwater and during rehydration with normal salinity culture medium1-2.the epidermal cell of the first day cultured algal fragments in the control group contains complete cell walls,a small amount of floridean starch grains and plastoglobuli,sporadic lipid droplets and abundant chloroplasts;3.enlarged view of the cell wall of epidermal cell in the control group;4-5.abundant floridean starch grains,plastoglobuli and lipid droplets with increased volume are accumulated in the epidermal cells of algal fragments after freshwater stress for 3 h;6.the freshwater treatment of algal fragments for 3 h,and then it undergoes two days of normal culture,floridean starch grains and plastoglobuli are reduced and lipid droplets in cytosol gradually disappeared;7-8.after hypo-osmotic stress with freshwater for 20 hours,the epidermal cell is deformed,and its cell membrane is damaged,organelles are disordered and involve obvious swelling;9.the ultrastructures of algal fragments in the control group until being cultured for three days.cw.cell wall,c.chloroplast,s.floridean starch grains,p.plastoglobuli,ld.lipid droplets,thy.thylakoid,n.nuclei,nu.nucleolus.

與對(duì)照組相比，受淡水(鹽度 0.000)脅迫的龍須菜藻段兩端切口處的表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，主要涉及色素體、紅藻淀粉顆粒、質(zhì)體小球以及脂質(zhì)體等(圖版Ⅱ-4～5,7～8)。經(jīng)3 h 淡水脅迫后，藻段表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁仍然保持結(jié)構(gòu)完整，胞內(nèi)色素體結(jié)構(gòu)正常，但紅藻淀粉顆粒密度增加，質(zhì)體小球增多，脂質(zhì)體體積增大(圖版Ⅱ-4～5)。脅迫結(jié)束恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d，胞內(nèi)色素體內(nèi)嵌合的類囊體的片層結(jié)構(gòu)排列緊密，脂質(zhì)體逐漸消失，且色澤由暗淡變成透亮的紅藻淀粉顆粒和質(zhì)體小球數(shù)量略有減少，但仍較對(duì)照組多(圖版Ⅱ-6,9)。然而，淡水脅迫20 h 后，藻段表皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，呈現(xiàn)出細(xì)胞膜破損，紅藻淀粉粒破裂，色素體形態(tài)不規(guī)則，類囊體被破壞，質(zhì)體小球和脂質(zhì)體數(shù)量減少(圖版Ⅱ-7～8)。

3 討論

3.1 最佳脅迫時(shí)間與脅迫鹽度組合的確定

本研究中，經(jīng)淡水(鹽度 0.000)脅迫3 h 的藻段未出現(xiàn)死亡，轉(zhuǎn)移至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)28 d 后表現(xiàn)出較多的出芽數(shù)和鮮重增加，藻段再生效果明顯，這說明淡水3 h 脅迫是龍須菜藻段的最佳脅迫鹽度和時(shí)間組合。相關(guān)研究表明，自然條件下棲息在潮間帶區(qū)域的江蘺屬海藻由于潮水的漲落，藻體長(zhǎng)期經(jīng)歷著低潮失水與高潮復(fù)水的鹽度變化。在低潮時(shí)，干露地帶會(huì)遭受太陽暴曬，藻體周圍海水蒸發(fā)，鹽度升高，藻體受到高鹽脅迫。此時(shí)，若恰遇暴雨，藻體將受淡水沖刷，甚至?xí)耆菰诘?，藻體又需耐受低滲脅迫。高潮復(fù)水后，這些海藻又能在正常鹽度下迅速恢復(fù)生長(zhǎng)[9-10]。這暗示著潮間帶的海藻在一定時(shí)間范圍內(nèi)可能具有對(duì)低滲脅迫的適應(yīng)能力，且在這一時(shí)間內(nèi)鹽度改變并不會(huì)對(duì)這些藻類的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響，甚至有助于藻體的生長(zhǎng)發(fā)育[8-10]。但是淡水脅迫超過20 h 的龍須菜藻段則全部死亡，推測(cè)超長(zhǎng)時(shí)間的低滲脅迫則會(huì)破壞藻體的滲透勢(shì)平衡，進(jìn)而影響細(xì)胞的代謝反應(yīng)和光合生理，由此阻礙藻體的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。另外，由于本研究中使用的實(shí)驗(yàn)材料龍須菜主枝藻段在實(shí)驗(yàn)前已經(jīng)去除細(xì)小側(cè)芽，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)論不能代表藻體的整體情況。如果保留藻體側(cè)芽，推測(cè)藻段的耐受性將有所下降，最適淡水脅迫時(shí)間可能小于3 h，具體處理時(shí)間仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 短時(shí)淡水脅迫對(duì)龍須菜藻段切段再生過程中光合生理的影響

在植物中，光合作用不僅是將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的必要過程，且光合反應(yīng)中心還是一種環(huán)境傳感器，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)最先表現(xiàn)在光合性能上[16-17]。藻類光系統(tǒng)PSⅡ的最大光化學(xué)產(chǎn)量(Fv/Fm)是植物光合性能的敏感指標(biāo)，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)會(huì)顯著下降[18]。本研究中，雖然淡水(鹽度0.000)脅迫不超過3 h 的龍須菜藻段的Fv/Fm降低，但與對(duì)照組相差不大，轉(zhuǎn)移至正常鹽度培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d 內(nèi)就可以迅速恢復(fù)至對(duì)照組水平，這表明短時(shí)低滲脅迫對(duì)Fv/Fm的影響較小，藻體對(duì)低滲的耐受能力較強(qiáng)。在培養(yǎng)后期藻段的Fv/Fm甚至高于對(duì)照組，可能是前期的低滲脅迫并沒有對(duì)龍須菜藻段產(chǎn)生不可逆的損傷，藻段細(xì)胞為快速適應(yīng)低鹽環(huán)境而提高了細(xì)胞的代謝水平，光合性能增強(qiáng)。光合色素作為紅藻進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換光能，其光能傳遞途徑依次為藻膽蛋白→類胡蘿卜素→葉綠素。在光合作用過程中葉綠素a、類胡蘿卜素及藻膽蛋白都直接或間接參與光反應(yīng)，因此其含量和組成均會(huì)影響藻體的光合速率[19]。本研究中，龍須菜藻段經(jīng)3 h 淡水脅迫后，與光系統(tǒng) PSⅡ緊密相關(guān)的PE[20]含量下降，但恢復(fù)至正常鹽度培養(yǎng)后持續(xù)升高，最終高于對(duì)照組。這提示著龍須菜切段再生過程中藻段細(xì)胞一直保持較高的光子捕獲效率，且經(jīng)過短時(shí)淡水脅迫的龍須菜藻段較未作處理的藻段具有更高的光子捕獲效率。Chl.a與光系統(tǒng)PSⅠ緊密相關(guān)[20]，其含量在龍須菜切段再生過程中表現(xiàn)出與PE 相類似的變化趨勢(shì)，可能是淡水脅迫在短時(shí)間內(nèi)限制了藻段的光合效率，但是藻段被轉(zhuǎn)移至正常鹽度下培養(yǎng)后加速了Chl.a的合成，使藻體各項(xiàng)機(jī)能逐漸恢復(fù)正常。另外，色素蛋白合成量的增加在提高藻體光合反應(yīng)速率的同時(shí)也可能有助于清除胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，以減少細(xì)胞的損傷[21]。

相關(guān)研究表明，短時(shí)間的鹽度脅迫不會(huì)對(duì)大型海藻的光合作用產(chǎn)生不利影響。徐涵等[22]研究認(rèn)為，短期的高鹽脅迫會(huì)顯著影響脆江蘺(G.chouae)的各項(xiàng)光合生理指標(biāo)，但繼續(xù)經(jīng)過24 h 正常鹽度培養(yǎng)后基本可恢復(fù)至對(duì)照組水平。Gao 等[5]研究表明，短時(shí)低滲處理不會(huì)抑制羊棲菜的光合活性，經(jīng)過淡水處理的藻體的光合活性甚至獲得增強(qiáng)。Wang 等[6]研究表明，壇紫菜葉狀體能夠適應(yīng)鹽度5 的低鹽環(huán)境，且藻株的Fv/Fm無明顯變化，而經(jīng)淡水脅迫再復(fù)水后藻株的Fv/Fm隨脅迫時(shí)間顯著下降，葉片受到不可逆的功能損傷。類似的，本研究中淡水脅迫20 h 后龍須菜藻段的Fv/Fm迅速降低至0，PE、Chl.a含量明顯低于對(duì)照組，且在后期的恢復(fù)培養(yǎng)中不斷下降。推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間的淡水脅迫會(huì)對(duì)龍須菜藻段的光合電子傳遞產(chǎn)生影響，可能是長(zhǎng)時(shí)間的淡水脅迫破壞了藻體的光合色素合成途徑，光系統(tǒng)PSⅡ反應(yīng)中心受到不可逆的損傷，光合作用原初化學(xué)反應(yīng)被抑制[23]。

3.3 淡水脅迫復(fù)水前后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

生命體細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與功能是相適應(yīng)的。色素體是大型海藻進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，色素體被膜之內(nèi)存在著由膜層形成的類囊體，用于執(zhí)行光能的吸收與轉(zhuǎn)化[24]。本研究中，龍須菜表皮層細(xì)胞充滿色素體，推斷龍須菜具有較強(qiáng)的光合能力。紅藻淀粉顆粒是儲(chǔ)存光合產(chǎn)物碳水化合物的細(xì)胞器[25]，質(zhì)體小球具有儲(chǔ)存脂類物質(zhì)、類胡蘿卜素、維生素K1和E 的功能[26]，脂質(zhì)體則可提供質(zhì)體再生所需質(zhì)膜或?yàn)榇x活動(dòng)提供能量[27]。此外，藻類色素體內(nèi)嵌合的蛋白核發(fā)揮了光合功能和CO2濃縮機(jī)制(CCM)[28]。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，其根本原因是藻體為了適應(yīng)環(huán)境，以維持逆境下的生理平衡。鹽度脅迫主要是通過濃度差影響滲透勢(shì)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子失衡，從而對(duì)細(xì)胞器產(chǎn)生破壞[29]。本研究中，經(jīng)淡水3 h 脅迫的藻段細(xì)胞內(nèi)的紅藻淀粉顆粒密度顯著增加，質(zhì)體小球數(shù)量增多，脂質(zhì)體體積增大。這說明短時(shí)間淡水脅迫后龍須菜胞內(nèi)大量的紅藻淀粉顆粒、質(zhì)體小球等細(xì)胞器可能參與了應(yīng)對(duì)不利的脅迫環(huán)境[30]。且當(dāng)脅迫停止后轉(zhuǎn)移至正常鹽度培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)堆積的紅藻淀粉和質(zhì)體小球可為藻段的生長(zhǎng)發(fā)育提供豐富的能量物質(zhì)，體積增大的脂質(zhì)體可以作為切段再生過程中胞內(nèi)的質(zhì)體再生所需的中性脂，并維持質(zhì)體氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)[27,31]。因此短時(shí)淡水脅迫后的藻段再生較對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。短時(shí)淡水脅迫后轉(zhuǎn)移至正常鹽度培養(yǎng)2 d，胞內(nèi)的紅藻淀粉顆粒密度降低、質(zhì)體小球減少、脂質(zhì)體逐漸消失，這提示著能量物質(zhì)的分解或動(dòng)員有利于促進(jìn)龍須菜藻段的出芽生長(zhǎng)。而淡水脅迫20 h，藻段細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間過度吸水，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和膜完整性被破壞，細(xì)胞器遭受永久性損傷。這說明過度的低滲脅迫則會(huì)抑制藻類細(xì)胞的代謝反應(yīng)和光合生理，這與對(duì)提克江蘺和壇紫菜等的研究結(jié)果相似[6,8]。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）