朱力鳴 焦 昆 劉 偉 李勝利*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,北京 100069,2.北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,北京 100029)

在臨床治療中,因外傷、退行性病變、先天畸形、骨腫瘤、種植牙、牙周疾病、開顱手術(shù)等各種原因?qū)е碌墓侨睋p十分常見,尤其在骨科、口腔科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域的患者較為集中。在患者伴隨有疾病的情況下或骨缺損超過臨界尺寸時(shí),缺損部位很難通過自身的再生修復(fù),此時(shí)則需要外加治療性干預(yù)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年約400萬人需要進(jìn)行植骨治療[3]。

根據(jù)骨移植材料在體內(nèi)的骨形成特性,理想的植骨移植材料應(yīng)具有骨生成性、骨誘導(dǎo)性、骨引導(dǎo)性[4]。組織工程學(xué)和生物材料學(xué)被認(rèn)為是發(fā)展再生移植修復(fù)骨缺損的重要方式。單純的人工骨材料僅能作為骨引導(dǎo)的支架,缺乏誘導(dǎo)成骨能力,成骨速度慢,效果欠佳,需植入有骨誘導(dǎo)性或骨生成性的移植材料。組織工程學(xué)將生物材料、細(xì)胞以及生物活性分子結(jié)合起來,能夠恢復(fù)或改善受損或病變組織的生物功能[5]。在組織工程學(xué)中,為了提高細(xì)胞活力、附著、增殖和歸巢、成骨分化、血管生成、宿主整合和承重[6],學(xué)界研究了包括硫酸軟骨素在內(nèi)的大量的支架材料[7-9]。傳統(tǒng)的骨組織工程研究通過將種子細(xì)胞接種在支架材料上植入骨缺損處進(jìn)行修復(fù),但這種方式存在種子細(xì)胞凋亡、引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)等缺陷,這將削弱修復(fù)效果[10]。為解決此不足,有學(xué)者[11]提出“原位組織工程”的概念,構(gòu)建具有高成骨響應(yīng)的材料,通過身體的再生潛力加速誘導(dǎo)缺損部位的修復(fù)過程。人工骨替代材料也具有各自的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn),磷酸鈣陶瓷與骨有著相似的化學(xué)組成,但其溶解性影響破骨細(xì)胞的活性[12],高分子聚合物具有生物活性但機(jī)械強(qiáng)度低[13]。

自體骨移植被認(rèn)為是骨移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”,雖然優(yōu)勢(shì)突出,但其供骨部位的并發(fā)癥卻不容忽視。同種異體骨移植盡管也有疾病傳播和免疫排斥等并發(fā)癥[14-15]的潛在風(fēng)險(xiǎn),但隨著相關(guān)研究的深入,以及制作技術(shù)的改進(jìn)和提高,其作為異體移植材料的并發(fā)癥已顯著降低,目前已成為治療骨缺損的一個(gè)重要選擇,成為當(dāng)前骨移植材料的熱點(diǎn)研究方向。本文研究旨在探討新型同種異體骨材料修補(bǔ)骨缺損過程中對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量、血常規(guī)與生化指標(biāo)的影響,通過實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白對(duì)照組的比較,對(duì)使用該植入材料修補(bǔ)骨缺損的安全性進(jìn)行評(píng)估,為進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年普通級(jí)新西蘭兔,60只,體質(zhì)量2.2 kg以上,雄性,購(gòu)自北京富豪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0015],飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(京)2018-0003],實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制及飼養(yǎng)環(huán)境均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[16-17]。采用隨機(jī)數(shù)字分配法將60只動(dòng)物隨機(jī)分成3組,分別為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組,每組均20只動(dòng)物。對(duì)于上述3組動(dòng)物,分別在手術(shù)后的第1周、4周、8周和12周時(shí)取5只動(dòng)物,測(cè)體質(zhì)量、抽血檢測(cè)血常規(guī)及生理生化指標(biāo)。本文研究通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批號(hào):AEEI-2022-083)。

1.1.2 試劑與儀器

供試品:同種異體骨(批號(hào):TZG-S1-211124。型號(hào)規(guī)格:松質(zhì)骨小塊,DG-SZGXK,0.5 g;皮質(zhì)骨粒,DG-PZGL-3,0.5 g),由北京桀亞萊福生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供,干燥避光密閉保存,每次使用前用適量無菌0.9%氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)配制供試品,并在2～3 h內(nèi)使用完畢。對(duì)照品:市售同種骨植入材料。主要儀器:SANKYO-CA800全自動(dòng)全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,EOS-BRAVO-FORTE全自動(dòng)生化分析儀,Strong 204精密微型研磨機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備方法

將兔稱質(zhì)量后,進(jìn)行全身麻醉(麻醉劑:氯雷他定片0.03 mL/kg+異戊巴比妥鈉0.1 mL/kg),保定,取側(cè)臥位,備皮(半徑約3 cm),消毒,鋪無菌巾。避開皮下血管,逐層切開皮膚、皮下組織及筋膜,切口為2 cm,分離肌群,暴露股骨外側(cè)面。在股骨近心端之外緣、大轉(zhuǎn)子下緣1 cm處,用直徑4 mm球頭精密研磨機(jī)制備骨缺損,深度以不打穿髓腔、目視可見紅色骨髓為度(防止骨髓腔開放后暴露的髓內(nèi)干細(xì)胞自愈合能力的干擾)。此時(shí),骨缺損深度約為1 mm,骨缺損體積約為5.24 mm3。制造骨缺損時(shí)予以生理鹽水沖洗降溫。用同樣的方法處理對(duì)側(cè)股骨。在實(shí)驗(yàn)組(供試品)和對(duì)照組(對(duì)照品)動(dòng)物的左股骨缺損區(qū)填充皮質(zhì)骨粒,右股骨缺損區(qū)填充松質(zhì)骨小塊,輕壓填緊,盡量使材料與骨缺損密合。分層縫合?？瞻捉M動(dòng)物進(jìn)行上述同樣手術(shù),不填充任何材料。術(shù)后給予每只動(dòng)物肌肉注射青霉素鈉溶液80萬單位,連續(xù)3 d。

1.2.2 日常觀察

臨床觀察:動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后,每天對(duì)其外觀體征和行為活動(dòng)的情況進(jìn)行詳細(xì)的觀察,包括精神狀況、進(jìn)食、大小便及口、鼻、眼、耳異常分泌物和被毛等方面的變化進(jìn)行記錄。

體質(zhì)量測(cè)量:手術(shù)前、病理取材前各稱量一次并記錄。

與改款前相同的是，新一代C級(jí)車?yán)^續(xù)提供長(zhǎng)軸距轎車、長(zhǎng)軸距運(yùn)動(dòng)轎車以及標(biāo)準(zhǔn)軸距運(yùn)動(dòng)版三種車型，外觀風(fēng)格上的升級(jí)也讓三款車型的辨識(shí)度更高。新一代C級(jí)長(zhǎng)軸距轎車前杠上的進(jìn)氣格柵更加寬大，搭配經(jīng)典的“三線中網(wǎng)”和立標(biāo)后氣質(zhì)更顯莊重。新一代C級(jí)長(zhǎng)軸距運(yùn)動(dòng)轎車選擇了AMG風(fēng)格的外觀，采用星輝格柵、中網(wǎng)大標(biāo)和AMG車身套件。新一代C級(jí)標(biāo)準(zhǔn)軸距運(yùn)動(dòng)版則選擇了更簡(jiǎn)潔的“雙線中網(wǎng)”與大標(biāo)搭配，與發(fā)動(dòng)機(jī)蓋上的雙凸起棱線和AMG車身套件一起營(yíng)造出更運(yùn)動(dòng)的視覺效果。

1.2.3 血常規(guī)及生化指標(biāo)的檢測(cè)

術(shù)后第1周、4周、8周、12周對(duì)3組動(dòng)物經(jīng)后肢隱靜脈取血,抗凝處理后立即進(jìn)行血液檢測(cè)。從后肢隱靜脈取全血約2 mL,注入離心管中,室溫靜置1 h以上,然后離心提取血清用于血清生化指標(biāo)檢測(cè),分別用以評(píng)價(jià)供試品、對(duì)照品對(duì)肝功能、腎功能、血糖、血脂、蛋白代謝和身體酸堿平衡等重要生理指標(biāo)的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)方法為雙因素方差分析,采用LSD多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行組間兩兩比較,以確定不同時(shí)間點(diǎn)各組的試驗(yàn)結(jié)果差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 日常觀察

實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)、毛發(fā)光澤、精神狀態(tài)、飲食攝入、糞便感觀與對(duì)照組和空白對(duì)照組存活動(dòng)物比較無明顯差別。實(shí)驗(yàn)過程中,對(duì)照組和空白對(duì)照組動(dòng)物在術(shù)后2周時(shí)分別出現(xiàn)部分個(gè)體死亡。上述死亡動(dòng)物在術(shù)后逐步出現(xiàn)食欲下降,精神萎靡,被毛凌亂,糞便稀軟。經(jīng)病理剖檢,在上述死亡動(dòng)物腸道內(nèi)可見線蟲,身體和器官檢查未見肉眼可見之其他病理變化。鑒于空白對(duì)照組動(dòng)物也出現(xiàn)與對(duì)照組動(dòng)物類似癥狀及死亡現(xiàn)象,綜合考慮,分析其死亡原因可能是麻醉及手術(shù)刺激加大了對(duì)感染寄生蟲的實(shí)驗(yàn)樣本的影響(按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》[16]規(guī)定,普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔并不要求必須排除蠕蟲),導(dǎo)致動(dòng)物食欲減退,營(yíng)養(yǎng)不良,最終逐步衰竭死亡。

2.2 體質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)期內(nèi),術(shù)后一周,3組動(dòng)物體質(zhì)量均有輕度下降,下降幅度在0.2 kg到0.4 kg之間,基本上不超過體質(zhì)量的10%,這是動(dòng)物對(duì)手術(shù)的一種應(yīng)激反應(yīng)。一周之后,隨著傷口的愈合,手術(shù)對(duì)動(dòng)物的不利影響逐步減小,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量多數(shù)呈增加趨勢(shì)。但在各實(shí)驗(yàn)周期內(nèi),實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組之間體質(zhì)量變化比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)3組動(dòng)物體質(zhì)量變化Fig.1 Changes of body weight of the 3 groups at each time point

2.3 血常規(guī)

分析術(shù)后1周時(shí)血常規(guī)中各項(xiàng)指標(biāo),實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物中性粒細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組及空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果詳見表1。其他各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi),考慮為術(shù)后機(jī)體正常反應(yīng),無病理學(xué)意義。

表1 動(dòng)物血常規(guī)檢查結(jié)果Tab.1 Results of blood routine examination

4周、8周和12周得到的血常規(guī)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),且實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組和空白對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明植入供試品對(duì)動(dòng)物的血液系統(tǒng)、造血功能并無不良影響。

2.4 血清生化檢測(cè)結(jié)果

血清生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表2。本次實(shí)驗(yàn)過程中,實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)生化指標(biāo)基本正常。8周時(shí),實(shí)驗(yàn)組的葡萄糖檢測(cè)數(shù)據(jù)與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但檢測(cè)值均在正常范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)第12周檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較,葡萄糖及三酰甘油兩項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。原始檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示,空白對(duì)照組中有一個(gè)樣本的葡萄糖檢測(cè)數(shù)據(jù)(12.13 mmol/L)偏離參考范圍(4.17 mmol/L～9.5 mmol/L),導(dǎo)致該組數(shù)據(jù)平均值偏大(平均值為10.37±1.54);這也是兩組之間三酰甘油檢測(cè)值差異出現(xiàn)的原因。第12周時(shí),比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)值,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,二者之間在該指標(biāo)上差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。究其原因,在于對(duì)照品組中有兩個(gè)樣本的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)值(分別為124 U/L和133 U/L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于參考范圍(5 U/L～106 U/L)。其他各項(xiàng)指標(biāo),在三組動(dòng)物間兩兩比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 動(dòng)物血清生化檢查結(jié)果Tab.2 Results of serum biochemical examination

分析血清生化指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,供試品的植入可能對(duì)受體動(dòng)物的生物化學(xué)反應(yīng)及代謝產(chǎn)生一定影響,但這仍是機(jī)體的正常反應(yīng),在本文實(shí)驗(yàn)過程中植入供試品對(duì)動(dòng)物肝功能、腎功能、血糖、血脂、蛋白代謝和身體酸堿平衡等沒有產(chǎn)生不良影響。

3 討論

本試驗(yàn)以成年雄性新西蘭兔為實(shí)驗(yàn)材料,制作骨缺損疾病模型,填充皮質(zhì)骨?；蛩少|(zhì)骨小塊以探究骨修復(fù)效果。新西蘭兔作為一種封閉群動(dòng)物,其動(dòng)物個(gè)體之間具有豐富的遺傳異質(zhì)性,在開展人類遺傳研究、藥物篩選和毒性試驗(yàn)等方面起著不可替代的作用[18]。其免疫排斥性靈敏,是適合開展同種異體骨移植生物兼容性研究的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。血常規(guī)結(jié)果顯示,1周時(shí)血常規(guī)的各項(xiàng)指標(biāo),實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物除中性粒細(xì)胞稍高于參考值外,其他各項(xiàng)指標(biāo)均正常;4周、8周和12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血常規(guī)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。淋巴細(xì)胞與機(jī)體的免疫反應(yīng)及炎癥密切相關(guān),在細(xì)胞免疫及白細(xì)胞的趨化作用中發(fā)揮著重要作用。中性粒細(xì)胞在臨床診斷時(shí)被作為判斷急性炎癥的重要指標(biāo),多出現(xiàn)于急性炎癥、化膿性炎癥及炎癥早期的循環(huán)血液中[19]。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物炎性細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)與空白對(duì)照組和對(duì)照組兩兩比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析該系列指標(biāo)的波動(dòng)為術(shù)后機(jī)體正常反應(yīng),無病理學(xué)意義,表明該新型同種異體骨的低免疫誘導(dǎo)性具備一定的植入安全性。血清生化數(shù)據(jù)表明,實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)生化指標(biāo)基本正常,僅在4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組個(gè)別動(dòng)物樣本出現(xiàn)葡萄糖、膽固醇偏高,但這兩項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)值與空白對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),分析可能為個(gè)體差異所導(dǎo)致。另外,盡管4周時(shí)空白對(duì)照組中有一個(gè)樣本的肌酐和三酰甘油數(shù)據(jù)偏離參考范圍,致使空白對(duì)照組平均值偏離標(biāo)準(zhǔn)值較多,但實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較,二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12周時(shí)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)值,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但原始檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示,該項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)值均在正常范圍內(nèi)。

本文實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物造模時(shí)對(duì)局部骨膜造成一定破壞,可能在一定程度上影響局部血供及血管生成,而血管生成在加速骨折愈合中的作用已經(jīng)成為共識(shí)[20]。同時(shí),既往研究[21]認(rèn)為,骨損傷時(shí)可導(dǎo)致微循環(huán)障礙,而微循環(huán)障礙不僅與血管生成有關(guān),而且與脂質(zhì)代謝有關(guān),可能導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂[22]。根據(jù)本文實(shí)驗(yàn)生化檢查結(jié)果分析,供試品的植入可能對(duì)受體動(dòng)物的生物化學(xué)反應(yīng)及代謝產(chǎn)生一定影響,但這種變化并未導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)病理反應(yīng),可視為其機(jī)體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。

本文實(shí)驗(yàn)提示該新型骨修復(fù)材料具有一定的安全性和有效性,為后續(xù)臨床試驗(yàn)和應(yīng)用提供了一定的支持證據(jù)。既往研究[20]表明,松質(zhì)骨的孔隙度和性別具有相關(guān)性,本文實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均選用了雄性兔,可能對(duì)結(jié)果造成一定的影響。另外,本文實(shí)驗(yàn)所使用的材料在修復(fù)骨缺損過程中,是否會(huì)受到性激素的影響,有待于在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明朱力鳴:動(dòng)物模型制作,數(shù)據(jù)分析處理,論文撰寫;焦昆:動(dòng)物模型制作,數(shù)據(jù)質(zhì)量審核,論文審訂;劉偉:提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)驗(yàn)協(xié)調(diào);李勝利:總體把關(guān),論文審定。